Письмо Роспотребнадзора от 18.04.2006 N 0100/4463-06-32 // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ

ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ПИСЬМО

18 апреля 2006 г.

N 0100/4463-06-32

О МЕТОДИЧЕСКИХ РЕКОМЕНДАЦИЯХ

ПО ВЫДЕЛЕНИЮ ВИРУСОВ ГРИППА И ДИАГНОСТИКИ

ГРИППА И ОРВИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека направляет для использования в работе разработанные специалистами ГУ НИИ гриппа РАМН и ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН методические рекомендации "Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом" (от 18.04.06 N 0100/4434-06-34) и "Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация" (от 18.04.06 N 0100/4430-06-34).

Заместитель руководителя

Л.П.ГУЛЬЧЕНКО

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека

Г.Г.ОНИЩЕНКО

18.04.2006 г. N 0100/4434-06-34

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

БЫСТРАЯ ДИАГНОСТИКА ГРИППА И ДРУГИХ ОРВИ

ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

АННОТАЦИЯ

Иммунофлуоресцентный метод детекции вирусных антигенов является высоко чувствительным тестом быстрой дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций. Он рекомендуется для обследования больных на ранних (первые 3 дня) стадиях инфекции в целях своевременного назначения специфической противовирусной терапии и проведения соответствующих профилактических мероприятий и широко используется в системе лабораторного надзора за гриппом в России и других странах мира. Результативность метода зависит от качества исследуемых клинических образцов, соблюдения условий их доставки в лабораторию и последующего процессинга, а так же от качества используемой иммунореагентики.

Предназначен для вирусологов, микробиологов, эпидемиологов. Его применение позволяет поставить диагноз в течение 1-2 часов после получения клинических материалов с охватом широкого круга наиболее значимых возбудителей острых респираторных вирусных инфекций (вирусы гриппа A различных субтипов, гриппа B, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы, вирусы парагриппа 1-3 типов, коронавирусы и вирусы герпеса). Метод открывает возможности быстрого распознавания природы эпидемических вспышек и регистрации появления в циркуляции новых субтипов вируса гриппа A.

Методические рекомендации подготовлены специалистами ГУ НИИ гриппа РАМН - профессором, д.м.н. А.А. Сомининой, к.м.н. К.К.Милькинт, И.В.Амосовой, В.Г.Майоровой, Т.Р.Царевой, Е.В.Сорокиным.

1. ВВЕДЕНИЕ

Метод иммунофлуоресцентного анализа (МИФ) позволяет идентифицировать антигены вирусов гриппа и других возбудителей ОРВИ в инфицированных клетках непосредственно in situ по их характерной локализации, выявляемой в результате взаимодействия вирусных антигенов противовирусными антителами, маркированными флуоресцеинизотиоцианатом.

МИФ является высоко чувствительным и специфичным качественным иммунодиагностическим тестом. К числу преимуществ метода относится его исключительная простота и возможность быстрого (за 1-2 часа) анализа клинических материалов с распознаванием широкого круга возбудителей, включая вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, вирусы герпеса.

В последние годы МИФ получил широкое применение в практике здравоохранения (ФГУЗ "Центры гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации, инфекционные стационары, акушерско-гинекологические и офтальмологические отделения). Применение МИФ позволяет осуществить назначение специфической этиотропной терапии, отменить неэффективное при неосложненных формах ОРВИ использование антибиотиков, предотвратить распространение внутрибольничных инфекций за счет введения соответствующих превентивных мероприятий.

Этот метод наиболее эффективен в острой фазе (первые 3 дня) заболевания, когда внутриклеточное содержание вирусных антигенов бывает наиболее высоким. Его результативность существенно зависит также от соблюдения методических условий получения клинических материалов, сроков и температурных условий их доставки в лабораторию, качества используемых реагентов, а также компетентности специалистов, ответственных за интерпретацию результатов.

МИФ приобрел особую ценность при изучении заболеваний неизвестной этиологии и сыграл большую роль при идентификации новых агентов вирусной природы.

Использование метода в практике лабораторного надзора за гриппом и ОРВИ на территории России показало, что по результатам МФА можно четко распознавать этиологическую природу заболеваемости на отдельных территориях, что важно при определении начала активной циркуляции вирусов гриппа и природы эпидемии (до того как будут выделены первые вирусы). Метод незаменим в тех случаях, когда изоляция вирусов в практических вирусологических лабораториях не проводится.

2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

2.1. Формула метода.

Суть метода заключается в специфической индикации вирусных антигенов непосредственно в клинических материалах от больных ОРВИ с помощью специфических антител, меченных флуорохромом (например, флуоресцеин изотиоцианатом - ФИТЦ). Образующийся при этом комплекс антиген-антитело обнаруживается по характерному ярко зеленой флуоресценции в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа. Специфичность этого иммунологического метода сочетается с высокой чувствительностью люминесцентного анализа.

Предложены и в медицинской практике применяются несколько вариантов МИФ. При использовании прямого варианта материалы от больных окрашивают непосредственно противовирусными антителами, маркированными ФИТЦ. Этот метод получил наибольшее распространение в России.

Непрямой метод предполагает проведение анализа в две стадии, на первой из которых препараты обрабатывают немеченными противовирусными антителами, после чего сформированные комплексы антиген-антитело выявляют с помощью ФИТЦ-коньюгатов антивидовых антител.

За рубежом МИФ также широко используется для индикации вирусных антигенов в клеточных культурах, инфицированных материалами от больных, однако, при этом время проведения анализа удлиняется на 24-48 часов.

2.2. Показания и противопоказания к применению метода.

Широкое использование МИФ в клинико-эпидемиологической практике обусловлено необходимостью решения ряда важных задач здравоохранения, в том числе:

- в клинических условиях - для раннего назначения специфических средств этиотропной противовирусной терапии, прогнозирования тяжести развития заболевания в зависимости от его этиологии, исключения использования антибиотиков при не осложненных формах ОРВИ, а также для рационального размещения больных (по этиологическому принципу) в инфекционных отделениях больниц во избежание перекрестного внутрибольничного инфицирования.

- в эпидемиологической практике МИФ используют для быстрой расшифровки природы эпидемических вспышек в целях проведения соответствующих профилактических и лечебных мероприятий, в том числе в детских коллективах, в воинских подразделениях, а также для надзора за гриппом и ОРВИ в сети базовых вирусологических лабораторий Федерального центра по гриппу и ОРВИ.

- Показаниями к применению метода являются также рост заболеваемости ОРВИ на отдельных территориях, развитие внутрибольничных инфекций, регистрация вспышек гриппа среди птиц с незамедлительным обследованием контактных лиц из групп повышенного риска инфицирования в случае появления у них симптомов ОРВИ по всему спектру респираторных вирусов.

Противопоказания к использованию метода отсутствуют, за исключением случаев, когда забор материалов не может быть осуществлен по медицинским соображениям (склонность пациента к носовым кровотечениям, искривление носовых перегородок).

2.3. Материально-техническое обеспечение.

Для выполнения работ по быстрой диагностике ОРВИ необходимо иметь следующие материалы и оборудование.

Иммунореагенты.

