Оставьте ссылку на эту страницу в соцсетях:

Поиск по базе документов:

 

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

ПРИКАЗ

 

14 апреля 1999 г.

 

N 125

 

ОБ УСИЛЕНИИ МЕРОПРИЯТИЙ ПО ПРОФИЛАКТИКЕ ТУЛЯРЕМИИ

 

Актуальность проблемы профилактики туляремии определяется наличием природных очагов этой инфекции практически на всей территории Российской Федерации, эпизоотическая активность которых ежегодно подтверждается обнаружением значительного числа положительных на туляремию проб из объектов внешней среды. С 1996 по 1998 год центрами госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации и противочумными учреждениями было выделено более 200 штаммов возбудителя туляремии от носителей, переносчиков инфекции и внешней среды.

Ежегодно в стране регистрируется от 100 до 400 случаев заболеваний, при этом около 75% из них приходится на Северный, Центральный и Западно - Сибирский районы России, продолжают иметь место вспышки этой инфекции. В 1993-1998 годах вспышки туляремии трансмиссивного характера зарегистрированы среди населения в Ростовской области и Республике Башкортостан, водного - в Смоленской области, промыслового - в Оренбургской области, пищевого (молочного) - в г. Москве. Особенностью заболеваемости туляремией в настоящее время является то, что среди заболевших более 70% составляют непривитые против этой инфекции городские жители.

В последние годы отмечается снижение уровня эпидемиологического надзора за туляремией, сокращение кратности эпизоотологических обследований природных очагов, количества лабораторных исследований, объемов профилактической иммунизации населения

Такое положение связано с ослаблением внимания руководителей учреждений госсанэпиднадзора и здравоохранения к этой проблеме, недостаточной укомплектованностью или отсутствием в центрах госсанэпиднадзора специалистов зоологов и энтомологов, сокращением финансирования работ по проведению обследований природных очагов, неудовлетворительной организацией работ, направленных на подавление численности носителей и переносчиков инфекции в природных условиях, низким уровнем подготовки специалистов лечебно - профилактических учреждений по ранней и дифференциальной диагностике этой инфекции. Население недостаточно информировано по вопросам личной и общественной профилактики туляремии.

В целях повышения эффективности мероприятий по профилактике туляремии, снижения риска заражения и предупреждения массовых заболеваний людей этой инфекцией

ПРИКАЗЫВАЮ:

1. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации, главным врачам центров госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации, регионах на транспорте (водном, воздушном):

1.1. Организовать проведение профилактических, санитарно - противоэпидемических, лечебно - диагностических мероприятий по профилактике и борьбе с туляремией в соответствии с методическими указаниями:

1.1.1. "Эпидемиологический надзор за туляремийной инфекцией" (приложение 1);

1.1.2."Эпизоотологический мониторинг за природными очагами туляремии" (приложение 2);

1.1.3."Клиника, диагностика и лечение туляремии" (приложение 3);

1.1.4. "Лабораторная диагностика туляремии" (приложение 4);

1.1.5."Профилактика туляремии" (приложение 5).

1.2. Обеспечить раннюю диагностику, обследование больных с неясной этиологией (лимфадениты, затяжные пневмонии, ангины, длительные лихорадочные состояния, конъюнктивиты Парино и др.) с использованием современных высокочувствительных методов диагностики и эффективное этиотропное лечение выявленных больных.

1.3. Обеспечить организацию профилактической иммунизации населения против туляремии с учетом данных эпизоотоло - эпидемиологического надзора, состояния иммунного статуса населения, проживающего на территории природных очагов туляремии, а также городских жителей, подвергающихся высокому риску инфицирования при выезде в природные очаги этой инфекции.

1.4. Улучшить качество планирования и проведения профилактической иммунизации, предусмотрев, в первую очередь, обеспечение учреждений здравоохранения необходимым количеством вакцины против туляремии, а также медицинскими иммунобиологическими препаратами для определения иммунного статуса населения.

1.5. Проводить ежегодно семинары для специалистов лечебно - профилактических учреждений и госсанэпидслужбы по вопросам эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики туляремии.

1.6. Осуществлять постоянную разъяснительную работу для населения по профилактике туляремии, прежде всего на эндемичных территориях, в том числе через средства массовой информации.

2. Главным врачам центров госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации, регионах на транспорте (водном, воздушном):

2.1. Осуществлять постоянный эпизоотологический мониторинг за состоянием природных очагов туляремии с использованием комплекса бактериологических, серологических и генодиагностических методов исследования, обеспечивая полноту и своевременность эпизоотологических обследований, а также проводить целевое обследование новых потенциально опасных территорий с целью своевременного выявления природных очагов туляремии.

2.2. Усилить государственный санитарно - эпидемиологический надзор за выполнением мероприятий по защите пищевых продуктов и водных источников от инфицирования возбудителем туляремии и соблюдением мер безопасности при работе с возможными источниками туляремийной инфекции.

2.3. Совместно с заинтересованными ведомствами и учреждениями обеспечить проведение необходимого комплекса санитарно - технических, санитарно - гигиенических, дератизационных и дезинсекционных мероприятий по борьбе с носителями и переносчиками инфекции.

2.4. Укомплектовать центры госсанэпиднадзора специалистами зоологами и энтомологами.

2.5. Обеспечить подготовку ежегодных прогнозов численности носителей и переносчиков, эпизоотического и эпидемического состояния природных очагов и доводить их до сведения руководителей органов исполнительной власти субъектов Российской Федерации, органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации и других заинтересованных ведомств.

2.6.0беспечить представление прогнозов в Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России к 15 ноября и поправок к ним к 15 июня ежегодно.

2.7. Решение вопроса о снятии энзоотичности территорий согласовывать с Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России.

2.8. Принять необходимые меры по обеспечению специалистов, осуществляющих эпизоотолого - эпидемиологический надзор за зоонозными и природно - очаговыми инфекциями всеми необходимыми индивидуальными и материально - техническими средствами (специальной одеждой, орудиями лова и другим оборудованием).

2.9. Направлять в Противочумный центр Минздрава России копии карт эпидобследования очага на все случаи туляремии.

3. Федеральному центру госсанэпиднадзора Минздрава России совместно с Противочумным центром Минздрава России обеспечить подготовку прогнозов численности носителей и переносчиков, эпизоотического и эпидемического состояния природных очагов в Российской Федерации и представлять их в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России к 15 марта и 15 августа ежегодно.

4. Ставропольскому научно - исследовательскому противочумному институту Минздрава России завершить в 1999 году разработку иммуноферментной тест - системы для выявления туляремийного антигена.

5. Государственному научно - исследовательскому институту стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им.Л А. Тарасевича Минздрава России:

5.1. Ускорить рассмотрение и утверждение научно - технической документации на эритроцитарный иммуноглобулиновый и антигенный туляремийный диагностикумы.

