УТВЕРЖДАЮ
Первый заместитель Министра
здравоохранения России
Г.Г.ОНИЩЕНКО
3 февраля 1997 г. N МУ-8-12
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ДЕТЕКЦИИ БРУЦЕЛЛ В РАЗЛИЧНОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Аннотация
Методические рекомендации предназначены
для работников научно-исследовательских и практических учреждений, занимающихся
вопросами идентификации микроорганизмов.
Рекомендации разработали сотрудники
Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего
Востока М.Ю.Шестопалов, С.В.Балахонов,
А.И. Калиновский.
Введение
Сохраняющаяся высокая заболеваемость
бруцеллезом людей и животных оставляет актуальным вопрос о ранней и эффективной
диагностике этого заболевания. Существующие методы либо длительны и многоэтапны (бактериологический), либо не исключают
перекрестных ложноположительных результатов с представителями других таксонов
бактерий, имеющих антигенное сходство с бруцеллами
(комплекс иммунологических тестов).
Перспективным подходом к решению этого
вопроса в лабораторной диагностике является использование полимеразной цепной
реакции (ПЦР), превосходящей на несколько порядков по чувствительности и
специфичности традиционные иммунологические тесты и позволяющей работать с исследуемым
материалом без выделения чистой культуры. Данный метод дает возможность
обнаруживать единичные клетки бруцелл в различном
биологическом материале: крови, сыворотке крови, молоке, моче, гистологическом
материале, объектах окружающей среды в ранние - от 4 до 6 часов - сроки, высокоспецифичен и максимально адаптирован к существующей
лабораторной базе.
Принцип метода
Полимеразная цепная реакция открывает возможность
многократно
амплифицировать (синтезировать) в пробирке участок
хромосомной ДНК
бруцелл размером 269 пар, нуклеотидов, являющейся
фрагментом гена
оболочечного белка,
с молекулярной массой
31 кД. Фрагмент,
специфичный
только для микроорганизмов рода Brucella,
ограничен
парой олигонуклеотидных праймеров, с которых термостабильная
ДНК-полимераза
осуществляет синтез этого участка ДНК в присутствии
4-дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и
солевого буфера,
2+
содержащего ионы
магния (Mg ) и
бычий сывороточный альбумин
(BSA).
Синтез возможен только тогда, когда
вносимая ДНК, выделенная из исследуемой пробы, окажется идентичной
(комплементарной) праймерам, в противном случае
амплификации не будет. Результат амплификации легко визуализируется, например,
методом электрофореза в агарозном геле.
ПЦР состоит из цикла повторяющихся
температурных режимов:
94 град. С - 35 сек. - денатурация
(расхождение) двойной цепи исследуемой ДНК до двух одиночных;
52 град. С - 35 сек. - присоединение
("отжиг") праймеров к идентичным участкам
на одиночных цепях исследуемой ДНК;
72 град. С - 35 сек. - синтез
специфичного участка ДНК, Tag-полимеразой, путем
удлинения праймеров.
За
каждый такой цикл
происходит удвоение числа копий этого
n
участка ДНК, что можно выразить как 2 , где n -
количество циклов
амплификации. Таким
образом, за 40-50
циклов амплифицируется
фрагмент ДНК, в
достаточном количестве для обнаружения его методом
гель-электрофореза.
В целом же вся процедура ПЦР-диагностики
состоит из 3 этапов:
1) Выделение ДНК из исследуемого
материала
2) ПЦР
3) Учет результатов ПЦР.
Лабораторное
оборудование
1. Микроцентрифуга
на 12000-14000 об./мин.
2. Автоматические микропипетки на 20, 200
и 1000 мкл
3. Одноразовые наконечники к пипеткам на
200 мкл
4. Наконечники к пипеткам на 1000 мкл
5. Пластиковые микропробирки
объемом 500 мкл
6. Пластиковые микропробирки
объемом 1500 мкл
7. ДНК-амплификатор
с программным обеспечением (МС-2) или аналогичный
8. УФ-трансиллюминатор
9. Фотоаппарат с красным или оранжевым
светофильтром
10. Негативная фотопленка (типа ФН-64,
"Микрат-300")
11. Аппарат для горизонтального
гель-электрофореза
12. Источник напряжения постоянного тока.
Химические реактивы
NaOH (категории х.ч. или ч.д.а.)
NaCl (х.ч.)
96% этанол
Трис-ОН (Трис-основной, м.в.
121.1)
ЭДТА x Na2 ("Трилон-Б")
H3BO3 (Борная кислота)
Агароза (желательно использовать агарозу с низким электроэндоосмосом и
высокой плотностью геля, например, фирмы SIGMA type 1
или 2)
Бромистый этидий
Мертиолят натрия
HCl концентрированная
Бромфеноловый синий
Глицерин.
Растворы для
выделения ДНК из проб
10 М NaOH
(хранить в полиэтиленовом флаконе)
5 М NaCl
96% этанол
80% этанол
ТЕ-буфер: 10 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА (стерилизовать автоклавированием).
Компоненты для
проведения ПЦР и гель-электрофореза
1. Солевой ПЦР-буфер для проведения
амплификации 10х:
100 мМ Трис-HCl, pH 8,5 при 37 град. С
100 мМ MgCl2
1000 мМ KCl
2. 2,5 мМ раствор
dNTP
3. Водный раствор BSA 2 мг/мл
4. Дистиллированная или бидистиллированная
вода
5. Олигонуклеотидные
праймеры:
Bru 1 5'-GCA
GTC AGA CGT TGC CTA TT-3'
Bru 2 5'-GTC TGA GGT
GTT CAG CCT Т-3'.