Иммуноглобулины флуоресцирующие диагностические для детекции прямым МИФ антигенов вирусов гриппа типа A (всех субтипов в совокупности), а также для дифференцированного выявления субтипов вируса гриппа A(H1N1), A(H3N2), A(H5N1), вируса гриппа B, для детекции общих для семейства аденовирусов гексонных антигенов, выявления антигенов респираторно-синцитиального вируса и дифференцированного определения антигенов вирусов парагриппа 1, 2 и 3 типов (выпускаются в России ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов", Санкт Петербург, за рубежом - фирмой Dako, Дания). Наборы реагентов для непрямой детекции антигенов респираторных вирусов в клеточных культурах, инфицированных материалами от больных, выпускаются в настоящее время только за рубежом (например, Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA).

Материалы.

Сухие стерильные тампоны, пробирки, марлевые салфетки, пинцет, обезжиренные предметные и покровные стекла, лейкопластырь, кюветы для предметных стекол, микропипетки, стеклянный сосуд для фиксации мазков, мерные пипетки, фильтровальная бумага, влажная камера для окраски препаратов, сосуд для промывания, а также защитная одежда для персонала (халаты, маски, колпаки, резиновые перчатки, дезрастворы).

Растворы.

Фосфатно-солевой буферный раствор 0,01 моль/л, pH 7,2-7,4 (ФСБ), нефлуоресцирующее иммерсионное масло (диметилфталат), дистиллированная вода, ацетон безводный химически чистый, этиловый спирт.

Оборудование.

Люминесцентный микроскоп, ламинарный бокс, pH-метр, весы, лабораторная центрифуга (до 2000 об/мин.), термостат (+37 град. C), холодильник (+4 град. C) с замораживающей камерой (- 20 град. C), автоматическая пипетка с переменным объемом 5-50 мкл, наконечники для автоматических пипеток, пипетки мерные 10,0 мл, 5,0 мл и 1,0 мл.

2.4. Описание метода.

Использование МИФ для прямого обнаружения вирусных антигенов в материалах от больных.

Приготовление препаратов для иммунофлуоресцентной микроскопии.

В качестве материала для исследования служат препараты, содержащие цилиндрический эпителий слизистой оболочки носовой полости, в которых в первые три дня заболевания регулярно обнаруживается присутствие вируса, послужившего причиной респираторного заболевания. На более поздних сроках вирус элиминирует из клеток в секреты дыхательных путей, что снижает результативность МИФ диагностики.

Получение клинических материалов.

Важнейшим этапам исследования является получение полноценного материала, в котором содержалось бы достаточно много эпителиальных клеток, которые выстилают глубокие отделы нижних носовых ходов и служат местом репликации вирусов. Эти клетки имеют цилиндрическую, бокаловидную или округлую форму, иногда снабжены ресничками. Они должны иметь четкую структуру с ядром и окружающей его сравнительно небольшой по размеру цитоплазмой.

Необходимо отметить, что ближайшие ко входу отделы носовой полости выстланы плоским или переходным эпителием полигональной формы с мелким ядром и обширной цитоплазмой. Респираторные вирусы не размножаются в этих клетках. Вот почему при получении мазков необходимо вводить тампоны глубоко в нижние носовые ходы.

Процедура взятия мазков сводится к следующему. Если материал берется у маленьких детей, во избежание повреждения слизистой при резких движениях ребенка нужна помощь ассистента, который усаживает его к себе на колени, одной рукой прижимает руки ребенка, а другой рукой - голову. Детей старше 7 лет и взрослых больных усаживают в положение с приподнятым носом. При обильном слизистом или слизисто-серозном отделяемом необходимо очистить полость носа сухим ватным тампоном. При обильных гнойных выделениях проводят наиболее тщательную очистку носовых ходов, без чего материал для исследования забирать не следует, поскольку обилие детрита и неспецифически светящихся лейкоцитов не позволит провести ИФ анализ. Сухой тонкий тампон вводят в нижний носовой ход как можно глубже (взрослым и школьникам - на глубину до 3 см, детям более младшего возраста - на 1,5-2 см). Вращательным движением с небольшим прижатием тампона к стенкам носа снимают со слизистой эпителиальные клетки. Процедуру повторяют другим ватным тампоном со вторым носовым ходом.

При конъюнктивитах и кератоконьюнктивитах вирусной природы материалом для исследования служат мазки-соскобы с конъюнктивы, которые обрабатывают так же, как и мазки из носа, и исследуют клетки на присутствие аденовирусных и герпетических антигенов.

Транспортировка и хранение клинических материалов.

Тампоны со снятыми клетками немедленно погружают в пробирку с 2 мл 0.01 М ФСБ. Клинические материалы как можно быстрее (не более чем за 2 часа) доставляют в лабораторию в охлажденном состоянии (замораживание должно быть исключено).

Хранить пробирки с материалом более 2 ч. не рекомендуется, так как при этом происходит разрушение эпителиальных клеток и выход вируса в среду, что снижает результативность анализа. При необходимости приостановку работы можно сделать только после приготовления фиксированных мазков. Всю работу с инфекционным материалом проводят в ламинарном боксе с соблюдением соответствующих правил биобезопасности.

Приготовление мазков.

Для получения клеточной суспензии пробирки с тампонами интенсивно встряхивают, после чего тампоны наполовину извлекают, отжимают пинцетом о стенку пробирки и удаляют. Отработанные тампоны погружают в дезинфицирующий раствор. Полученную клеточную суспензию центрифугируют в течение 10 мин. при 1000 об/мин. (не более 500 g - во избежание травматизации клеток), после чего надосадочную жидкость удаляют. Осадок клеток ресуспендируют пипеткой в 0.2 мл ФСБ. Из суспензии клеток на обезжиренных спиртом предметных стеклах готовят мазки. Число мазков (обычно 10-12) должно соответствовать количеству тестируемых антигенов. На каждое стекло наносят капли (по 20 мкл) полученной суспензии, располагая их в два ряда в шахматном порядке. Капля не должны растекаться или сливаться, для чего используют предметные стекла с углублениями. При их отсутствии на стекле с помощью тонко заточенного победитового сверла или шлифовального приспособления предварительно делают ограничительные кольца диаметром 6-7 мм.

Стекла с мазками быстро высушивают (желательно - в ламинарном боксе) и сразу погружают на 10 мин в химически чистый, безводный, заранее охлажденный при 4 град. C, ацетон - для фиксации. Стекла с фиксированными мазками извлекают пинцетом из ацетона, маркируют, после чего подвергают окрашиванию флуоресцирующими антивирусными иммуноглобулинами.

Фиксированные препараты могут храниться до окрашивания в холодильнике при 4 град. C достаточно продолжительное время (до 3-4 месяцев).

Исследование клеточных культур, инфицированных материалами от больных.

Флуоресцирующие антитела могут быть применены также для детекции вирусных антигенов в клеточных культурах, инфицированных материалами от больных, при одновременном использовании контрольных, не зараженных культур той же партии. В этом случае все процедуры по взятию клинических материалов и заражению клеточных культур выполняют, как описано в Методических рекомендациях "Выделение вирусов гриппа человека и птиц в клеточных культурах и куриных эмбрионах", Санкт-Петербург, 2006. После соответствующей инкубации (48 час.) или появлении признаков ЦПД (более 25% монослоя) клетки из инфицированных и контрольных флаконов снимают с поверхности пенициллиновых флаконов (ПФ) смесью трипсина с версеном и из полученной суспензии готовят мазки для исследования.