5.2. Рассмотреть до 01.07.99 вопрос о проведении регулярного контроля за состоянием иммунобиологических свойств вакцинного штамма продуцента живой туляремийной вакцины на базе лаборатории туляремии научно - исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

6. Департаменту госсанэпиднадзора в течение 1999 года рассмотреть вопрос об организации производства диагностикумов эритроцитарных туляремийных иммуноглобулиновых и антигенных.

7. Департаменту организации медицинской помощи населению, Управлению охраны здоровья матери и ребенка до 01.10.99 разработать и представить на утверждение протоколы (стандарты) диагностики и лечения больных туляремией.

8. Считать недействующими на территории Российской Федерации:

8.1. Приказ Минздрава СССР от 05.02.76 N 133 "О мероприятиях по профилактике заболеваний людей туляремией".

8.2. Приказ Минздрава СССР от 19.05.83 N 601 "О совершенствовании эпизоотологических прогнозов о туляремии".

8.3. Инструкцию по лабораторной диагностике туляремии у людей, утвержденную Минздравом СССР 25.06.81 N 28-6/3.

8.4. Методические указания по поиску и изучению эпизоотий туляремии путем обнаружения антигена возбудителя в погадках птиц и помете хищных млекопитающих, утвержденные Минздравом СССР 10.10.73 N 1125-73.

8.5. Методические указания по лабораторным методам диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии, утвержденные Минздравом СССР 12.09.83 N 28-6/23.

9. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на Первого заместителя министра здравоохранения Российской Федерации Онищенко Г.Г.

 

Министр

здравоохранения

Российской Федерации

В.И.СТАРОДУБОВ

 

 

 

 

 

Приложение N 1

к приказу Министерства

здравоохранения

Российской Федерации

от 14.04.1999 г. N 125

 

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

 

(Методические указания)

 

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТУЛЯРЕМИИ

 

Характерной особенностью эпидемиологии туляремии является множественность механизмов заражения и путей передачи возбудителя инфекции, почти 100% восприимчивость к ней людей, без различий пола и возраста, отсутствие передачи инфекции от человека к человеку.

Заражение людей происходит в природных (или во вторичных синантропных) очагах этой инфекции. Трансмиссивный (инокулятивный) механизм заражения человека осуществляется в результате укусов инфицированными кровососущими членистоногими (комарами, слепнями, клещами); контактный - происходит через поврежденные кожные и слизистые покровы при соприкосновении с больными или павшими грызунами и зайцами; алиментарный - при употреблении инфицированных больными грызунами продуктов питания (хлеб, печенье, сухари и т.д.), сельскохозяйственной продукции (зерно, свекла и т.д.) и воды (колодезной, горных ручьев и других открытых водоемов): аспирационный - при вдыхании воздушно - пылевого аэрозоля, образующегося при переработке зерна и перекладке сена, соломы, инфицированных больными грызунами, а также в результате вдыхания капельно - жидкого аэрозоля, образующегося в процессе мойки и резки свеклы и других кормов, контаминированных выделениями больных туляремией грызунов. На риск заражения оказывают влияние особенности того или иного типа природного очага, а также формы хозяйственной деятельности, в процессе которой осуществляется взаимодействие человека с природными очагами.

Зарегистрированы случаи заболевания людей на производствах, связанных с переработкой природного сырья (сахарные, крахмало - паточные, спиртовые, пеньковые заводы, элеваторы и т.п.), на мясокомбинатах, при забое овец и крупного рогатого скота, на котором имелись инфицированные клещи, на окраинах городов, расположенных вблизи природных очагов. Известны случаи завоза инфекции при транспортировке продуктов и сырья из неблагополучных по туляремии районов.

В настоящее время заболевания туляремией регистрируются в виде спорадических случаев или эпидемических вспышек разной интенсивности. Число случаев туляремии в последнее десятилетие колеблется от 100 до 400 в год, при этом около 75% заболеваний зарегистрировано в трех районах Российской Федерации: Северном, Центральном и Западно - Сибирском. Характерной особенностью заболеваемости последних лет является существенное увеличение доли больных среди жителей городов (до 70-75% от общего числа случаев).

В соответствии с разнообразием механизмов заражения людей, а также с условиями, при которых произошло заражение, различают следующие основные эпидемиологические типы заболеваемости людей туляремией:

1) Трансмиссивный тип.

а. Источниками инфекции являются водяные полевки, реже - зайцы. Механизм заражения людей - трансмиссивный через укус двукрылых (комаров, слепней) или контактный при раздавливании инфицированного насекомого на коже или попадании его в глаз. Преобладают язвенно - бубонная и бубонная формы заболевания. Заболевания происходят чаще в пойменно - болотных природных очагах во время сенокоса, охоты, рыбалки и другой работы вблизи водоемов. Заболевания начинают регистрировать в конце июня, наибольший подъем - в августе и последние случаи - в сентябре. Типичным примером явилась крупная трансмиссивная вспышка туляремии, имевшая место в 1993 году в Ростовской области и охватившая свыше 200 человек.

б. Источниками инфекции служат восточно - европейская и обыкновенная полевки, хомяки, зайцы и другие млекопитающие. Заражение людей происходит через иксодовых клещей. Формы заболевания такие же, как при варианте "а" Заболевания регистрируют весной и осенью в степных, луго - полевых и реже - в лесных природных очагах туляремии.

2). Промысловый тип. Заражение людей происходит при промысле водяных полевок, хомяков, зайцев, ондатр, кротов. Механизм заражения - контактный, через скарифицированные кожные покровы, но могут иметь место алиментарный и аспирационный механизмы заражения. Преобладает бубонная форма заболевания, реже встречается язвенно - бубонная, ангинозно - бубонная, глазно - бубонная и другие.

3). Охотничье - пищевой тип. Заражение людей происходит во время охоты на зайцев, ондатр и других млекопитающих, при снятии шкурок, разделке тушек и употреблении в пищу недостаточно обработанного термически или малосольного мяса, а также при втирании инфицированными руками возбудителя в слизистую оболочку глаза. Преобладают контактный и алиментарный механизмы заражения.

На весну приходится более 1/3 годовых заражений от зайцев. Второй подъем заболеваний регистрируют осенью, в начале сезона охоты. В годы интенсивных эпизоотий на мышевидных грызунах отмечается третий, зимний подъем заболеваемости. При этом возможны заражения охотников, ночующих в стогах сена и соломы, в которых много мышевидных грызунов. Клинические формы самые разнообразные. Преобладает бубонная, язвенно - бубонная и абдоминальная. В 25% случаев заболевают как сами охотники, так и члены их семей.

Промысловый и охотничье - пищевой тип заболеваемости часто наблюдается в очагах пойменно - болотного, луго - полевого, степного и лесного типов.

4) Водный тип.

а. Заражение людей происходит через контаминированную возбудителем воду ручьев и других открытых водоисточников. Основным источником инфицирования воды являются водяные полевки, ондатры, полевки - экономки. Механизм заражения преимущественно алиментарный, реже - контактный (купание в зараженном источнике, умывание, переход вброд, полоскание белья, полив огорода и т.п.). Преобладают ангинозно - бубонная и бубонная клинические формы заболевания. Заболевания часто возникают в летний период в предгорно - (горно) - ручьевых очагах, а также в очагах пойменно - болотного типа.

