"Определение массовой концентрации стирола в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. МУК 4.1.2116-06" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

9 августа 2006 года

Дата введения:

1 сентября 2006 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В ПРОБАХ КРОВИ

МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.1.2116-06

1. Область применения

Методические указания по определению концентрации стирола в крови предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием стирола в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика выполнения измерений обеспечивает определение стирола в диапазоне концентраций 0,1-5,0 мкг/куб. см с погрешностью, не превышающей 23%, при доверительной вероятности Р = 0,95.

C6H5CHCH2 Мол. масса 103,7.

Стирол (винилбензол, фенилэтилен) - бесцветная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 145 град. С, плотность 0,9059. Растворяется в большинстве органических растворителей, растворимость в воде 0,032% по объему (20 град. С) [1]. Стирол оказывает общетоксическое, сенсибилизирующее, эмбриотропное, раздражающее действия, отрицательно влияет на ЦНС, обладает кумулятивным эффектом [2].

2. Сущность метода

Методика основана на извлечении стирола из крови экстракцией гексаном и анализе экстракта на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации стирола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Нижний предел измерения - 0,001 мкг.

Определению не мешают фенол, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы, карбоновые кислоты.

Длительность анализа, включая пробоподготовку, - 20 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с насосом высокого

давления и ультрафиолетовым детектором

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-01

Гири Г2-210 ГОСТ 7328-01

Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106-00

Колбы мерные вместимостью 50 куб. см ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные вместимостью 1, 5, 10 куб. см ГОСТ 29227-91

Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73

Аттестованная смесь стирола в этиловом спирте

с концентрацией 1,00 мг/куб. см ГСО МСО 0056.1998.

3.2. Вспомогательные устройства

Колонка стеклянная длиной 150 мм и

внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная

сорбентом Separon SGX C18 зернением 7 мкм

Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон" ТУ 9443-001-245.23530-97

Экстрактор ПЭ-8 ТУ 3614-001-23050963-97

Дистиллятор ТУ 61-1-721-79

Сушильный шкаф ШСС-80 ТУ 16.531.743-83

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 23932-90

Воронка Шотта (пор 16) ГОСТ 25336-82

Бюксы СВ 19/9 ТУ 92-891.029-91

Пробирки центрифужные пропиленовые

с завинчивающейся крышкой, производство

"Sarstedt", Германия.

3.3. Реактивы

Гексан для хроматографии, осч ТУ 6-09-4521-77

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, осч ТУ 6-09-14-2167-84

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Гидроксид натрия, хч ГОСТ 4328-77

Спирт этиловый ГОСТ Р 51652-2000

Серная кислота ГОСТ 4204-77

Калия дихромат, хч ГОСТ 4220-75

Раствор гепарина в ампулах (5000 ед. в 1 куб. см).

3.4. Материалы

Гелий газообразный ТУ 51-940-80.

3.5. Растворы

Элюент для хроматографии

Раствор гидроксида натрия, 10%-й

Раствор дихромата калия в серной кислоте, 3%-й.

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химреактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.

4. Требования к безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и меры безопасности, указанные в "Руководстве по правилам эксплуатации прибора".

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и владеющие техникой жидкостно-хроматографического анализа.

6. Условия измерений

6.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15-25 град. С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С.

6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе двухромовокислого калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Элюент для хроматографии. Смешивают 60 куб. см ацетонитрила с 40 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3-5 мин. со скоростью 50-60 куб. см/мин.

7.2.2. Раствор гидроксида натрия 10%-й. Вносят в мерный стакан с меткой на 100 куб. см 10 г гидроксида натрия, прибавляют 90 куб. см дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана до полного растворения гидроксида натрия. Срок хранения раствора - 30 дней при 4 град. С.

7.2.3. Раствор двухромовокислого калия в серной кислоте 3%-й. Растворяют 3,0 г двухромовокислого калия в 53 куб. см концентрированной серной кислоты (плотность 1,84). Использовать свежеприготовленный раствор.

7.3. Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.2.1., со скоростью 0,6 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

7.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации стирола в крови, устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят разбавлением аттестованной смеси стирола в этиловом спирте (растворы А, Б).

7.4.1. Приготовление раствора А: 1 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.2. Приготовление раствора Б: 10 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.3. В соответствии с п. 8 проводят анализ образца крови на отсутствие стирола. Объем образца крови для приготовления градуировочных смесей должен быть не менее 12 куб. см. Образец крови с гепарином (из расчета 0,05 куб. см гепарина на 2 куб. см крови) может храниться 2 дня при температуре 4 град. С.

7.4.4. Для установления градуировочной характеристики в 2 куб. см крови добавляют 0,05 куб. см раствора гепарина, вносят раствор А или Б в соответствии с табл. 1 и помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Содержимое воронки перемешивают экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме прибора.