Более детально эти процедуры сводятся к следующему:

- Среду из каждого ПФ с подлежащими исследованию клетками, инфицированными материалами от больных, отсасывают пипеткой, переносят в отдельные пробирки, маркируют каждую из них, после чего вируссодержащую среду замораживают и хранят при температуре от -20 град. C до -70 град. C до завершения всех исследований.

- Клеточный монослой инфицированных и контрольных клеточных культур трижды ополаскивают по 1-2 мл ФСБ.

- В каждый ПФ добавляют по 100 мкл смеси растворов 0,05% трипсина и 0.53 мМ версена (ЭДТА x 4Na).

- Осторожно постукивают по ПФ до отторжения клеток.

- После сползания монослоя в каждый ПФ добавляют по 1 мл ФСБ. Центрифугируют клеточные суспензии при 500 g в течение 10 мин. в конических пробирках.

- Осадок ресуспендируют в 0,2 мл ФСБ.

- Клеточную суспензию наносят на обработанные ацетоном стекла (из расчета по 20 мкл каждой в 10 очерченных кружков). На отдельном стекле аналогичным образом готовят препараты из контрольных (не инфицированных) клеток. Мазки высушивают в ламинарном боксе.

- Препараты фиксируют в охлажденном ацетоне в течение 10 мин. Дают им высохнуть. Полученные слайды могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре - 20 град. C.

Приготовление рабочих растворов флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Сухой флуоресцирующий иммуноглобулин (конъюгат) растворяют в дистиллированной воде в соответствии с указанным на этикетке объемом, при необходимости (наличие посторонних примесей) центрифугируют 15 минут при 2000 об/мин. для удаления осадка. Растворенный конъюгат можно хранить в течение 20 дней при 4 град. C. При необходимости более длительного хранения коньюгат фасуют по 0.1 мл и хранят в замороженном состоянии при температуре не выше - 20 град. C. Повторное замораживание-оттаивание не рекомендуется. Непосредственно перед употреблением конъюгат разводят ФСБ для получения указанного на этикетке рабочего разведения. Конъюгат в рабочем разведении хранят не более 7 дней.

Окраска препаратов флуоресцирующими иммуноглобулинами.

Фиксированные препараты помещают во влажную камеру (специальную или чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне). На каждый мазок (в заранее определенном порядке) наносят по 1 капле (25-50 мкл) флуоресцирующего иммуноглобулина в рабочем разведении. Препараты помещают во влажную камеру в строго горизонтальном положении и инкубируют в течение 30 мин. при 37 град. C или 40 мин. при комнатной температуре (в темном месте). Следят за тем, чтобы не происходило подсыхания препарата, поскольку это ведет к развитию неспецифических реакций. По завершении периода инкубации препараты быстро ополаскивают дистиллированной водой и сразу погружают в ФСБ на 10 минут для промывания при периодическом покачивании емкости. Раствор ФСБ заменяют дважды, после чего препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Учет и интерпретация результатов.

Анализ препаратов проводят с помощью люминесцентного микроскопа МЛ-2 (или иного типа) с использованием иммерсионного объектива (x 90), сине-фиолетовых светофильтров возбуждения (СФ-1-2, СЗС-7-2) и запирающего светофильтра N 2. При этом следует пользоваться только специальным нефлуоресцирующим иммерсионным маслом или его заменителями (диметилфталат).

При люминесцентной микроскопии в мазках выявляются эпителиальные клетки различной морфологии, а также могут присутствовать лейкоциты, клеточный детрит, слизь. Диагностически значимым является обнаружение вирусных антигенов только в клетках цилиндрического эпителия (удлиненные или округлые клетки с относительно крупным базально расположенным ядром), проявляющееся в виде четкой диффузной или гранулярной флуоресценции, локализованной в ядрах или цитоплазме клеток. Свечение в клетках, полученных непосредственно от больных, чаще определяется в цитоплазме, хотя при гриппе и аденовирусной инфекции можно видеть специфическую флуоресценцию и в ядрах клеток. Диагностически доказательным является обнаружение в мазке не менее 3 клеток цилиндрического эпителия с отчетливо видимой зеленой специфической флуоресценцией.

При люминесцентной микроскопии препаратов клеточных культур, зараженных вирусом, наблюдаемая картина может варьировать в зависимости от заражающей дозы, типа вируса и сроков его репродукции. При гриппозной и аденовирусной инфекции антигены могут быть обнаружены в цитоплазме и в ядрах клеток. В этом случае наблюдается локальное свечение в ядерных структурах или флуоресцирует вся клетка, если антиген располагается одновременно в ядре и цитоплазме. При парагриппозной и респираторно-синцитиальной вирусной инфекции антигены обнаруживаются только в цитоплазме клеток. Препараты неинфицированных клеточных культур не должны окрашиваться флуоресцирующими антителами. В них может наблюдаться лишь еле заметная аутофлуоресценция.

3. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

В ряду других иммунодиагностических тестов, предназначенных для ранней дифференциальной диагностики ОРВИ, метод иммунофлуоресценции обладает рядом преимуществ, таких как кратковременность анализа (1-2 часа), невысокая стоимость, простота исполнения, возможность проведения дифференциальной диагностики на всю группу наиболее значимых возбудителей респираторных инфекций. Высокая чувствительность и специфичность метода, в наибольшей мере реализуемая при использовании препаратов на основе моноклональных антител, определяют важность практического применения метода в здравоохранении. Метод хорошо зарекомендовал себя в надзоре за гриппом, широко используется в инфекционных стационарах и в глазных клиниках, а также в научных исследованиях, связанных с изучением патогенеза заболеваний.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека

Г.Г.ОНИЩЕНКО

18.04.2006 г. N 0100/4430-06-34

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

И КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

АННОТАЦИЯ

Метод выделения вирусов гриппа человека и животных, включая высоко патогенные штаммы вирусов гриппа птиц, в клеточных культурах является высоко чувствительным тестом при использовании клинических образцов высокого качества.

Предназначен для вирусологов, микробиологов, эпидемиологов. Его использование позволяет, в первую очередь, значительно повысить эффективность изоляции эпидемических штаммов из клинических материалов (смывы, аспираты, секционный материал), а также расширить число выделяемых возбудителей с составлением более полной картины о природе вирусных популяций, циркулирующих среди людей, что необходимо для более полного понимания закономерностей распространения и эволюции возбудителей, прогнозирования эпидемий, а также быстрого распознавания появления нового пандемического вируса гриппа типа A.

Методические рекомендации подготовлены проф., д.м.н. А.А.Сомининой и к.м.н. Е.И.Бурцевой (при участии специалистов ГУ НИИ гриппа РАМН Т.Г.Лобовой, Н.И.Коноваловой, Т.М.Гудковой, к.б.н. О.М.Литвиновой, а также специалистов ГУ НИИ вирусологии РАМН проф., д.м.н. А.Н.Слепушкина и д.б.н. В.Т.Ивановой).

При подготовке настоящих Методических рекомендаций были использованы инструктивные материалы, разработанные WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza (CDC, Atlanta, USA), за предоставление которых авторы выражают свою искреннюю благодарность.