б. Заражение людей происходит через инфицированную воду колодцев и местных водопроводов. Источниками заражения воды являются домовые мыши и обыкновенные полевки, случайно попадающие в водоисточники. Заражаются лица, имеющие общий источник водопользования. Механизм заражения алиментарный (питье воды), реже контактный (умывание) Преобладают ангинозно - бубонная и абдоминальная формы болезни. Заболевания большей частью происходят в холодное время года в луго - полевых, степных и синантропных очагах туляремии. Примером водной эпидемической вспышки являются заболевания туляремией в 1995 году в Смоленской области, охватившие более 100 человек, использовавших один водоисточник (водопровод в поселке городского типа).

5) Сельскохозяйственный тип. Заражение людей чаще всего происходит воздушно - пылевым аэрозолем от инфицированных больными грызунами соломы, сена, зерна и других субстратов при их использовании в хозяйственных целях.

Источниками инфицирования субстратов являются обыкновенные полевки, домовые мыши и некоторые другие мелкие грызуны, заселяющие в осенне - зимнее время стога сена, ометы соломы, овощеи зернохранилища. Заражение людей происходит обычно при разборке, переработке сена, соломы, раздаче кормов, переборке овощей и т.п. Преобладает аспирационный механизм заражения и легочная форма болезни, реже абдоминальная и ангинозно - бубонная форма. Заболевания отмечаются, начиная с октября, особенно часты в декабре - январе и оканчиваются в марте. Характерны для луго - полевых, степных, реже - пойменно - болотных природных очагов туляремии.

6) Бытовой тип. Заражение происходит через инфицированные субстраты и возникает непосредственно в быту (дома, на усадьбе). Больные грызуны либо сами мигрируют в населенный пункт, либо их завозят с соломой, зерном, корнеплодами.

Преобладает аспирационный механизм заражения. Заражения происходят во время подметания пола, переборки и сушки сельскохозяйственных продуктов, раздачи корма домашним животным или при употреблении в пищу инфицированных продуктов и т.п. Регистрируются чаще легочная, реже - ангинозно - бубонная и абдоминальная формы болезни. Заболевания наиболее часто регистрируются с ноября по апрель двумя волнами. Первая - в ноябре - январе; вторая - в марте - апреле.

7) Продуктовый тип. Факторами передачи инфекции служат продукты, инфицированные на складе, в магазине, столовой и т.п. Механизм заражения преимущественно алиментарный. Клинические формы болезни чаще абдоминальная, реже - ангинозно - бубонная.

8) Производственный тип.

а. Заражения возникают при использовании инфицированных сельскохозяйственных продуктов на перерабатывающих предприятиях (сахарные, пивоваренные, крахмало - паточные, спиртовые, пеньковые заводы, элеваторы и т.п.). Основной механизм заражения - аспирационный. Заражения чаще происходят в цехах первичной обработки продукции. При завозе инфицированного сырья заражения могут возникать и на неэнзоотичных территориях. Заболевания чаще имеют место с ноября по февраль, реже - в ранне - весенний период.

б) Заражение людей происходит при забое животных и разделке мяса от инфицированных клещей, находящихся на овцах и крупном рогатом скоте. Механизм заражения - контактный, форма заболевания - бубонная. Заболевания могут возникать вне территории природного очага.

 

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ РАССЛЕДОВАНИЕ СЛУЧАЕВ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЛЮДЕЙ

 

Каждый случай заболевания туляремией подвергают подробному эпидемиологическому расследованию. При его проведении, прежде всего определяют возможный источник и пути передачи инфекции, что используют для коррекции противоэпидемических мероприятий, направленных на предупреждение дальнейших случаев заболевания. При проведении эпидемиологического обследования ориентируются на конкретно сложившуюся эпизоотическую ситуацию, информацию о которой представляют центры госсанэпиднадзора.

Механизм заражения можно определить по входным воротам инфекции (если таковые есть), а также по локализации регионарного бубона, т.к. при туляремии весьма четко проявляют себя клинико - эпидемиологические параллели: легочная форма - при аспирационном заражении; ангинозно - бубонная и абдоминальная - при алиментарном; язвенно - бубонная, бубонная и глазно - бубонная - при трансмиссивном и контактном механизмах заражения.

Необходимо также выяснить, подвергался ли больной противотуляремийной вакцинации, когда и с каким результатом. Обычно после вакцинации иммунитет сохраняется 5 и более лет, поэтому заболевания на 4-5 год после вакцинации редки. Появление заболеваний через несколько месяцев после вакцинации свидетельствует либо о плохом качестве вакцины, либо о неправильной технике ее введения или учета результата вакцинации.

Эпидемиологическое расследование вспышек или групповых заболеваний обычно не представляет затруднений в связи с однородностью механизма заражения и клинических проявлений, тогда как расследование спорадических случаев заражения требует специального подхода и известных навыков.

Опрос начинают с выяснения места жительства, места работы, командировок, отдыха (рыбалки, охоты, сбора ягод, грибов) в пределах инкубационного периода (3-7 дней). Для летних заражений большое значение имеет проживание или пребывание вблизи водоема, а при зимних - нахождение в сельской местности, выполнение сельскохозяйственных или бытовых работ.

Если первичный опрос больного не прояснил ситуацию, следует дополнить его результатом опроса членов его семьи, сотрудников или лиц, выезжавших одновременно с ним на территорию природного очага. При групповых и семейных заболеваниях следует выявить источники и факторы заражения для своевременной коррекции комплекса противоэпидемических и профилактических мероприятий.

При производственных заболеваниях обязательно обследование предприятий, на которых произошли заражения людей.

Наряду со сбором анамнестических данных, проводят зоолого - паразитологическое и лабораторно - диагностическое обследование эпидемического очага и окружающей территории.

Результаты эпидемиологического обследования больного туляремией вносят в карту эпидобследования очага (ф. N 371-у) При этом указывают общие сведения о больном, дату заболевания, дату установления диагноза и госпитализации, сведения о клинической форме и характере течения заболевания, результаты лабораторного обследования больного, а также эпидемиологическое заключение о предполагаемом источнике, механизме и месте заражения. Проводят анализ причин заболеваемости, который служит дальнейшему совершенствованию профилактических мероприятий.

Заключение по расследованию должно содержать краткую характеристику причин возникновения вспышки (спорадических или групповых случаев заболеваний) туляремии, а также анализ обоснованности, своевременности и эффективности проведенных противоэпидемических мероприятий (выявление источника и фактора передачи инфекции и полноты обеспечения специфической и неспецифической профилактики).

 

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА ТУЛЯРЕМИЕЙ

 

Эпидемиологический надзор за туляремией - это комплексное наблюдение за инфекцией, включающее анализ многолетней динамики заболеваемости в разных возрастных группах и разных контингентах населения, клинических проявлений, состояния иммунологической структуры населения, а также характеристик возбудителя, животных - носителей и членистоногих - переносчиков инфекции. Эпидемиологический надзор предусматривает эпизоотологическое и эпидемиологическое обследование природных очагов туляремии, обобщение и анализ полученных при этом данных, обусловливающих эпидемические проявления в природных очагах туляремии в виде спорадической, групповой или вспышечной заболеваемости людей.