Таблица 1

РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В КРОВИ

Номер раствора	1	2	3	4	5	6
Объем раствора А, куб. мм (С = 0,01 мг/куб. см)	20,0	40,0	100,0	-	-	-
Объем раствора Б, куб. мм (С = 0,10 мг/куб. см)	-	-	-	20,0	50,0	100,0
Массовая концентрация стирола в крови, мг/куб. дм	0,1	0,2	0,5	1,0	2,5	5,0

Режим работы хроматографа:

колонка стеклянная длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм,

заполненная сорбентом Separon SGX С18;

подвижная фаза - ацетонитрил/вода в соотношении 60:40;

скорость подвижной фазы - 0,6 куб. см/мин.;

длина волны УФ-детектора - 254 нм;

время выхода стирола в заданных условиях - 6 мин.

Градуировочную характеристику устанавливают с помощью градуировочного

коэффициента, который рассчитывают по формуле:

SUM C / S

i=1 i i

K = -----------,

где:

C - заданная концентрация стирола в градуировочной смеси, мг куб./дм;

S - среднее значение трех измерений площади пика, кв. мм или единицы

оптической плотности (е.о.п.);

n - количество градуировочных смесей (n = 6).

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5. Отбор проб

Отбор проб венозной крови в объеме 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,1 куб. см раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике - не более 2-х суток.

8. Выполнение измерений

Проводят два параллельных измерения образца крови: 2 куб. см крови помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Перемешивают содержимое воронки экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме хроматографа, указанном в п. 7.4.4.

Идентификация хроматографического пика стирола проводится путем сопоставления времен удерживания хроматографических пиков в стандартном растворе стирола и в анализируемой пробе.

9. Вычисление результатов измерения

Концентрацию стирола в крови (мг/куб. дм) вычисляют по формуле:

Х = S х K,

где:

Х - концентрация стирола в анализируемой пробе, мг/куб. дм;

S - площадь пика стирола на хроматограмме, кв. мм или е.о.п.;

K - градуировочный коэффициент.

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух

параллельных определений Х , Х , расхождение между которыми не должно

max min

превышать значения предела повторяемости r (табл. 2).

Результат измерения представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА) мг/куб. дм,

где:

Х + Х

_ _ max min

Х - средний результат анализа, мг/куб. дм, Х = -----------;

ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мг/куб. дм, при Р = 0,95, равная:

сигма х Х

ДЕЛЬТА = ---------,

100

где сигма - относительное значение характеристики погрешности, %.

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95

┌─────────────────────┬─────────────────────────┬─────────────────────────┐

│ Наименование │ Предел повторяемости │Предел внутрилабораторной│

│ определяемого │(относительное значение │ воспроизводимости │

│компонента и диапазон│допускаемого расхождения │ (относительное значение │

│ измерений, │между двумя результатами │допускаемого расхождения │

│ мг/куб. дм │ параллельных │между двумя результатами │

│ │ определений), r , % │измерений, полученными в │

│ │ n │ одной лаборатории, но в │

│ │ │ разных условиях), │

│ │ │ R , % │

│ │ │ _ │

│ │ │ Хl │

├─────────────────────┼─────────────────────────┼─────────────────────────┤

│Стирол, │ 26,5 │ 27,6 │

│от 0,1 до 5,0 вкл. │ │ │

└─────────────────────┴─────────────────────────┴─────────────────────────┘

Таблица 3

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,

ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мг/куб. дм (мкг/куб. см)	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), сигма , % R	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), сигма , % R	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности Р = 0,95), +/- дельта, %
Стирол, от 0,1 до 5,0 вкл.	10,0	13,5	23,0

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствует началу, середине и концу диапазона измерений. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений,

выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении

образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же

средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала

времени, не должно превышать значения предела повторяемости r (табл. 2).

Повторяемость результатов параллельных определений признают

удовлетворительной, если выполняется условие:

r Х + Х

n max min

Х - Х <= --- х -----------,

max min 100 2

где:

r - значение предела повторяемости, %;

Х , Х - максимальный и минимальный результаты двух параллельных

max min

измерений содержания i-го вещества, мг/куб. дм.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

R _ _

_ Х + Х

_ _ Хl 1 2

|Х - Х | <= --- х -------,

1 2 100 2

где:

Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных

измерений, мг/куб. дм;

Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных

измерений, полученный в других условиях, мг/куб. дм;

_ - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, %

Хl

(табл. 2).

_ _

Расхождение между результатами измерений Х и Х , полученных в разных

1 2

условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R

Хl

при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 2.

10.4. Контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении

результата контрольной процедуры, равного разности между результатом

контрольного измерения содержания определяемого компонента в пробе, с

_ _

известной добавкой (Х'), в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной

добавки С (добавка должна составлять не менее 40% от содержания

анализируемого компонента в рабочей пробе) с нормативом точности К.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется

условие:

_ _

|Х' - Х - С | = K ,

д k

где:

Х' - средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных

измерений, мг/куб. дм;

Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мг/куб. дм;

С - величина добавки к пробе, мг/куб. дм.

______________________________

/дельта _ 2 дельта _ 2

K = 0,84 х /(------ х Х) + (------ х Х') .

\/ 100 100

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительным при

выполнении условия: K <= K.

При превышении норматива контроля точности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Периодичность контроля воспроизводимости и точности регламентируется в руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Химическая энциклопедия/Под. ред. Н.С.Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1995. Т. 4.

2. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник. М.: "Химия", 1976. Т. 1. С. 113-117.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.Д.Карнажицкая).