1. ВВЕДЕНИЕ

Важным преимуществом метода изоляции перед другими тестами является получение инфекционного вируса, который может быть далее использован для антигенного и генетического анализа, а также выяснения таких важнейших свойств возбудителя, как чувствительность к химиопрепаратам, неспецифическим ингибиторам, тропизм к разным системам хозяина и др. Ряд факторов (трудоемкость, необходимость использования высоко чувствительных клеточных линий, длительность анализа, высокая стоимость) ограничивает использование метода выделения вирусов гриппа в качестве диагностического теста. В прошлые годы для этих целей, как правило, использовали куриные эмбрионы, однако изменение тропизма современных вирусов с резким снижением частоты изоляции в них возбудителей гриппа обусловило необходимость широкого лабораторного применения клеточных культур. Одной из таких линий, которая была рекомендована экспертами ВОЗ, является перевиваемая культура клеток, полученная из почек собаки породы спаниель - MDCK. Вместе с тем, поскольку кандидаты в вакцинные штаммы должны быть изолированы на куриных эмбрионах, лабораториям, располагающим такими возможностями рекомендуется использовать для выделения вирусов гриппа обе системы. В любом случае исходные клинические материалы необходимо хранить до начала следующего эпидемического сезона при низкой температуре (-70 град. C) для обеспечения возможностей выделения наиболее перспективных в антигеном отношении штаммов в куриных эмбрионах в специализированных лабораториях научно-исследовательских институтов.

2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

2.1. Формула метода

Суть метода заключается в заражении сформированного монослоя клеток MDCK, характеризующихся наиболее высокой чувствительностью к современным вирусам гриппа, клиническими материалами, полученными от больных гриппоподобными заболеваниями. Инфицированные культуры инкубируют в термостате при 37 град. C, контролируя под микроскопом состояние монослоя, а также периодически определяют наличие гемагглютининов в культуральной среде. При развитии специфического цитопатического действия, проявляющегося в разрушении монослоя, культуральную жидкость используют для типирования вирусного изолята в реакции торможения гемагглютинирущей активности (РТГА), а также осуществляют последующий пассаж в целях накопления вируса, который затем направляют в холодовом режиме в соответствующие Центры по гриппу (Федеральный центр по гриппу и ОРВИ на базе ГУ НИИ гриппа РАМН или Центр экологии и эпидемиологии гриппа на базе ГУ Института вирусологии им Д.И.Ивановского РАМН) для последующей идентификации и изучения особенностей антигенной структуры возбудителя.

Непременным условием успешного выделения вирусов являются правильный сбор клинических материалов, соответствующий состав транспортных сред, соблюдение условий доставки материалов в лабораторию (на холоду и в кратчайшие сроки) и безотлагательное заражение заранее подготовленных клеточных культур.

2.2. Показания и противопоказания к применению метода

Показанием к применению метода является рост гриппа и острых респираторно-вирусных заболеваний, регистрация вспышек гриппа среди людей, а также среди птиц, обследование контактных лиц из групп риска в случае появления у них симптомов гриппа. Противопоказания к использованию метода отсутствуют.

2.3. Материально-техническое обеспечение

Для выполнения работ по изоляции вирусов гриппа в клеточной культуре MDCK необходимо иметь 2 набора реагентов, один из которых предназначен для субкультивирования клеток, а второй - непосредственно для работ по выделению вирусов из материалов от больных.

2.3.1. Перечень материалов, необходимых для субкультивирования клеток MDCK (из расчета на 10 пассажей):

Клеточная культура MDCK (7 млн.) в монослое, выращенном во флаконе Т 25 <*>	- 1 шт.
Модифицированная среда Игла D-MEM, "GIBCO BRL", (США), кат. N 11965-092, производитель - "Биолот" (Санкт-Петербург) или среда Игла MEM с двойным набором аминокислот (Предприятие при ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) ФС 42-94 ВС-88	- 240 мл
Альбумин бычий, фракция V, 7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011	- 7,0 мл
HEPES - буфер 1М раствор, pH 7,2, "Sigma" (США), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023	- 7,0 мл
Эмбриональная сыворотка КРС, "Sigma" (США), кат. N F3018 или Hy Clone Lab, Inc, кат. N А-1111-L	- 12 мл
Раствор для отторжения клеточной культуры (0,05% трипсин в смеси с 0,53 мМ раствором EDTA. 4Na) "GIBCO BRL", США, кат. N 25300-054 или раствор химопсина (0,125 мг/мл) на 0,53 мМ растворе версена	- 100 мл
Пенициллин, ОАО "Красфарма", ГФХ ст. 95	- 500 тыс. ед.
Стрептомицин, ОАО "Биохимик" ГФК стр. 636	- 0,5 г.
Флакон для культивирования клеток Т 25, "Sarstedt" (Германия), кат. N 7245082	- 10 шт.

--------------------------------

<*> Набор может храниться при +4 град. C в течение 6 месяцев (за исключением клеточной культуры MDCK, которая подлежит непрерывному субкультивированию, но не более 10-20 пассажей, после чего ее чувствительность понижается, что определяет необходимость ее повторного восстановления из криобанка). Культура получена из CDC, Atlanta (USA), хранится в Коллекциях клеточных культур при ГУ НИИ гриппа РАМН и ГУ Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

2.3.2. Перечень материалов, необходимых для изоляции вирусов гриппа (рассчитан на проведение 100 анализов):

А. Транспортная среда (для получения и доставки клинических материалов):

Среда 199 на растворе Хенкса, "Биолот" (Санкт- Петербург) или Предприятие при ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов (Москва)	- 200 мл
Альбумин бычий, V фракция (7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011	- 13,5 мл
HEPES - буфер 1М раствор, pH 7,2, "Sigma" (США), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023	- 5 мл
Гентамицин "ХИНОИН", Венгрия, кат. N АТС: JOIGB03	- 1 амп.
Тампоны стерильные для взятия мазков	- 100 шт.

Б. Растворы для культивирования клеток (10 пассажей) и выделения вирусов (100 анализов):

Среда Игла в модификации Дальбекко (DMEM) или среда Игла MEM с двойным набором аминокислот <*>	- 450 мл
Эмбриональная сыворотка КРС <*>	- 12,5 мл
Альбумин бычий, фракция V, 7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011	- 12,5 мл
Трипсин ТРСК, тип XIII, "Sigma", США, кат. N Т1426 (расфасован по 200 мкг/амп.)	- 2 ампулы
Раствор для отторжения клеточной культуры <*>	- 100 мл
HEPES - буфер 1М раствор, pH 7,2, "Sigma" (США), кат. N H0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023	- 12,5 мл
Пенициллин <*> 500 ед.	- 1 флакон
Стрептомицин <*> 0,5 г.	- 1 флакон
Дистиллированная вода (для растворения трипсина ТРСК), ГОСТ 6709-72	- 5 мл
Глицерин АО "Каустик" ГОСТ 6259-75 кв "Z"	- 2 мл
В. Клеточная культура MDCK <*> (в монослое, флакон Т25, 7 млн. клеток)	- 1 матрас
Среда Игла с сывороткой для транспортирования клеток <*>	- 50 мл
Флакон культуральный Т25 <*>	- 10 шт.
Насадка фильтрующая шприцевая GyroDisc, размер пор 0,2 мкм, "Биолот"	- 10 шт.