Приготовление лизирующего раствора и выделение ДНК из проб
Приготовление растворов, выделение ДНК,
ПЦР и гель-электрофорез осуществляют в раздельных помещениях для предотвращения
контаминации компонентов, проб и оборудования.
Для выделения ДНК из одной пробы объемом
10 мкл приготавливают щелочной, лизирующе-осаждающий
раствор следующего состава:
1. 13 мкл 10 М NaOH
2. 22 мкл
дистиллированной воды
3. 3 мкл 5 М NaCl
4. 144 мкл 96%
этанола.
Общий объем этой смеси составляет 182 мкл. Данный раствор можно приготовить в отдельных пробирках
объемом 1,5 мл (последовательно добавляя все четыре указанных компонента) перед
внесением в них проб, либо в отдельном полиэтиленовом или пластиковом флаконе с
расчетом на все число проб плюс одна (учитывая погрешности микропипеток).
Щелочной раствор приготавливают перед выделением ДНК из проб и впрок не
заготавливают.
Исследуемую пробу объемом 10 мкл добавляют в микроцентрифужную
пробирку на 1,5 мл, содержащую 182 мкл щелочного, лизирующе-осаждающего раствора и сразу же перемешивают
путем легкого встряхивания. Пробирку выдерживают при комнатной температуре 10 -
15 мин. Пробу центрифугируют 5 мин. при 12000 - 14000 об./мин., супернатант сливают,
остаткам раствора в пробирке дают стечь на фильтровальную бумагу.
К осадку на дне пробирки (который может
быть малозаметен) добавляют 500 мкл 80% этанола,
пробирку несколько раз осторожно переворачивают и центрифугируют 2 минуты при
12000 - 14000 об./мин. Этанол
сливают, а пробирку подсушивают на фильтровальной бумаге в течение 5 - 10 мин.
К осадку добавляют 30 мкл ТЕ-буфера или
дистиллированной воды и содержимое пробирки перемешивают путем пипетирования в отдельном стерильном наконечнике.
Примечания. 1. ДНК можно выделять из проб
менее и более 10 мкл - тогда соответственно
необходимо сделать количественный пересчет компонентов щелочного, лизирующе-осаждающего раствора.
2. Выделенные препараты ДНК можно хранить
в условиях холодильника в течение 1 месяца.
Проведение ПЦР
ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников
для внесения всех компонентов амплификационной смеси.
Подготавливают и
пронумеровывают пробирки на 500 мкл по числу
исследуемых проб, плюс три пробирки: для положительного и отрицательного
контролей и разведенной в 10 раз дистилированной
водой Tag-ДНК-полимеразы.
На одну пробу готовят амплификационную
смесь объемом 25 мкл следующего состава:
1) 1 мкл
ПЦР-буфера
2) 1 мкл dNTP
3) 1 мкл BSA
4) Дистиллированной воды до 20 мкл, в зависимости от количества вносимых, праймеров
5) 4 pmol (пикомоля) каждого праймера
6) 0,2 мкл Tag-ДНК-полимеразы в 2 мкл
дистиллированной воды
7) 3 мкл
исследуемой пробы.
Исследуемую пробу всегда вносят в
последнюю очередь, после чего всю смесь перемешивают пипетированием
и закрывают 85 мкл вазелинового масла (три капли из
наконечника объемом 200 мкл). В качестве
положительного контроля используют ДНК B. melitensis
Rev-1 или B. abortus 19-BA, выделенные описанным
щелочным методом, в отрицательном контроле используется дистиллированная вода
вместо анализируемой пробы.
Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей температурно-временной программой
одного цикла:
94 град. С - 35 сек.;
52 град. С - 35 сек.;
72 град. С - 35 сек.
Количество циклов 50. За это время в
каждом цикле происходит удвоение числа копий ограниченного праймерами
участка хромосомной ДНК, причем, каждая вновь синтезируемая цепь становится
матрицей для присоединения праймеров и снова амплифицируется, что позволяет за 50 циклов синтезировать
фрагмент ДНК в количестве достаточном для обнаружения его с помощью электрофореза
в агарозном геле.
Примечания. 1. Солевой ПЦР-буфер, раствор
dNTP, раствор BSA, праймеры,
Tag-ДНК-полимераза обязательно хранят в морозильнике
и размораживают (кроме Tag-ДНК-полимеразы) перед
приготовлением амплификационной смеси.
2. Амплификационную
смесь, состоящую из ПЦР-буфера, dNTP, BSA и воды
можно приготовить заранее в достаточных количествах и заморозить небольшими аликвотами.
Гель-электрофорез
продукта ПЦР
После завершения программы амплификации,
пробы смешивают с 2,5 мкл раствора для нанесения проб
и помещают в лунки горизонтального 1,5% агарозного
геля, содержащего 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
Электрофорез проводят в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряжении 30 В/см в течение 25 мин., не допуская выхода красителя бромфенолового синего из геля.
Гель просматривают в Уф-свете
и результат фоторегистрируют. Амплифицированные
фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая флюоресцирующие при 254 - 302 нм в геле полосы анализируемых проб, с полосой положительного
контроля. Положительными могут считаться только те пробы, амплифицированные
фрагменты которых (флюоресцирующие полоски в геле) находятся строго на уровне
фрагмента положительного контроля.
Данный метод детекции
бруцелл, с используемыми праймерами
и представленными температурно-временными параметрами, позволяет обнаруживать
единичные клетки в пробе за 50 циклов амплификации у всех представителей рода Brucella, что выражается флюоресцирующей полосой в геле агарозы, размером 269 пар нуклеотидов.
Примечание. Бромистый
этидий является сильным мутагеном, поэтому все
работы, связанные с перемещением агарозного геля,
проводите в перчатках.