Оставьте ссылку на эту страницу в соцсетях:

Поиск по базе документов:

 

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

9 августа 2006 года

 

Дата введения:

1 сентября 2006 года

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В ПРОБАХ КРОВИ

МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.1.2116-06

 

1. Область применения

 

Методические указания по определению концентрации стирола в крови предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием стирола в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика выполнения измерений обеспечивает определение стирола в диапазоне концентраций 0,1-5,0 мкг/куб. см с погрешностью, не превышающей 23%, при доверительной вероятности Р = 0,95.

 

    C6H5CHCH2                                             Мол. масса 103,7.

 

Стирол (винилбензол, фенилэтилен) - бесцветная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 145 град. С, плотность 0,9059. Растворяется в большинстве органических растворителей, растворимость в воде 0,032% по объему (20 град. С) [1]. Стирол оказывает общетоксическое, сенсибилизирующее, эмбриотропное, раздражающее действия, отрицательно влияет на ЦНС, обладает кумулятивным эффектом [2].

 

2. Сущность метода

 

Методика основана на извлечении стирола из крови экстракцией гексаном и анализе экстракта на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации стирола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Нижний предел измерения - 0,001 мкг.

Определению не мешают фенол, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы, карбоновые кислоты.

Длительность анализа, включая пробоподготовку, - 20 мин.

 

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

 

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

 

3.1. Средства измерений

 

Жидкостный хроматограф с насосом высокого

давления и ультрафиолетовым детектором

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические                  ГОСТ 24104-01

Гири Г2-210                                              ГОСТ 7328-01

Микрошприцы МШ-10                                        ТУ 2.833.106-00

Колбы мерные вместимостью 50 куб. см                     ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные вместимостью 1, 5, 10 куб. см     ГОСТ 29227-91

Редуктор кислородный                                     ТУ 26-05-236-73

Аттестованная смесь стирола в этиловом спирте

с концентрацией 1,00 мг/куб. см                          ГСО МСО 0056.1998.

 

3.2. Вспомогательные устройства

 

Колонка стеклянная длиной 150 мм и

внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная

сорбентом Separon SGX C18 зернением 7 мкм

Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон"                    ТУ 9443-001-245.23530-97

Экстрактор ПЭ-8                                    ТУ 3614-001-23050963-97

Дистиллятор                                        ТУ 61-1-721-79

Сушильный шкаф ШСС-80                              ТУ 16.531.743-83

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см       ГОСТ 23932-90

Воронка Шотта (пор 16)                             ГОСТ 25336-82

Бюксы СВ 19/9                                      ТУ 92-891.029-91

Пробирки центрифужные пропиленовые

с завинчивающейся крышкой, производство

"Sarstedt", Германия.

 

3.3. Реактивы

 

Гексан для хроматографии, осч                            ТУ 6-09-4521-77

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, осч            ТУ 6-09-14-2167-84

Вода дистиллированная                                    ГОСТ 6709-72

Гидроксид натрия, хч                                     ГОСТ 4328-77

Спирт этиловый                                           ГОСТ Р 51652-2000

Серная кислота                                           ГОСТ 4204-77

Калия дихромат, хч                                       ГОСТ 4220-75

Раствор гепарина в ампулах (5000 ед. в 1 куб. см).

 

3.4. Материалы

 

Гелий газообразный                                       ТУ 51-940-80.

 

3.5. Растворы

 

Элюент для хроматографии

Раствор гидроксида натрия, 10%-й

Раствор дихромата калия в серной кислоте, 3%-й.

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химреактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.

 

4. Требования к безопасности

 

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и меры безопасности, указанные в "Руководстве по правилам эксплуатации прибора".

 

5. Требования к квалификации оператора

 

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и владеющие техникой жидкостно-хроматографического анализа.

 

6. Условия измерений

 

6.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15-25 град. С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С.

6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

 

7. Подготовка к выполнению измерений

 

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

 

7.1. Подготовка посуды

 

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе двухромовокислого калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.

 

7.2. Приготовление растворов

 

7.2.1. Элюент для хроматографии. Смешивают 60 куб. см ацетонитрила с 40 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3-5 мин. со скоростью 50-60 куб. см/мин.

7.2.2. Раствор гидроксида натрия 10%-й. Вносят в мерный стакан с меткой на 100 куб. см 10 г гидроксида натрия, прибавляют 90 куб. см дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана до полного растворения гидроксида натрия. Срок хранения раствора - 30 дней при 4 град. С.

7.2.3. Раствор двухромовокислого калия в серной кислоте 3%-й. Растворяют 3,0 г двухромовокислого калия в 53 куб. см концентрированной серной кислоты (плотность 1,84). Использовать свежеприготовленный раствор.