ЗАДАЧАМИ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЯВЛЯЮТСЯ:

- слежение за заболеваемостью туляремией, ее территориальным распределением и заболеваемостью отдельных групп населения (городского, сельского, по возрастным и профессиональным группам);

- установление преобладающих клинических форм, тяжести заболевания, сроков диагностики, эпидемиологических типов заболеваемости;

- контроль за численностью населения, подвергающегося риску заражения на территории природных очагов туляремии и определение уровня охвата его профилактическими прививками;

- разработка тактики специфической защиты групп населения, привлекаемых на временные работы на энзоотичные по туляремии территории;

- оценка состояния противотуляремийного иммунитета (иммунологическая структура) населения, проживающего (или временно работающего) на территориях природных очагов туляремии;

- слежение за динамикой эпидемиологически значимых социальных явлений (например, миграция населения, характер хозяйственной деятельности, санитарно - гигиенические условия, уровень медицинского обслуживания и др.).

При туляремии оценка потенциального риска заражения населения базируется, в основном, на результатах эпизоотологического обследования природных очагов и на контроле за состоянием противотуляремийного иммунитета населения, подвергающегося повышенному риску заражения этой болезнью.

ЗАДАЧАМИ ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ПРИРОДНЫМИ ОЧАГАМИ ТУЛЯРЕМИИ ЯВЛЯЮТСЯ:

- слежение за динамикой популяций животных - носителей и членистоногих - переносчиков инфекции;

- своевременное выявление эпизоотий среди диких животных, определение их интенсивности, границ распространения;

- анализ факторов, определяющих динамику эпизоотического процесса, и обоснование прогноза его развития;

- выяснение основных закономерностей эпизоотического процесса, выяснение возможных механизмов сохранения и распространения возбудителя на каждой конкретной территории;

- эпизоотологическая дифференциация очаговых территорий для определения конкретных мер профилактики для каждой из них;

- изучение биологических свойств возбудителя, обнаруживаемого на территории;

- выявление обсемененности возбудителем туляремии абиотических объектов окружающей среды (вода, корма, гнезда грызунов и др.);

- проведение дератизационных и дезинсекционных мероприятий, направленных на уничтожение и (или) сокращение численности носителей и переносчиков возбудителя.

Основой эпизоотолого - эпидемиологического надзора за туляремией является обследование природных очагов туляремии, которое осуществляется как в плановом, так и в экстренном порядке.

Предпосылкой для начала экстренного эпизоотолого - эпидемиологического обследования служит извещение о случае (случаях) туляремии у людей или выявлении возбудителя у млекопитающих, членистоногих, и в объектах окружающей среды (воде, кормах и др.).

Проявление эпизоотической активности природного очага туляремии в ряде случаев становится известным лишь после регистрации заболевания человека. Однако и в этом случае необходимо определить источник и обстоятельства заражения человека для своевременной коррекции противоэпидемических и профилактических мероприятий, с целью предупреждения дальнейших случаев заражения людей в природном очаге.

Эпизоотическая ситуация оценивается на основании эпизоотологического обследования, при котором регистрируются изменения численности грызунов и кровососущих членистоногих, а также по результатам лабораторных исследований, подтверждающих наличие возбудителя (или антигена) в различных объектах. На основании этих данных дается мотивированное заключение о наличии на данной территории в настоящее время туляремийной эпизоотии.

Анализ полученной первичной информации является основой дальнейших действий по проведению профилактических и противоэпидемических мероприятий, основными из которых являются следующие:

- выявление источников инфекции и обстоятельств заражения людей:

- отбор проб для лабораторного исследования объектов, подозреваемых в качестве источников или факторов передачи возбудителя;

- определение круга лиц, подвергшихся риску заражения от выявленного источника или фактора передачи;

- проведение экстренной специфической профилактики лицам, подвергшимся риску заражения (или проживающим на территории выявленного активного природного очага туляремии);

- проведение экстренной дератизации, дезинсекции и дезинфекции в отношении вероятных источников и факторов передачи инфекции: уничтожение трупов диких млекопитающих, кормов, сельскохозяйственного сырья при обнаружении возбудителя туляремии. Учитывая, что больной человек не является источником инфекции, дезинфекции подвергаются те объекты, которые определены как факторы передачи возбудителя человеку.

 

Заместитель руководителя

Департамента госсанэпиднадзора

С.И.ИВАНОВ

 

 

 

 

 

Приложение N 2

к приказу Министерства

здравоохранения

Российской Федерации

от 14.04.1999 г. N 125

 

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ЗА ПРИРОДНЫМИ

ОЧАГАМИ ТУЛЯРЕМИИ

 

(Методические указания)

 

Ареал возбудителя туляремии охватывает страны северного полушария, а в Российской Федерации эта инфекция обнаружена практически во всех регионах (краях, областях, автономных республиках). Природные очаги туляремии распространены в различных природно - климатических зонах и приурочены к разнообразным ландшафтам. В настоящее время на территории РФ выделяют по крайней мере 6 основных ландшафтных типов природных очагов туляремии: луго - полевой, степной, пойменно - болотный, предгорно- (горно-) ручьевой, лесной, тундровый. Отдельно выделяют синантропные (или урбанические) очаги. Природные очаги туляремии полигостальны и поливекторны. Циркуляция возбудителя осуществляется в них среди фоновых видов мелких млекопитающих (ММ) и иксодовых клещей, однако, и другие сочлены паразитарной системы вовлекаются в этот процесс.

Луго - полевой тип очага. Инфекция поддерживается в популяциях всех видов полевок, зайца - русака и других млекопитающих 1-ой группы. Резервуарами и переносчиками инфекции часто служат иксодовые клещи Dermacentor reticulatus (D. pictus). Очаги расположены в лесной и лесо - степной зонах. Первичными биоценозами служат кустарниковые и кочкарниковые луга, опушки леса, поляны; вторичными - поля, сеянные луга с находящимися на них скирдами и ометами, а также расположенные по соседству населенные пункты.

Степной (овражно - балочный) тип очага. Циркуляция возбудителя происходит за счет популяций видов - двойников обыкновенной полевки, степной пеструшки и домовых мышей. Активно вовлекаются в этот процесс зайцы - русаки, хомяки, общественные полевки и другие виды млекопитающих. Резервуарами и источниками инфекции служат также многочисленные виды пастбищных иксодовых клещей. Этот тип очага распространен в степной зоне Европейской части РФ, степях Западной Сибири и Забайкалья.

Пойменно - болотный тип очага. Имеет многочисленные варианты: озерно - займищный, лиманно - плавневый и т.п. Очаг поддерживается водяной полевкой, ондатрой и другими околоводными млекопитающими 1-ой группы. Хранителями инфекции выступают норовые клещи Ixodes apronophorus и некоторые другие виды. Большую роль в циркуляции возбудителя играет вода в Северном, Северо - Западном районах, Восточной Сибири и других регионах России. Возникновению разлитых эпизоотии способствует концентрация зверьков во время паводков. Существенную роль в передаче инфекции от зверька к зверьку, а также человеку играют слепни и комары. Распространены очаги интразонально.