--------------------------------

<*> Набор хранится при +4 град. C в течение 6 мес. После растворения трипсин ТРСК и антибиотики хранить при температуре не выше -20 град. C, а остальные компоненты набора - при 4 град. C.

2.3.3. Материалы и оборудование для постановки реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации в целях индикации и идентификации выделенных вирусов:

Планшеты круглодонные для иммунологических реакций, "Медполимер", ТУ 64-2-278-79.

Дозатор 8-канальный с переменным объемом 5-50 мкл, "Ленпипет", кат. N 4173202.

Автоматическая пипетка с переменным объемом 5-50 мкл.

Наконечники для автоматических пипеток до 200 или 250 мкл.

Пипетки 10,0 мл; 5,0 мл и 1,0 мл.

Эритроциты человека 0 (I) группы крови, 0.75%.

Физиологический раствор.

Фосфатно-солевой буфер.

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.

Сыворотки диагностические гриппозные к различным субтипам вируса гриппа A и к вирусу гриппа B, ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов" при ГУ НИИ гриппа РАМН, ВФС 42-03215509-04.

2.3.4. Оборудование.

Бокс ламинарный II уровня защиты.

Холодильник бытовой (4 +/- 1) град. C.

Рефрижератор (-70 +/-2) град. C.

Центрифуга лабораторная (до 3000 об/мин.).

Термостат (36 +/- 1) град. C, желательно - СО2 инкубатор.

Микроскоп биологический (МБИ-3) или инвертированный (ЛОМО, Россия или Unico IV 900, United Product and Instrum. Inc., США).

2.4. ОПИСАНИЕ МЕТОДА

Принцип метода заключается в заражении сформированного в пенициллиновых флаконах (или пробирках) монослоя клеток MDCK клиническими образцами, полученными от больных с симптомами гриппа.

Инфицированные культуры инкубируют при 35-37 град. C, желательно в инкубаторе с подачей воздуха в смеси 5% CO2. Ежедневно контролируют состояние монослоя. При появлении первых признаков размножения вируса вируссодержащую культуральную жидкость исследуют на наличие гемагглютининов в среде, которую используют далее для накопления вируса. Полученные изоляты направляют в холодовом режиме в соответствующие Центры по гриппу. Использование метода изоляции вирусов гриппа в клеточной культуре MDCK в дополнение к известному способу выделения вирусов гриппа на куриных эмбрионах позволяет резко расширить диапазон выделяемых возбудителей с составлением наиболее полной картины о структуре циркулирующих вирусных популяций, что необходимо для надзора за гриппом, понимания закономерностей эволюции возбудителя и прогнозирования предстоящих эпидемий, а также составления рекомендаций по штаммовому составу вакцин и диагностических препаратов на предстоящий эпидемический сезон.

2.4.1. Подготовка клеточной культуры, сред и растворов.

Питательные среды готовят в требуемых объемах в зависимости от количества исследуемых клинических материалов непосредственно перед употреблением.

Подготовка транспортной среды.

К 200 мл среды 199 (на растворе Хенкса) добавляют 13,5 мл 7,5% раствора бычьего альбумина, 5 мл 1М HEPES - буфера и гентамицин (20 мг). После перемешивания среду стерильно разливают по 2 мл в 100 пробирок и хранят до использования при 4 град. C.

Подготовка ростовой среды DMEM (для субкультивирования клеток).

Готовят концентрированный (x 1000 кратный) раствор антибиотиков. Во флакон с пенициллином добавляют 5 мл среды DMEM (без сыворотки), после растворения содержимое флакона переносят во флакон со стрептомицином, смесь пипетируют до полного растворения, фасуют по 0,5 мл и хранят при температуре не выше -20 град. C.

К 228 мл среды DMEM добавляют 12 мл эмбриональной сыворотки (5%) и 0,25 мл концентрированного раствора смеси пенициллина и стрептомицина.

Подготовка среды для выделения вирусов гриппа (CB) в клетках MDCK (на обследование 10 больных).

Непосредственно перед употреблением к 19 мл среды DMEM (без сыворотки) добавляют 0,5 мл бычьего альбумина (V фракция), 0,5 мл 1М HEPES-буфера и 0,4 мл ТРСК-трипсина (до конечной концентрации 2,0 мкг/мл). ТРСК-трипсин из 1 ампулы предварительно регидратируют в 2 мл стерильной дистиллированной воды и добавляют в среду в указанном выше количестве, оставшуюся часть фасуют по 0,4 мл и хранят в замороженном состоянии (при температуре не выше -20 град. C). В подготовленную среду добавляют 30 мкл концентрированного раствора пенициллина со стрептомицином. При обследовании меньшего количества больных остаток среды хранят при температуре не выше -20 град. C.

Культивирование клеток

Клеточная культура MDCK сохраняет высокую чувствительность на протяжении 10-20 пассажей от момента ее получения, поэтому культивирование клеток целесообразно начинать незадолго до начала эпидсезона (октябрь-ноябрь месяцы). В случае объявленной угрозы пандемии наборы необходимо формировать незамедлительно.

Субкультивирование клеток проводят в культуральных флаконах Т25 емкостью 50 мл через каждые 3-4 дня (как только сформируется монослой) во избежание "старения" культуры, в результате чего ее чувствительность к вирусу понижается. Культуральную среду из матраса с монослоем клеток полностью удаляют. На монослой наносят 5 мл теплого (36-37 град. C) раствора EDTA-трипсин. Легким покачиванием омывают клеточный монослой указанным раствором в течение 1 мин., после чего внесенный раствор полностью удаляют пастеровской пипеткой. Процедуру повторяют. После этого в матрас вносят 1,0 мл теплого раствора EDTA-трипсин, так, чтобы он полностью покрыл монослой и помещают в термостат (36-37 град. C) на 30-40 мин. до полного разрыхления и сползания монослоя. Допускается периодическое постукивание ладонью руки для ускорения отторжения культуры от пластика/стекла. После полного сползания клеток для приостановки дальнейшего действия EDTA-трипсина в матрас вносят 1,0 мл фетальной сыворотки, а затем - 1 мл среды DMEM. Суспензию клеток мягко пипетируют тонко оттянутой пипеткой до получения гомогенной суспензии. К полученной взвеси добавляют 9 мл среды DMEM. Суспензию перемешивают, производят подсчет клеток. При хорошем состоянии культуры с 1 матраса снимают около 6-7 млн. клеток. В зависимости от планируемой работы и сроков поступления клинических материалов полученную суспензию клеток MDCK готовят в следующих концентрациях:

100-150 тыс. клеток/мл - для формирования монослоя на 3-4 сутки, 200 тыс. клеток/мл - через 2 суток и 400 тыс. клеток /мл - через 24 часа.

Суспензию делят на 2 части по 5 мл, одну из которых используют для последующего субкультивирования, добавляя 15 мл ростовой среды DMEM, содержащей 5% эмбриональной сыворотки. Вторую часть используют для изоляции вирусов.

Важно, чтобы субкультивирование клеток на матрасах осуществлялось не реже 1 раза в 3-4 дня.

Выращивание клеток MDCK для изоляции вирусов.

К 5 мл полученной суспензии клеток добавляют среду DMEM, содержащую 0,5% сыворотки, в объеме, необходимом для разведения клеток, суспензию перемешивают пипетированием и рассевают по 1,5 мл по пенициллиновым флаконам (пробиркам). Сформированный монослой должен использоваться для заражения без промедления, поскольку по мере дальнейшей инкубации культура утрачивает свою чувствительность к вирусам гриппа.

