Оставьте ссылку на эту страницу в соцсетях:

Поиск по базе документов:

 

УТВЕРЖДАЮ

Первый заместитель Министра

здравоохранения России

Г.Г.ОНИЩЕНКО

3 февраля 1997 г. N МУ-8-12

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПО ДЕТЕКЦИИ БРУЦЕЛЛ В РАЗЛИЧНОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

 

Аннотация

 

Методические рекомендации предназначены для работников научно-исследовательских и практических учреждений, занимающихся вопросами идентификации микроорганизмов.

Рекомендации разработали сотрудники Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока М.Ю.Шестопалов, С.В.Балахонов, А.И. Калиновский.

 

Введение

 

Сохраняющаяся высокая заболеваемость бруцеллезом людей и животных оставляет актуальным вопрос о ранней и эффективной диагностике этого заболевания. Существующие методы либо длительны и многоэтапны (бактериологический), либо не исключают перекрестных ложноположительных результатов с представителями других таксонов бактерий, имеющих антигенное сходство с бруцеллами (комплекс иммунологических тестов).

Перспективным подходом к решению этого вопроса в лабораторной диагностике является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР), превосходящей на несколько порядков по чувствительности и специфичности традиционные иммунологические тесты и позволяющей работать с исследуемым материалом без выделения чистой культуры. Данный метод дает возможность обнаруживать единичные клетки бруцелл в различном биологическом материале: крови, сыворотке крови, молоке, моче, гистологическом материале, объектах окружающей среды в ранние - от 4 до 6 часов - сроки, высокоспецифичен и максимально адаптирован к существующей лабораторной базе.

 

Принцип метода

 

    Полимеразная  цепная реакция открывает возможность многократно

амплифицировать (синтезировать) в пробирке участок хромосомной ДНК

бруцелл  размером 269 пар, нуклеотидов, являющейся фрагментом гена

оболочечного   белка,  с  молекулярной  массой  31  кД.  Фрагмент,

специфичный  только  для  микроорганизмов рода Brucella, ограничен

парой   олигонуклеотидных  праймеров,  с  которых  термостабильная

ДНК-полимераза осуществляет синтез этого участка ДНК в присутствии

4-дезоксинуклеозидтрифосфатов    (dNTP)    и    солевого   буфера,

                               2+

содержащего  ионы   магния  (Mg  )  и  бычий сывороточный альбумин

(BSA).

Синтез возможен только тогда, когда вносимая ДНК, выделенная из исследуемой пробы, окажется идентичной (комплементарной) праймерам, в противном случае амплификации не будет. Результат амплификации легко визуализируется, например, методом электрофореза в агарозном геле.

ПЦР состоит из цикла повторяющихся температурных режимов:

94 град. С - 35 сек. - денатурация (расхождение) двойной цепи исследуемой ДНК до двух одиночных;

52 град. С - 35 сек. - присоединение ("отжиг") праймеров к идентичным участкам на одиночных цепях исследуемой ДНК;

72 град. С - 35 сек. - синтез специфичного участка ДНК, Tag-полимеразой, путем удлинения праймеров.

    За  каждый  такой  цикл  происходит удвоение числа копий этого

                                      n

участка  ДНК, что можно выразить как 2 , где n - количество циклов

амплификации.  Таким  образом,  за  40-50  циклов  амплифицируется

фрагмент ДНК, в достаточном количестве для обнаружения его методом

гель-электрофореза.

В целом же вся процедура ПЦР-диагностики состоит из 3 этапов:

1) Выделение ДНК из исследуемого материала

2) ПЦР

3) Учет результатов ПЦР.

 

Лабораторное оборудование

 

1. Микроцентрифуга на 12000-14000 об./мин.

2. Автоматические микропипетки на 20, 200 и 1000 мкл

3. Одноразовые наконечники к пипеткам на 200 мкл

4. Наконечники к пипеткам на 1000 мкл

5. Пластиковые микропробирки объемом 500 мкл

6. Пластиковые микропробирки объемом 1500 мкл

7. ДНК-амплификатор с программным обеспечением (МС-2) или аналогичный

8. УФ-трансиллюминатор

9. Фотоаппарат с красным или оранжевым светофильтром

10. Негативная фотопленка (типа ФН-64, "Микрат-300")

11. Аппарат для горизонтального гель-электрофореза

12. Источник напряжения постоянного тока.

 

Химические реактивы

 

NaOH (категории х.ч. или ч.д.а.)

NaCl (х.ч.)

96% этанол

Трис-ОН (Трис-основной, м.в. 121.1)

ЭДТА x Na2 ("Трилон-Б")

H3BO3 (Борная кислота)

Агароза (желательно использовать агарозу с низким электроэндоосмосом и высокой плотностью геля, например, фирмы SIGMA type 1 или 2)

Бромистый этидий

Мертиолят натрия

HCl концентрированная

Бромфеноловый синий

Глицерин.

 

Растворы для выделения ДНК из проб

 

10 М NaOH (хранить в полиэтиленовом флаконе)

5 М NaCl

96% этанол

80% этанол

ТЕ-буфер: 10 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА (стерилизовать автоклавированием).

 

Компоненты для проведения ПЦР и гель-электрофореза

 

    1. Солевой ПЦР-буфер для проведения амплификации 10х:

       100 мМ Трис-HCl, pH 8,5 при 37 град. С

       100 мМ MgCl2

       1000 мМ KCl

    2. 2,5 мМ раствор dNTP

    3. Водный раствор BSA 2 мг/мл

    4. Дистиллированная или бидистиллированная вода

    5. Олигонуклеотидные праймеры:

       Bru 1 5'-GCA GTC AGA CGT TGC CTA TT-3'

       Bru 2 5'-GTC TGA GGT GTT CAG CCT Т-3'.