Предгорно-(горно) ручьевой тип очага. Очаг поддерживается на водяных полевках и других мелких зверьках. Вода инфицируется выделениями и трупами ММ, а ее низкая температура способствует длительному сохранению возбудителя. Очаги локализуются по берегам ручьев и речек в предгорьях Саян, Кузнецкого Алатау, Кавказа, Алтая и других горных систем.

Эти 4 типа природных очагов туляремии эпидемиологически наиболее опасны.

Лесной тип очага. Инфекция поддерживается в основном среди рыжих полевок, лесных и желтогорлых мышей, а местами - зайцами. Хранителями инфекции служат клещи I. ricinus, I. persulcatus и I. trianguliceps. Распространен в зоне широколиственных и смешанных лесов, реже - в таежной зоне.

Тундровый тип очага. Поддерживается за счет разных видов леммингов и других мелких грызунов 1-ой группы. Инфекция сохраняется годами в подстилках гнезд леммингов (на вечной мерзлоте) и во льду. Распространен в тундровой зоне.

Синантропный (урбанический) тип очага. Очаги находятся на территории городов, поселков или их окраинах. Основными носителями возбудителя туляремии являются синантропные грызуны - домовая мышь и серая крыса. Эпизоотии могут возникать в результате "заноса" возбудителя мигрирующими грызунами из природных биотопов обычно осенью и в начале зимы, а к весне - затухать. В циркуляцию возбудителя туляремии включается восточно - европейская полевка, часто заселяющая стога и ометы, расположенные вблизи построек и жилищ человека.

Туляремийные очаги устойчивы, непрерывное существование некоторых из них прослежено более 60 лет, но они могут трансформироваться в результате хозяйственно - преобразующей деятельности человека и изменять свой лоймопотенциал.

Всех млекопитающих по отношению к туляремийной инфекции и их роли в эпизоотическом процессе разделяют на 3 группы:

1-ая группа. Высоковосприимчивые и высокочувствительные млекопитающие (заражаются при попадании в организм единичных туляремийных бактерий, остро болеют и быстро погибают с интенсивным обсеменением органов и тканей возбудителем). К этой группе относятся все виды мелких мышевидных грызунов, кроме полевой мыши, зайцеобразные и насекомоядные, за исключением ежей, куторы, выхухоли.

2-ая группа. Высоковосприимчивые, но малочувствительные млекопитающие (заражаются при попадании в организм единичных бактерий, болеют тяжело, но быстро освобождаются от возбудителя, приобретая устойчивый иммунитет). К этой группе относятся полевая мышь, все виды крыс и сусликов, белки, бурундуки, бобры, ежи, выхухоль, кутора, белозубка и некоторые другие виды млекопитающих.

3-я группа. Маловосприимчивые и практически нечувствительные млекопитающие. К ним относятся большинство хищных млекопитающих и сельскохозяйственных животных.

Наибольшее эпидемиологическое и эпизоотологическое значение имеют животные 1-ой группы, поэтому тактика эпизоотологического обследования строится с учетом того, к какой группе относятся обитающие в очаге животные.

Тактика эпизоотологического обследования. Эпизоотологическое обследование природных очагов туляремии преследует следующие основные цели:

- контроль за состоянием известных очагов туляремии (выявление эпизоотий, определение их интенсивности, изучение механизмов циркуляции возбудителя, оценка угрозы эпидемических осложнений);

- оценка изменений, происходящих в очагах при антропогенном воздействии и трансформации ландшафтов;

- разведка неизученных или малоизученных территорий для уточнения нозогеографии туляремии, эпизоотологического и эпидемиологического районирования;

- прогнозирование эпизоотической ситуации и обоснование конкретных мер профилактики.

Сбор этих сведений достигается путем систематического, планового обследования территории в минимально необходимом для этого объеме работ.

Эпизоотологическое исследование предусматривает: сбор полевого материала, его лабораторное исследование и последующий анализ полученных данных.

Полевой раздел работ включает: изучение природных особенностей территории (рельеф, климат, почва и т.п.); изучение видового состава, распределения и численности млекопитающих - носителей инфекции и членистоногих - переносчиков; отлов животных и сбор эктопаразитов; поиск трупов и следов жизнедеятельности ММ, объектов окружающей среды; доставку этого материала в лабораторию и подготовку его к исследованию; изучение особенностей образа жизни животных, которые определяют развитие эпизоотического процесса и условия заражения людей. Сбор материала для лабораторного исследования обычно сочетают с изучением видового состава и проведением учетов численности ММ и членистоногих переносчиков.

При эпизоотологическом обследовании используют как общепринятые зоолого - паразитологические методы, так и специфические, направленные на поиск туляремийных эпизоотий. Поиски туляремийных эпизоотий в первую очередь должны производиться в тех районах, где в прошлом имели место случаи заболевания людей, были выделены культуры возбудителя или обнаружен антиген в объектах окружающей среды. Как правило, каждый район обследуют 1 раз в 1-2 года (в зависимости от активности очага); имеющиеся стационары или пункты многолетних наблюдений обследуют ежегодно - весной и осенью. По эпидпоказаниям проводят экстренные эпизоотологические обследования. Во всех случаях при обнаружении эпизоотии туляремии выясняют границы ее распространения. Границы эпизоотий определяют следующим способом. По результатам лабораторного исследования материала, собранного на энзоотичной по туляремии территории, картируют все "точки" с положительным результатом и все крайние "точки" соединяют (оконтуривают). На оконтуренной территории отмечают участки с положительными пробами, определяют тип очага, процент зараженных проб, показатели численности носителей и переносчиков, процент зараженных биотопов. Таким образом, устанавливают пространственно - биоценотическую структуру очага, степень распространения эпизоотии, ее интенсивность и экстенсивность. Важно подчеркнуть, что при обследовании больших территорий и получении сведений о состоянии очагов туляремии в сжатые сроки, необходимо использовать маятниковый метод обследования. Сущность метода заключается в том, что выезды групп эпизоотологического обследования осуществляются каждый раз в удаленные от предыдущего места обследования районы. В итоге оперативно охватывают обследованием наибольшую площадь энзоотичной по туляремии территории.

 

ОРГАНИЗАЦИЯ ПОИСКОВ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ ЭПИЗООТИЙ

 

Возникновение заболеваний среди людей определяется эпизоотическим состоянием очагов. Разлитые эпизоотии туляремии происходят обычно в годы высокой численности ММ. Повышение численности ММ является важной характеристикой состояния очага и признаком возможного эпидемического неблагополучия. В этой связи наблюдения за численностью MM - одна из основных составляющих эпизоотологического обследования, которое осуществляют на основе различных методов количественного учета ММ. При этом основное внимание уделяют обследованию скирд, ометов, стогов, строений, расположенных в окружении природных биотопов, а также зарослей кустарников, опушек широколиственных лесов, облесенных балок и оврагов, участков рудеральной растительности, агроценозов с зерновыми культурами, лесополос, околоводных биотопов, колоний грызунов, заброшенных и временно используемых человеком строений, других мест повышенного риска заражения людей туляремией (зон рекреации, мест заготовок сельскохозяйственной продукции, лесозаготовок и т.п.).