Таким образом, рассев культуры по флаконам (пробиркам) должен проводиться с учетом планируемого получения клинических материалов от больных.

Получение и доставка клинических материалов.

Материалом для изоляции вирусов служит отделяемое из глубоких отделов носовой полости, зева, а также секционные ткани легкого, бронхов и мозга.

Материал отбирают в разгар заболевания (первые 3 дня болезни) в период вспышек гриппоподобных заболеваний в коллективах детей или взрослых, а также от амбулаторных или госпитализированных больных. С наибольшей частотой вирусы выделяются от детей младшего возраста, у которых вирус находится в свободном состоянии (вне иммунных комплексов).

Мазки из носа и зева.

Перед взятием материала из носа рекомендуется очистить носовые ходы от слизи. Материалы собирают стерильными тампонами, которые вводят последовательно в обе ноздри на глубину 2-3 см в область нижнего носового хода, дают пропитаться секретом в течение 1-3 мин., после чего вращательными движениями тампон медленно извлекают и погружают в пробирку с 2 мл транспортной среды, отламывая нестерильный конец палочки. Материалы из зева собирают аналогичным образом, плотно прижимая тампоны к пораженным гиперемированным участкам миндалин и задних фарингеальных отделов. Тампон из зева помещают в одну пробирку с тампоном из носа.

В случае необходимости исследования материала с использованием нескольких методов можно проводить взятие материала в разные пробирки, например, для иммунофлуоресцентного анализа - из одной ноздри, для изоляции вируса - из другой ноздри, ПЦР - из зева. Такое разделение поможет сохранить материал и выполнять исследования вне зависимости от сроков хранения и обработки материалов при исследовании другими методами.

Пробирки с материалом для выделения вируса незамедлительно доставляют в холодовом режиме (+4 град. C) в лабораторию, где тампоны с материалом от больного после интенсивного встряхивания отжимают в транспортную среду. Полученный материал используют для заражения клеточной культуры MDCK.

Назофарингеальные аспираты.

Назофарингеальные секреты аспирируют с помощью катетера, присоединенного к флакону, имеющему второй отвод, присоединенный к вакуумному отсосу. Катетер вводят вглубь носа параллельно небу, затем подключается отсос и катетер медленно, с поворачиванием, удаляется. Тем же катетером собирается слизь из второй ноздри. После этого катетер промывают 2 мл транспортной среды и материал доставляют в лабораторию.

Секционные материалы.

Фрагменты легкого, бронхов или мозга в день смерти больного помещают в стерильные флаконы и доставляют в холодовом режиме в лабораторию.

Из полученных материалов готовят 10% суспензию, растерев фрагменты ткани со стерильным стеклянным песком в фарфоровой ступке, после чего к суспензии добавляют транспортную среду в соотношении 1:9, которую после перемешивания и освобождения от осадка отстаиванием (0,5 ч. при 4 град. C) или центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин. отбирают и используют для последующего заражения клеток.

Хранение материалов от больных.

Оптимальным для выделения вирусов является незамедлительное заражение клеточной культуры, поскольку при хранении материалов инфекционная активность вирусов понижается. При отсутствии выросшей культуры на момент поступления материалов они могут храниться в лаборатории до заражения при +4 град. C не более суток.

Для более длительного хранения они должны быть заморожены при температуре не выше -20 град. C (желательно - при -70 град. C). Для сохранения инфекционности вируса следует избегать многократного (не более двух раз) замораживания - оттаивания клинических материалов.

Инфицирование клеточной культур MDCK клиническими материалами и субкультивирование вируса.

Первичное заражение.

Флаконы (пробирки) с монослоем клеток MDCK дважды по 1,5 мл отмывают средой без сыворотки, после чего материалы от больных наносят на монослой клеток из расчета по 0,2-0,3 мл каждого из материалов в 2-3 флакона (пробирки). Инфицированные культуры помещают в термостат на 30-40 мин (для адсорбции вируса), после чего в них вносят по 0,9-1,5 мл среды с трипсином (CB). В контрольные культуры добавляют по 1 мл СВ.

Инфицированные и контрольные культуры помещают в термостат с температурой 35-37 град. C, желательно с подачей 5% CO2. Ежедневно контролируют состояние монослоя с целью обнаружения признаков цитопатогенного действия вируса (ЦПД).

При отсутствии выраженного ЦПД пробы выдерживают при +37 град. C вплоть до 7 суток. Периодически, через каждые 2-3 дня, начиная с 24-48 часов после заражения, размножение вирусов гриппа контролируют в реакции гемагглютинации (РГА). С этой целью из каждого флакона отбирают по 50 мкл культуральной жидкости (КЖ), которую титруют на фосфатно-солевом буфере, pH 7,2-7,4, начиная с цельной пробы до разведения 1:32 (в объеме 50 мкл). К полученным разведениям КЖ добавляют по 50 мкл трижды отмытой физиологическим раствором 0,75% взвеси эритроцитов человека 0 (I) группы крови (наиболее чувствительная система регистрации гемагглютининов). При отрицательных результатах РГА клетки необходимо разрушить замораживанием-оттаиванием, подготовить объединенные пулы культуральной жидкости (из 2-3х флаконов от каждого пациента) и провести следующий пассаж в 2-3х флаконах с монослоем клеток MDCK с регистрацией репродукции вируса по ЦПД и в РГА, как указано выше. При отрицательных результатах на протяжении двух пассажей исследование материала прекращают.

Накопление вируса.

Для дальнейшего накопления вируса культуральную жидкость из одного из пенициллиновых флаконов с развившимся ЦПД или с появившимися гемагглютининами используют для заражения клеток MDCK.

Перед заражением монослоя, сформированного на культуральном флаконе Т25, проводят процедуры, описанные выше (удаление ростовой среды, отмывание средой без сыворотки). В отмытый флакон с монослоем клеток вносят 0,5 мл вируссодержащего материала (при высоких титрах ГА в первичном изоляте, достигающих 1:16 и выше, рекомендуется перед заражением разводить вирус в 10-100 раз). После инкубации при 37 град. C в течение 30-40 минут во флакон вносят 10 мл среды СВ. Флакон помещают в термостат. Ежедневно оценивают развитие ЦПД, через каждые 3 суток определяют присутствие гемагглютининов. При появлении выраженного ЦПД и (или) появления гемагглютининов культуральную среду собирают, проводят центрифугирование в течение 10-15 мин. при 2000 об/мин. и используют для последующего типирования возбудителя в РТГА с набором специфических диагностических гриппозных сывороток.

Хранение изолятов.

Для сохранения выделенного вируса к пробе объемом 1 мл, помещенной в микропробирку для криоконсервации с завинчивающейся крышкой ("Sarstedt", Германия), добавляют 5 мкл стабилизатора (глицерина). Выделенные вирусы могут храниться в лаборатории в замороженном состоянии при - 30 град. C (желательно при - 70 град. C) в течение 1 года (до начала следующего эпидемического сезона).