 

7.3. Подготовка хроматографической колонки

 

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.2.1., со скоростью 0,6 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

 

7.4. Установление градуировочной характеристики

 

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации стирола в крови, устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят разбавлением аттестованной смеси стирола в этиловом спирте (растворы А, Б).

7.4.1. Приготовление раствора А: 1 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.2. Приготовление раствора Б: 10 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.3. В соответствии с п. 8 проводят анализ образца крови на отсутствие стирола. Объем образца крови для приготовления градуировочных смесей должен быть не менее 12 куб. см. Образец крови с гепарином (из расчета 0,05 куб. см гепарина на 2 куб. см крови) может храниться 2 дня при температуре 4 град. С.

7.4.4. Для установления градуировочной характеристики в 2 куб. см крови добавляют 0,05 куб. см раствора гепарина, вносят раствор А или Б в соответствии с табл. 1 и помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Содержимое воронки перемешивают экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме прибора.

 

Таблица 1

 

РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В КРОВИ

 

Номер раствора       

1  

2  

3  

4  

5  

6  

Объем раствора А, куб. мм   
(С = 0,01 мг/куб. см)       

20,0

40,0

100,0

-  

-  

-  

Объем раствора Б, куб. мм   
(С = 0,10 мг/куб. см)       

-  

-  

-  

20,0

50,0 

100,0

Массовая концентрация стирола
в крови, мг/куб. дм         

0,1

0,2

0,5

1,0

2,5 

5,0

 

    Режим работы хроматографа:

    колонка  стеклянная  длиной  150  мм  и  внутренним  диаметром  3,3 мм,

заполненная сорбентом Separon SGX С18;

    подвижная фаза - ацетонитрил/вода в соотношении 60:40;

    скорость подвижной фазы - 0,6 куб. см/мин.;

    длина волны УФ-детектора - 254 нм;

    время выхода стирола в заданных условиях - 6 мин.

    Градуировочную  характеристику  устанавливают с помощью градуировочного

коэффициента, который рассчитывают по формуле:

 

                                 n

                                SUM C  / S

                                i=1  i    i

                            K = -----------,

                                     n

 

    где:

    C  - заданная концентрация стирола в градуировочной смеси, мг куб./дм;

     i

    S   -  среднее значение трех измерений площади пика, кв. мм или единицы

     i

оптической плотности (е.о.п.);

    n - количество градуировочных смесей (n = 6).

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

 

7.5. Отбор проб

 

Отбор проб венозной крови в объеме 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,1 куб. см раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике - не более 2-х суток.

 

8. Выполнение измерений

 

Проводят два параллельных измерения образца крови: 2 куб. см крови помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Перемешивают содержимое воронки экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме хроматографа, указанном в п. 7.4.4.

Идентификация хроматографического пика стирола проводится путем сопоставления времен удерживания хроматографических пиков в стандартном растворе стирола и в анализируемой пробе.

 

9. Вычисление результатов измерения

 

    Концентрацию стирола в крови (мг/куб. дм) вычисляют по формуле:

 

                        Х = S  х K,

                             i

 

    где:

    Х - концентрация стирола в анализируемой пробе, мг/куб. дм;

    S  - площадь пика стирола на хроматограмме, кв. мм или е.о.п.;

     i

    K - градуировочный коэффициент.

    За  результат  измерения принимают среднее арифметическое значение двух

параллельных  определений Х   , Х   ,  расхождение между которыми не должно

                           max   min

превышать значения предела повторяемости r  (табл. 2).

                                          n

                                             _

    Результат измерения представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА) мг/куб. дм,

    где:

 

                                                   Х   + Х

    _                                          _    max   min

    Х - средний результат анализа, мг/куб. дм, Х = -----------;

                                                        2

    ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мг/куб. дм, при Р = 0,95, равная:

 

                                            _

                                    сигма х Х

                           ДЕЛЬТА = ---------,

                                       100

 

    где сигма - относительное значение характеристики погрешности, %.

 

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

 

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 2 и 3.