В поисках туляремийных эпизоотий лабораторному исследованию подвергают отловленных разными методами диких ММ или их трупы, собранные в природе, остатки трупов, подснежные гнезда грызунов, продукты жизнедеятельности ММ, погадки птиц (ПП), помет хищных млекопитающих (ПХМ), а также солому, мякину, талую воду и другие объекты, загрязненные выделениями грызунов, воду из естественных водоемов и колодцев, гидробионтов и др. Среди членистоногих переносчиков основное внимание уделяют иксодовым клещам. Кроме того, исследуют мелких эктопаразитов, собранных с ММ (вшей, гамазовых и краснотелковых клещей, блох). При трансмиссивных вспышках исследуют кровососущих двукрылых (комаров, слепней и др.). Серологические исследования домашних животных производят при соответствующих эпизоотологических и эпидемиологических показаниях. Основными методами лабораторного исследования являются: биологический (заражение биопробных животных); бактериологический (бактериоскопия, посевы на питательные среды); иммунофлуоресцентный; серологические (реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации, реакция нейтрализации антител, реакция коагглютинации и другие); молекулярно - биологический (полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление специфической ДНК возбудителя).

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИКИХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ. При поисках эпизоотий туляремии в первую очередь исследуют отловленных животных и трупы высокочувствительных ММ 1-ой группы. Основным методом при этом является бактериологический. Во вторую очередь исследуют малочувствительных к туляремии животных 2-ой группы, а затем - 3-ей, которых исследуют как бактериологическими, так и серологическими методами. Однако у животных 1-ой группы в небольшом проценте случаев может иметь место хроническая форма туляремии с формированием специфических антител. В этой связи целесообразны поиски антител и у зверьков 1-ой группы. Наличие антител указывает на контакт зверьков с возбудителем.

В большинстве случаев животных доставляют в лабораторию мертвыми (убитыми или павшими). Успех бактериологического исследования зависит от свежести доставленного материала, поэтому животных или их органы, если они не были заморожены или законсервированы, исследуют немедленно после доставки в лабораторию. Если это не удается, то трупы животных или органы сохраняют на холоду. В первую очередь исследуют зверьков, найденных мертвыми. Перед вскрытием зверьков осматривают и снимают или счесывают с них эктопаразитов. Затем зверьков взвешивают с точностью до 0,5 г, измеряют длину их тела, хвоста. При вскрытии определяют пол, возраст и генеративное состояние зверьков. Возможна обработка зверьков на месте сбора, вскрытие и помещение органов в консервант для последующей доставки в лабораторию. Консервантами могут служить вазелино - парафиновая смесь (1 часть парафина - 10 частей вазелинового масла, смесь стерилизуют 45 мин. прогреванием на кипящей водяной бане), а также касторовое масло, 5%-ный раствор поваренной соли, глубокое замораживание в жидком азоте и др. В консервантах и при низкой температуре органы животных можно сохранять в течение 1 месяца.

1.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТРУПОВ ЖИВОТНЫХ. Зверьков, погибших в природе, павших в лаборатории, или животных, у которых при вскрытии обнаружены патологоанатомические изменения, характерные для туляремии, подвергают индивидуальному исследованию, применяя биологический, бактериологический, серологические методы. Эти методы сочетают по-разному в зависимости от задач и технических возможностей. В трупах животных возбудитель туляремии может быть обнаружен путем бактериоскопии мазков - отпечатков органов или выделен посевом на питательные среды, если органы не подверглись разложению. Вскрытие зверьков, найденных мертвыми в природе, производят тщательно, в отдельной кювете и отдельными инструментами. При вскрытии каждого зверька производят тщательную обработку инструментов 96 град. спиртом с последующим обжиганием или смену их с последующим кипячением, обработку рук (перчаток) и доски для вскрытия. Необходимо полностью исключить возможность случайного переноса микроба туляремии в параллельный анализ. Посевы из трупов зверьков лучше производить на питательные среды с антибиотиками, предупреждающими рост посторонней микрофлоры. В органах животных 1-ой группы туляремийные бактерии могут быть обнаружены микроскопическим исследованием (лучше люминесцентной микроскопией). Использование микроскопии мазков из органов трупов животных 2-ой группы может быть безуспешным из-за малой обсемененности их органов туляремийными бактериями. Наряду с микроскопией и посевом органы трупов зверьков исследуют путем биологической пробы, а остатки суспензии используют для постановки серологических реакций (РНАт, РИФ и др.). В условиях установленной эпизоотии можно ограничиться посевом и бактериоскопией мазков из органов, сохраняя часть их на холоду до выяснения результатов и выделения возбудителя прямым посевом. В сомнительных случаях (плохая сохранность трупов, отсутствие при вскрытии типичных патологоанатомических изменений) прибегают к биологическому методу. При этом часть органов оставляют до выяснения результатов посева или биологического исследования. Если биопробное животное погибнет преждевременно от посторонней причины, а посев неудачен, то проводят повторное биологическое исследование. У животных с признаками разложения в первую очередь исследуют костный мозг трубчатой кости. При исследовании сильно разложившихся трупов применяют накожный метод заражения биопробного животного. Трупы животных, как правило, исследуют параллельно и серологическими методами (РНАт, РИФ и др.). Трупы животных 2-ой и 3-ей групп обязательно исследуют биологическим методом, позволяющим выявить даже единичные бактерии. Исследование завершают выделением чистой культуры, ее идентификацией, что служит неоспоримым доказательством зараженности объекта.

1.2. ИССЛЕДОВАНИЕ МУМИФИЦИРОВАННЫХ ТРУПОВ ЖИВОТНЫХ. Обнаруженные при обследовании природных очагов туляремии мумифицированные трупы, высохшие шкурки и кости зверьков не содержат живых туляремийных бактерий, поэтому такие объекты исследуют серологическими методами, позволяющими обнаружить туляремийный антиген.