Примечание: В целях соблюдения правил безопасности всю работу с инфекционным материалом проводят в масках и резиновых перчатках в стерильных ламинарных боксах, оснащенных бактерицидными лампами. Отработанные посуду и материалы обеззараживают автоклавированием, рабочие поверхности, полы обрабатывают 2% раствором хлорамина или лизоформина, по окончании и перед началом работы проводят 1,5-2 часовое облучение бокса бактерицидными лампами.

Направление выделенных вирусов.

Все выделенные вирусы гриппа и нетипируемые гемагглютинирующие агенты для последующего изучения их антигенной принадлежности необходимо немедленно пересылать авиатранспортом в холодовом режиме в Федеральный центр по гриппу и другим ОРВИ при НИИ гриппа РАМН (197376, Санкт Петербург, ул. проф. Попова, 15/17, тел. /812/ 234-62-63, e-mail: somin@infos.ru) или в Центр экологии и эпидемиологии гриппа при НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16, тел. /495/ 190-30-46, e-mail: flulab@mail.ru) (в соответствии с принадлежностью), известив получателя об отправке.

В Центрах проводится восстановление вирусов, детальное изучение антигенных и биологических свойств возбудителей, после чего они депонируются в Музейных коллекциях институтов и могут быть направлены в Сотрудничающие референс-центры Всемирной организации здравоохранения для изучения особенностей глобального распространения антигенных вариантов вирусов гриппа.

3. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

Предлагаемый метод выделения современных вирусов гриппа в клеточной культуре MDCK выгодно отличается от метода выделения вирусов гриппа на куриных эмбрионах большей эффективностью, в части случаев результаты изоляции в обеих системах носят взаимодополняющий характер.

В течение ряда лет в НИИ гриппа проводились работы по сравнительной оценке двух способов выделения вирусов гриппа - в куриных эмбрионах и на клеточной культуре MDCK. В эпидсезон 1997-1998 г. частота выделения вирусов гриппа в куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK составляла 2,2% и 13%, 1998-1999 гг. - 6,2 и 7,7% соответственно. При этом результаты изоляции вирусов в обеих системах совпадали лишь в части случаев, что свидетельствовало о различиях в тропизме к рецепторам у циркулирующих вирусов. Дальнейшая эволюция современных вирусов гриппа привела к тому, что они практически утратили тропизм к клеткам куриных эмбрионов и в сезоны 2003-2004 и 2004-2005 гг. более 99% штаммов было выделено в клеточной культуре. Вместе с тем вирусы, выделенные в клеточной культуре MDCK, в настоящее время не разрешено использовать для производства вакцин, что определяет необходимость продолжения работ по выделению вирусов на куриных эмбрионах с усовершенствованием соответствующих методических подходов.

Необходимо подчеркнуть, что повышение частоты выделения вирусов гриппа в клеточных культурах достигается только при полном соблюдении изложенных рекомендаций на всех этапах работ, использовании указанных в рекомендациях реагентов и чувствительной линии культуры клеток MDCK.

4. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

Для выделения вирусов гриппа на куриных эмбрионах исследуемые материалы после их первичной обработки вводят по 0,1 мл в амниотическую полость и по 0,2 мл в аллантоисную полость 9-11-дневных куриных эмбрионов.

Заражение проводят в затемненном боксе через боковую поверхность скорлупы, направляя иглу сначала в амниотическую, а затем в аллантоисную полости, предварительно сделав два прокола в скорлупе (над воздушной камерой и в районе глазка эмбриона).

Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 48 ч. при температуре 36-37 град. C (для вирусов гриппа A) и 72 часа при 33-34 град. C (для вирусов гриппа B). После инкубации эмбрионы помещают на ночь в рефрижератор при +4 град. C. Амниотическую и аллантоисную жидкость собирают в отдельные пробирки с последующим их титрованием в РГА.

Индикацию вирусов гриппа осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА) микрометодом путем добавления 50 мкл 0,5% суспензии отмытых эритроцитов кур или 0,75% эритроцитов человека 0 (I) группы крови к 50 мкл вируссодержащего материала. Результаты РГА учитывают после 30-40 минутного оседания эритроцитов в лунках панелей при комнатной температуре.

При отсутствии агглютинации эритроцитов проводят 2 дополнительных пассажа путем заражения эмбрионов смесью амниотической и аллантоисной жидкостей от предыдущего пассажа. В случае отрицательных результатов РГА после 2 пассажей материалов исследование прекращают.

5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА

Типирование и субтипирование вирусов проводят в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) микрометодом.

5.1. Реагенты, необходимые для постановки РТГА:

РЕФЕРЕНС-АНТИГЕНЫ. Референс-антигены (гриппозные диагностикумы) представляют собой инфицированную вирусом гриппа аллантоисную жидкость инактивированную тиомерсалем. Референс-антигены готовятся из вакцинных или антигенно родственных им штаммов. Препарат должен иметь титр гемагглютинина не ниже 160 ГАЕ/0,1 мл, но титр гемагглютинина (в жидком виде) может снижаться в процессе хранения. Жидкие и лиофилизированные антигены хранят при 4 град. C. Все антигены разводят фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:10 и титруют непосредственно перед началом постановки реакции. Они не должны использоваться, если их титр будет ниже 32 ГАЕ/0,1 мл. В РТГА данные антигены используются в качестве контрольных образцов.

РЕФЕРЕНС-СЫВОРОТКИ. Референс-сыворотки представляют собой лиофилизированные гипериммунные бараньи (в составе наборов ВОЗ) или очищенные от ингибиторов гипериммунные кроличьи сыворотки (производятся в России). Объем дистиллированной воды, которую необходимо добавить для разведения сыворотки, указан на этикетке флакона. В качестве консерванта в сыворотках используется 0,1% азид натрия. В диагностический набор ВОЗ включена контрольная (баранья) сыворотка, не содержащая антител к вирусу гриппа, которая служит контролем правильности обработки референс-сывороток рецептор-разрушающим энзимом (RDE) для их освобождения от неспецифических ингибиторов. Диагностические сыворотки, выпускаемые ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов" (Санкт Петербург, Россия), в дополнительной обработке для устранения неспецифических ингибиторов не нуждаются. Лиофилизированные сыворотки хранят при температуре 4 град. C, растворенные - в замороженном виде при -20 град. C.

РЕЦЕПТОР РАЗРУШАЮЩИЙ ЭНЗИМ (RDЕ). Является коммерческим препаратом и используется для обработки сывороток.

ТЕСТИРУЕМЫЕ ИЗОЛЯТЫ. Изоляты вирусов гриппа могут быть выделены как на куриных эмбрионах, так и на клеточных культурах (MDCK) и должны иметь титры в РГА не ниже 1:8, но предпочтительно 1:16 и выше.

СУСПЕНЗИЯ ЭРИТРОЦИТОВ. Для постановки РТГА могут быть использованы эритроциты кур, индюшек, человеческие эритроциты 0 (1) группы крови или эритроциты морской свинки. Рабочая концентрация для эритроцитов птиц составляет 0,5%, а для эритроцитов млекопитающих - 0,75%.

ФОСФАТНО-СОЛЕВОЙ БУФЕРНЫЙ РАСТВОР (ФСБ) pH 7,2.

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ РАСТВОР 0.85%.

ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ТИТРОВАНИЯ (планшеты, пипетки, кюветы и т.д.). Для постановки РТГА используют 96-луночные микропланшеты. Планшеты с V-образными лунками обычно применяют, когда реакция проводится с эритроцитами птиц, а планшеты с U-образными лунками - при использовании эритроцитов млекопитающих.