 

Приготовление лизирующего раствора и выделение ДНК из проб

 

Приготовление растворов, выделение ДНК, ПЦР и гель-электрофорез осуществляют в раздельных помещениях для предотвращения контаминации компонентов, проб и оборудования.

Для выделения ДНК из одной пробы объемом 10 мкл приготавливают щелочной, лизирующе-осаждающий раствор следующего состава:

1. 13 мкл 10 М NaOH

2. 22 мкл дистиллированной воды

3. 3 мкл 5 М NaCl

4. 144 мкл 96% этанола.

Общий объем этой смеси составляет 182 мкл. Данный раствор можно приготовить в отдельных пробирках объемом 1,5 мл (последовательно добавляя все четыре указанных компонента) перед внесением в них проб, либо в отдельном полиэтиленовом или пластиковом флаконе с расчетом на все число проб плюс одна (учитывая погрешности микропипеток). Щелочной раствор приготавливают перед выделением ДНК из проб и впрок не заготавливают.

Исследуемую пробу объемом 10 мкл добавляют в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл, содержащую 182 мкл щелочного, лизирующе-осаждающего раствора и сразу же перемешивают путем легкого встряхивания. Пробирку выдерживают при комнатной температуре 10 - 15 мин. Пробу центрифугируют 5 мин. при 12000 - 14000 об./мин., супернатант сливают, остаткам раствора в пробирке дают стечь на фильтровальную бумагу.

К осадку на дне пробирки (который может быть малозаметен) добавляют 500 мкл 80% этанола, пробирку несколько раз осторожно переворачивают и центрифугируют 2 минуты при 12000 - 14000 об./мин. Этанол сливают, а пробирку подсушивают на фильтровальной бумаге в течение 5 - 10 мин. К осадку добавляют 30 мкл ТЕ-буфера или дистиллированной воды и содержимое пробирки перемешивают путем пипетирования в отдельном стерильном наконечнике.

Примечания. 1. ДНК можно выделять из проб менее и более 10 мкл - тогда соответственно необходимо сделать количественный пересчет компонентов щелочного, лизирующе-осаждающего раствора.

2. Выделенные препараты ДНК можно хранить в условиях холодильника в течение 1 месяца.

 

Проведение ПЦР

 

ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников для внесения всех компонентов амплификационной смеси.

Подготавливают и пронумеровывают пробирки на 500 мкл по числу исследуемых проб, плюс три пробирки: для положительного и отрицательного контролей и разведенной в 10 раз дистилированной водой Tag-ДНК-полимеразы.

На одну пробу готовят амплификационную смесь объемом 25 мкл следующего состава:

1) 1 мкл ПЦР-буфера

2) 1 мкл dNTP

3) 1 мкл BSA

4) Дистиллированной воды до 20 мкл, в зависимости от количества вносимых, праймеров

5) 4 pmol (пикомоля) каждого праймера

6) 0,2 мкл Tag-ДНК-полимеразы в 2 мкл дистиллированной воды

7) 3 мкл исследуемой пробы.

Исследуемую пробу всегда вносят в последнюю очередь, после чего всю смесь перемешивают пипетированием и закрывают 85 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В качестве положительного контроля используют ДНК B. melitensis Rev-1 или B. abortus 19-BA, выделенные описанным щелочным методом, в отрицательном контроле используется дистиллированная вода вместо анализируемой пробы.

Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей температурно-временной программой одного цикла:

94 град. С - 35 сек.;

52 град. С - 35 сек.;

72 град. С - 35 сек.

Количество циклов 50. За это время в каждом цикле происходит удвоение числа копий ограниченного праймерами участка хромосомной ДНК, причем, каждая вновь синтезируемая цепь становится матрицей для присоединения праймеров и снова амплифицируется, что позволяет за 50 циклов синтезировать фрагмент ДНК в количестве достаточном для обнаружения его с помощью электрофореза в агарозном геле.

Примечания. 1. Солевой ПЦР-буфер, раствор dNTP, раствор BSA, праймеры, Tag-ДНК-полимераза обязательно хранят в морозильнике и размораживают (кроме Tag-ДНК-полимеразы) перед приготовлением амплификационной смеси.

2. Амплификационную смесь, состоящую из ПЦР-буфера, dNTP, BSA и воды можно приготовить заранее в достаточных количествах и заморозить небольшими аликвотами.

 

Гель-электрофорез продукта ПЦР

 

После завершения программы амплификации, пробы смешивают с 2,5 мкл раствора для нанесения проб и помещают в лунки горизонтального 1,5% агарозного геля, содержащего 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Электрофорез проводят в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряжении 30 В/см в течение 25 мин., не допуская выхода красителя бромфенолового синего из геля.

Гель просматривают в Уф-свете и результат фоторегистрируют. Амплифицированные фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая флюоресцирующие при 254 - 302 нм в геле полосы анализируемых проб, с полосой положительного контроля. Положительными могут считаться только те пробы, амплифицированные фрагменты которых (флюоресцирующие полоски в геле) находятся строго на уровне фрагмента положительного контроля.

Данный метод детекции бруцелл, с используемыми праймерами и представленными температурно-временными параметрами, позволяет обнаруживать единичные клетки в пробе за 50 циклов амплификации у всех представителей рода Brucella, что выражается флюоресцирующей полосой в геле агарозы, размером 269 пар нуклеотидов.

Примечание. Бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все работы, связанные с перемещением агарозного геля, проводите в перчатках.

 

 



Все нормативно-правовые акты по медицине // Здравоохранение, здоровье, заболевания, лечение, лекарства, доктора, больницы //

Рейтинг@Mail.ru Яндекс цитирования

Copyright © Медицинский информационный ресурс www.hippocratic.ru, 2012 - 2018