1.З. ИССЛЕДОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ, ДОБЫТЫХ ЖИВЫМИ. Основным методом исследования ММ, добытых в природе орудиями лова или живыми, служит биологическая проба. Этот метод позволяет обнаруживать даже единичные бактерии возбудителя туляремии на различных стадиях заболевания или бактерионосительства, когда использование других методов (посев, бактериоскопия) не дает положительного результата. При биологическом исследовании ММ (кроме трупов и зверьков с патологоанатомическими изменениями) применяют групповое исследование, т.е. объединение органов нескольких зверьков (5-10) одного вида и пойманных в одном месте. Используют кусочки селезенки, печени, почек, лимфатические узлы, костный мозг. При групповом анализе посевы и мазки от каждого вскрываемого зверька не делают. Отобранные органы помещают в стерильную ступку, тщательно растирают пестиком, добавляют стерильный физиологический раствор и смешивают в гомогенную суспензию. Количество физиологического раствора колеблется от 0,5 до 5 мл в зависимости от величины органов. Сразу после приготовления 0,2-0,5 мл взвеси набирают в шприц через небольшой кусочек стерильной ваты и вводят белой мыши под кожу паховой области правой ноги (морской свинке можно ввести до 2 мл взвеси).При вскрытии смену инструментов производят после группы зверьков, входящих в общий анализ. Органы животных, у которых на вскрытии обнаружены патологоанатомические изменения, исследуют индивидуально. В этом случае применяют дополнительно посев и бактериоскопию (люминесцентную микроскопию). Бактериоскопия, как правило, дает положительный результат только в септической (терминальной) фазе заболевания. Животных, добытых живыми, исследуют на наличие туляремийных антител, для чего используют сыворотку крови или "смывы" из грудной полости.

ВЗЯТИЕ КРОВИ У ЖИВЫХ ММ. Живых грызунов умерщвляют, вскрывают грудную клетку и берут из правого желудочка сердца еще не свернувшуюся кровь (обычно от 0,5 до 3 мл в зависимости от вида животного). Кроме того, кровь можно брать из кончика хвоста или уха, не убивая животное, что позволяет при необходимости повторить исследование. При этом используют индивидуальные пипетки и шприцы. Отстоявшуюся сыворотку консервируют мертиолатом натрия до конечной концентрации 1:10000 (на 1 мл сыворотки добавляют 2 капли по 0,05 мл раствора мертиолата натрия 1:1000). Можно использовать плазму крови животных (особенно мелких видов). Для этого кровь берут из сердца или периферических сосудов и помещают в количестве 0,1 мл в лунку пластины, содержащей 0,2 мл 5%-ного раствора лимоннокислого натрия. Через 2 часа плазму крови можно использовать в серологических реакциях микрообъемным способом. Исходное разведение плазмы приравнивается к разведению сыворотки 1:5.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ "СМЫВА" ИЗ ГРУДНОЙ ПОЛОСТИ. При исследовании мертвых ММ готовят суспензию из сгустков крови сердца и околосердечного пучка сосудов ("смыв"). Суспензию готовят непосредственно в грудной полости грызунов после взятия материала для бактериологического исследования. Для этого целиком удаляют легкие, ножницами иссекают сердце, аорту и другие крупные сосуды. Шприцем с толстой иглой или пастеровской пипеткой вливают в грудную полость физиологический раствор с мертиолатом натрия 1:4000 в количестве 1 мл. После перемешивания взвесь отсасывают и переносят в пробирку, в которую добавляют еще 2 мл физиологического раствора. "Смывы" отстаивают 1-2 часа, отсасывают надосадочную жидкость. Условно "смыв" приравнивают к разведению сыворотки 1:10. Желательно использовать забуференный физиологический раствор рН 7,2. "Смывы", как правило, исследуют в РПГА, поэтому их прогревают 30 мин. при 56 град.С, затем выдерживают 12-14 часов. За это время взвешенные частицы полностью оседают и надосадочная жидкость просветляется.

Возможно также производить забор сыворотки и цельной крови на фильтровальную бумагу, предварительно обработанную мертиолатом натрия в разведении 1:1000.

2. МЕТОД ПОИСКА ЗИМНИХ ЭПИЗООТИЙ ТУЛЯРЕМИИ. Во время зимних лыжных маршрутов под одиноко стоящими деревьями и кустами, на ометах соломы, под столбами и другими возвышениями на снегу можно обнаружить обрывки шкурок ММ, которые хищные птицы сдирают, прежде чем съесть зверька. Иногда на снегу около обрывков шкурок имеются замороженные капли крови. Обрывки шкурок и капли замороженной крови собирают в пробирки и исследуют с помощью биологической пробы. Во время зимнего тропления следов лисы собирают экскременты, обрывки шкурок, остатки трупов ММ и гнездового материала, раскопанных лисой нор ММ. Собранный таким образом материал исследуют путем биологической пробы и серологическими методами.

3. СБОР И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОГАДОК ПТИЦ И ПОМЕТА ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ (ПП И ПХМ). Для рекогносцировочного обследования значительных территорий применяют серологическое исследование ПП и ПХМ на содержание туляремийного антигена. Преимущества метода заключаются в малой трудоемкости процесса сбора и быстроте исследования полевого материала, в возможности за короткий срок обследовать значительные территории открытых ландшафтов и быстро получить ответ о наличии или отсутствии инфекции. Метод применим для раннего и ретроспективного выявления эпизоотии, определения ее границ, установления видов животных, вовлеченных в эпизоотический процесс, и оценки их численности. Поедая в природе преимущественно ослабленных, больных зверьков или их трупы, хищники осуществляют выбор из популяции именно того материала, который желателен для лабораторного исследования.

ПОГАДКА представляет собой плотный, продолговатый комок непереваренных птицей частей пищи (шерсть, кости, перья, хитин насекомых и т.п.), выбрасываемый ею через рот по окончании процесса предварительного пищеварения. Образование погадок отмечается у всех хищных птиц, чаек, вороновых и некоторых других. Костные остатки млекопитающих в погадках хорошо сохраняются, что позволяет установить видовую принадлежность съеденных зверьков. Птицы сбрасывают погадки во время отдыха через 10-20 часов после кормежки. Погадка может содержать остатки одного зверька у мелких птиц и нескольких - у крупных хищников. Установлено, что птицы сбрасывают погадки недалеко от мест кормежки и можно считать, что исследование содержимого погадок характеризует именно ту территорию, на которой они собраны (в пределах 2-3 км от точек сбора).

ПОМЕТ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ (семейства куньих, собачьих) также состоит из непереваренных частей пищи, видовой состав которой в полевых условиях определить трудно, т.к. они были разжеваны и прошли пищеварительный тракт хищника. Участок охоты хищных млекопитающих, как правило, постоянен и занимает территорию в несколько квадратных километров.

Длительность сохранения погадок и помета в природе прежде всего зависит от климатических условий местности. В зоне достаточного увлажнения разрушение их происходит в течение 4-5 месяцев под воздействием гнилостных процессов и насекомых - некрофагов. В засушливом климате степей и пустынь они могут сохраняться более длительное время (в течение года и более). Чем свежее погадка и помет, тем они темнее окрашены. Гибель туляремийного микроба в погадках и помете происходит быстро (в первые сутки; при отрицательных температурах, возможно, дольше), в связи с чем бактериологическое исследование этого материала нецелесообразно. Туляремийный антиген сохраняется в погадках и помете в течение всего периода их существования. Для поиска туляремийного антигена в ПП и ПХМ используют различные серологические методы, чаще всего наиболее простой и доступный -РНАт.