5.2. Обработка референс сывороток от неспецифических

ингибиторов с помощью фермента RDE

Сыворотки большинства видов животных содержат неспецифические ингибиторы. Эти факторы могут быть причиной ложноположительных результатов реакции. Для удаления неспецифических ингибиторов из сывороток животных применяют рецептор-разрушающий энзим (RDE). Если обработка сывороток RDE недостаточна, то можно применить альтернативные способы обработки (прогревание, обработка перйодатом калия или трипсином).

МЕТОДИКА ОБРАБОТКИ РЕФЕРЕНС-СЫВОРОТОК RDE

1. RDE представляет собой сухой препарат, который необходимо развести в 25 мл физиологического раствора.

2. Добавить 3 объема RDE к 1 объему сыворотки (0,3 мл RDE + 0,1 мл сыворотки).

3. Инкубировать при 37 град. C в течение 16-18 часов.

4. Прогреть сыворотку, обработанную RDE при 37 град. C в течение 30 минут.

5. Добавить 6 объемов физиологического раствора (0,6 мл физ. раствора + 0,4 мл сыворотки обработанной RDE).

Обработанная RDE сыворотка используется для постановки РТГА и имеет разведение 1:10.

5.3. Методика постановки РТГА микрометодом

5.3.1. Определение титров гемагглютининов контрольных антигенов и тестируемых изолятов.

Схема титрования антигенов.

В первую лунку микропланшета вносят 100 мкл контрольного антигена или тестируемого изолята.

- В лунки NN 2-12 вносят по 50 мкл ФСБ.

- Титруют антигены с коэффициентом 2, начиная с 1:2 до 1:512. Для приготовления двукратных разведений переносят по 50 мкл тестируемого антигена из лунки в лунку при тщательном перемешивании.

- К каждому разведению добавляют по 50 мкл суспензии эритроцитов (0,5% птичьих эритроцитов или 0,75% эритроцитов млекопитающих). В шейкере или путем аккуратного встряхивания планшета перемешивают смесь эритроцитов и антигена. Планшеты оставляют неподвижно на 30-40 минут при комнатной температуре до полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (NN 11-12).

Определение титра гемагглютининов.

Наибольшее разведение вируса, при котором регистрируется полная агглютинация эритроцитов, принимают за его титр.

5.3.2. Приготовление стандартизованного антигена.

Единица ГА не является мерой измерения абсолютного количества вируса, но является "операционной" единицей, зависящей от методических особенностей титрования (объема реагентов, концентрации, вида эритроцитов и т.д.). Единица ГА определяется как количество вируса, необходимое для агглютинации равного объема стандартизированной суспензии эритроцитов.

Определение объема стандартизованного по содержанию ГА антигена (CA), необходимого для постановки РТГА.

Пример: 1 мл CA достаточно для его тестирования с 5 сыворотками, каждая из которых разведена в 8 лунках, при условии, что в каждую лунку добавлено по 25 мкл антигена (25 мкл x 5 сывороток x 8 лунок = 1 мл CA).

Для процедуры "повторного титрования" и с учетом потерь необходимо приготовить дополнительно 1 мл CA. Т.о. для проведения опыта нужно приготовить не менее 2 мл CA.

Определение разведения антигена.

Стандартизованный антиген должен содержать 8 ГАЕ в 50 мкл раствора. Необходимое для опыта разведение антигена определяют делением титра гемагглютининов на 8.

Например: титр ГА составил 1:160, антиген разводят в 20 раз (160 : 8 = 20). Для этого 0,1 мл антигена добавляют к 1,9 мл ФСБ.

Контроль дозы CA повторным титрованием.

СА должен содержать 8 ГАЕ/50 мкл. Это означает, что полная агглютинация должна регистрироваться в первых 4 лунках планшета (при титровании в объеме 50 мкл с внесением в первую лунку неразведенного CA, а в последующие - его двукратных разведений). Схема повторного титрования показана на рис. 2. Если CA не содержит 8 ГАЕ/50 мкл, он доводится до нужной дозы добавлением соответствующего количества ФСБ, если титр более 8, или неразведенного антигена, если титр ниже 8.

Пример: если полная гемагглютинация наблюдается в 5 лунках (титр 1:16), приготовленный CA следует развести в 2 раза. Наоборот, если гемагглютинация наблюдается только в первых 3 лунках (титр 1:4), в приготовленный CA необходимо добавить антиген в том же количестве, что и при первичном приготовлении раствора.

После тщательного перемешивания контрольное титрование CA повторяют, доводя его концентрацию до 8 ГАЕ/50 мкл. Разведенный CA следует хранить при +4 град. C и использовать в тот же день.

5.3.3. Постановка РТГА.

Титрование референс-сывороток. Готовят серию двукратных разведений сывороток на ФСБ (от 1:10 до 1:1280) в объеме 25 мкл. Для этого в первые лунки рядов N 1-6 вносят по 50 мкл соответствующей референс-сыворотки (имеющей уже исходное разведение 1:10 после обработки RDE и прогревании). В остальные лунки (кроме лунок рядов N 6 и N 7) вносят по 25 мкл ФСБ. 25 мкл сыворотки из первой лунки переносят в следующую и после тщательного перемешивания процедуру повторяют. Из последней лунки избыток (25 мкл) разведенной сыворотки сбрасывают. Ряды N 6 и N 7 являются контрольными, в каждую лунку которых следует внести по 50 мкл ФСБ.

Добавление CA. К каждому разведению сыворотки добавляют по 25 мкл стандартизованного антигена. Панели встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут.

Внесение эритроцитов. По завершении инкубации в каждую лунку, включая контрольные, добавляют по 50 мкл суспензии эритроцитов.

5.3.4. Учет результатов.

Результаты реакции учитывают через 30 минут. Оценку результатов РТГА начинают с контрольных лунок планшеты. В контрольных лунках, содержащих только эритроциты (NN 10-12 в рядах G и Н), реакция должна быть четко отрицательной. После этого учитывают результаты титрования контрольного образца сыворотки, не содержащей антител к вирусу гриппа, с используемыми референс-антигенами. Во всех этих лунках (NN 10-12, ряды A-F) должна быть четкая гемагглютинация, свидетельствующая о правильности обработки сывороток и полном удалении неспецифических ингибиторов. Далее учитывают результаты взаимодействия гомологичных референс-сывороток и референс-антигенов, которые должны быть строго специфичными (ингибиция гемагглютинации в рядах NN 1-3 должна регистрироваться до титров не ниже, чем 1:160). Титром позитивной референс-сыворотки считают ее последнее разведение, обусловившее полное торможение гемагглютинации. При такой картине можно учитывать весь опыт типирования изолятов и полученные результаты считать достоверными. Выводы о результатах типирования вируса делают на основании выявленного взаимодействия тестируемого изолята с одной из позитивных референс-сывороток. Изолят относят к тому или иному типу (субтипу) вируса при условии его взаимодействия с соответствующей референс-сывороткой до титра не ниже, чем 1:20.

При отсутствии взаимодействия вновь выделенного вируса с референс-сыворотками его относят к разряду нетипируемых и направляют в соответствующие Центры для последующего более детального антигенного анализа.