 

Таблица 2

 

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95

 

┌─────────────────────┬─────────────────────────┬─────────────────────────┐

     Наименование      Предел повторяемости   │Предел внутрилабораторной

    определяемого    │(относительное значение      воспроизводимости   

│компонента и диапазон│допускаемого расхождения │ (относительное значение │

      измерений,     │между двумя результатами │допускаемого расхождения │

      мг/куб. дм            параллельных      │между двумя результатами │

                        определений), r , %   │измерений, полученными в │

                                       n      │ одной лаборатории, но в

                                                  разных условиях),   

                                                       R  , %         

                                                        _             

                                                        Хl            

├─────────────────────┼─────────────────────────┼─────────────────────────┤

│Стирол,                        26,5                     27,6          

│от 0,1 до 5,0 вкл.                                                    

└─────────────────────┴─────────────────────────┴─────────────────────────┘

 

Таблица 3

 

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,

ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

 

Наименование 
определяемого
компонента и 
диапазон   
измерений,  
мг/куб. дм  
(мкг/куб. см)

Показатель    
повторяемости   
(относительное  
среднеквадратическое
отклонение    
повторяемости),  
сигма , %     
R        

Показатель    
воспроизводимости 
(относительное  
среднеквадратическое
отклонение    
воспроизводимости),
сигма , %     
R         

Показатель  
точности   
(границы   
относительной
погрешности при
вероятности 
Р = 0,95),  
+/- дельта, %

Стирол, от 0,1
до 5,0 вкл.   

10,0       

13,5       

23,0     

 

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

 

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствует началу, середине и концу диапазона измерений. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

 

10.2. Контроль повторяемости

 

    Относительное    расхождение   между   результатами   двух   измерений,

выполненных  в  соответствии  с  методикой  одним  оператором при измерении

образцов  одной  и  той  же  рабочей пробы  с использованием одних и тех же

средств  измерений  и  реактивов  в течение возможно минимального интервала

времени, не должно превышать значения предела повторяемости r  (табл. 2).

                                                             n

    Повторяемость    результатов    параллельных    определений    признают

удовлетворительной, если выполняется условие:

 

                                   r     Х    + Х

                                    n     max    min

                    Х    - Х    <= --- х -----------,

                     max    min    100        2

 

    где:

    r  - значение предела повторяемости, %;

     n

    Х   , Х    - максимальный  и  минимальный  результаты двух параллельных

     max   min

измерений содержания i-го вещества, мг/куб. дм.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

 

10.3. Контроль воспроизводимости

 

Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

 

                                    R     _    _

                                     _    Х  + Х

                        _    _       Хl    1    2

                         - Х | <= --- х -------,

                         1    2     100      2

 

    где:

    _

    Х   -  средний  результат  анализа  рабочей  пробы  из 2-х параллельных

     1

измерений, мг/куб. дм;

    _

    Х   -  средний  результат  анализа  рабочей  пробы  из 2-х параллельных

     2

измерений, полученный в других условиях, мг/куб. дм;

    R

     _  -  значение   предела   внутрилабораторной   воспроизводимости,   %

     Хl

(табл. 2).

                                               _    _

    Расхождение  между  результатами измерений Х  и Х , полученных в разных

                                                1    2

условиях, не должно превышать значений показателя   воспроизводимости   R

                                                                         _

                                                                         Хl

при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 2.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

 

10.4. Контроль точности

 

    Контроль  точности  с использованием метода добавок состоит в сравнении

результата   контрольной  процедуры,  равного  разности  между  результатом

контрольного  измерения  содержания  определяемого  компонента  в  пробе, с

                      _                                     _

известной  добавкой  (Х'),  в  рабочей  пробе  без добавки (Х) и  величиной

добавки   С    (добавка  должна  составлять  не  менее  40%  от  содержания

           д

анализируемого  компонента  в  рабочей  пробе)  с  нормативом  точности  К.

Результаты   контроля   признаются  удовлетворительными,  если  выполняется

условие:

                          _    _

                         |Х' - Х - С | = K ,

                                    д     k

 

    где:

    _

    Х'  - средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента  в  рабочей  пробе  с  известной  добавкой  из  2-х параллельных

измерений, мг/куб. дм;

    _

    Х  -  средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мг/куб. дм;

    С  - величина добавки к пробе, мг/куб. дм.

     д

 

                            ______________________________

                           /дельта   _ 2    дельта   _  2

             K = 0,84 х   /(------ х Х)  + (------ х Х') .

                        \/   100             100

 

    Качество   контрольной   процедуры   признают   удовлетворительным  при

выполнении условия: K  <= K.

                     k

При превышении норматива контроля точности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Периодичность контроля воспроизводимости и точности регламентируется в руководстве по качеству лаборатории.

 

Литература

 

1. Химическая энциклопедия/Под. ред. Н.С.Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1995. Т. 4.

2. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник. М.: "Химия", 1976. Т. 1. С. 113-117.

 

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.Д.Карнажицкая).

 

 



Все нормативно-правовые акты по медицине // Здравоохранение, здоровье, заболевания, лечение, лекарства, доктора, больницы //

Рейтинг@Mail.ru Яндекс цитирования

Copyright © Медицинский информационный ресурс www.hippocratic.ru, 2012 - 2018