3.1. СБОР ПП И ПХМ В ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ. В бесснежное время года в открытых ландшафтах в течение одного дня можно собрать материал, содержащий остатки большого числа ММ с территории несколько сотен квадратных км, если использовать автомашину для передвижения. Труднее, но возможно, проводить сбор ПП и ПХМ зимой. Погадки собирают вблизи гнездовий, мест кормежки, ночевок и отдыха птиц. Обычно это возвышенные предметы, столбы ЛЭП, одиноко стоящие деревья, стога сена и ометы соломы, вышки и т.д. ПХМ также можно обнаружить около возвышающихся на местности предметов, а также на охотничьих тропах хищников и на их лежках. ПП и ПХМ собирают обычно ранней весной, сразу после схода снега и поздней осенью. Это позволяет получить характеристику эпизоотийного состояния популяции ММ на протяжении всего года, установить начало и длительность эпизоотии. В пойменно - болотных очагах наиболее удобное время сбора ПП и ПХМ - вторая половина лета, когда возникают эпизоотии среди околоводных видов млекопитающих. В лесных ландшафтах ПП и ПХМ удается собирать возле гнезд или по кромке леса и опушкам. Непосредственно в лесных массивах особое внимание уделяют сбору ПХМ в зимнее время.

Каждую найденную погадку или пробу помета заворачивают в отдельный лист бумаги во избежание контаминации. Собранный с одного места материал помещают в отдельные матерчатые мешки и этикетируют. Быстрое отмирание туляремийного микроба в кислой среде ПП и ПХМ позволяет проводить их сбор в природе и дальнейшую обработку без специального режима, соблюдая лишь правила обычной гигиены. При необходимости материал может храниться длительное время, если его тщательно просушить.

3.2. ПОДГОТОВКА ПП И ПХМ К ИССЛЕДОВАНИЮ. Каждую погадку или пробу помета рекомендуется исследовать индивидуально. После доставки в лабораторию материал просушивают при комнатной температуре и взвешивают каждую пробу с точностью до 0,1 г. Это позволит в дальнейшем придерживаться сравнимого исходного разведения суспензии (по сухому весу). Например, если к образцу весом 1 г добавить 4 мл физиологического раствора, то получим разведение 1:5, а при добавлении 9 мл - 1:10 и т.д. После взвешивания дальнейшую обработку материала можно проводить двумя способами:

а) взвешенный образец помещают в специальный пакетик из тонкой полиэтиленовой пленки. Размер пакетика определяется величиной исследуемого материала. После помещения в пакетик исследуемого образца верхний край его перегибают и сшивают скрепочной машинкой. Затем шприцем непрерывного действия через прокол верхнего края пакета в него вводят подогретый (до 70 град. С) физиологический раствор в необходимом количестве. Использование подогретого физиологического раствора на 1-2 разведения повышает титр реакции в сравнении с холодным раствором. Содержимое пакета разминают в однородную массу и через 20-30 мин. отжимают в пробирку, отрезав нижний заостренный край пакета. Суспензию прогревают на кипящей водяной бане 5 - 10 мин. и после охлаждения абсорбируют взвесью 50%-ных формалинизированных эритроцитов (2 капли эритроцитов на 1 мл суспензии). Через 20-30 мин. суспензию центрифугируют 10-15 мин. при 2000 об/мин. Полученную прозрачную надосадочную жидкость используют для постановки серологической реакции. Процедура истощения суспензии формалинизированными эритроцитами необходима для избежания неспецифических реакций;

б) при отсутствии полиэтиленовых мешочков или центрифуги суспензию можно подготовить к исследованию другим, более трудоемким способом. Погадку (или помет) растирают пестиком в фарфоровой ступке с необходимым количеством подогретого до 70 град. С физиологического раствора. Полученную взвесь отсасывают через кусок стерильной ваты пастеровской пипеткой, переносят в пробирку и прогревают 5-10 мин. на кипящей водяной бане. Затем суспензию фильтруют на стеклянной воронке с асбестовым фильтром до получения прозрачной жидкости, которую используют в реакции. Такой фильтрат, как правило, не дает неспецифических реакций даже в начальных разведениях, поэтому дополнительная обработка формалинизированными эритроцитами не требуется.

3.3. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ПП И ПХМ. Обнаружение туляремийного антигена в исследуемом материале служит достоверным критерием наличия эпизоотии на обследуемой территории в настоящее время или в недавнем прошлом и является основанием для организации работ, направленных на выделение возбудителя. Количество положительных ПП и ПХМ позволяет судить об интенсивности эпизоотического процесса: в местах разлитых эпизоотий этот показатель составляет 20-60% от всего материала, а при локальных (вялых) эпизоотиях - 0,5-3%. Для обнаружения антигена при вяло текущих эпизоотиях туляремии необходимо собрать и исследовать не менее 100 ПП или ПХМ из одного места в течение одного сезона обследования, а для контроля за эпизоотической ситуацией в известных очагах туляремии - не менее 25 ПП и ПХМ, собранные весной в лесной и лесостепной зонах, характеризуют эпизоотическое состояние зимнего периода и ранней весны, а собранные осенью - лета. Видовой состав ММ, вовлеченных в эпизоотический процесс в лабораторных условиях, удается определить до вида (или рода) по хорошо сохраняющимся костным остаткам (фрагментам черепа и зубам) при сравнении с эталонной коллекцией костей скелета и зубов ММ, обитающих на данной территории.

4. ПОДГОТОВКА КРОВОСОСУЩИХ ЧЛЕНИСТОНОГИХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ - ГИДРОБИОНТОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

Добытых в природе насекомых и других беспозвоночных животных исследуют, как правило, в день доставки в лабораторию или не позднее следующего дня. Исключение может быть только для взрослых иксодовых клещей, которых можно сохранять живыми 2-3 недели на холоду. Погибшие и высохшие членистоногие непригодны для бактериологического исследования.

Беспозвоночных животных перед исследованием определяют до вида (или рода) и группируют в отдельные пробы, содержащие животных одного вида (рода) и добытых из одного места. Обнаружение туляремийного микроба в организме беспозвоночных наиболее эффективно при использовании биологического метода или ПЦР-анализа, выявляющего специфическую ДНК возбудителя туляремии. Однако последний метод может быть использован и оценен в настоящее время только специализированными научными лабораториями. В редких случаях удается обнаружить туляремийные бактерии в иксодовых клещах посевом содержимого их тела на питательную среду или с помощью люминесцентной микроскопии.

4.1. ИКСОДОВЫЕ КЛЕЩИ. Перед исследованием взрослых клещей (~50 особей в один анализ) помещают в пробирку, приливают 10-15 мл этилового спирта, энергичным встряхиванием промывают клещей 0,5-1 мин., сливают спирт, после чего 3-4 раза таким же образом промывают их в стерильной дистиллированной воде. Отмытых клещей помещают на фильтровальную бумагу для удаления излишней влаги, а затем - в ступку. Клещей раздавливают пестиком и растирают в кашицу, избегая разбрызгивания. К растертой массе добавляют 5 мл стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают в однородную суспензию, которую набирают в шприц через небольшой кусочек стерильной ваты и вводят биопробному животному.

При исследовании личинок и нимф иксодовых клещей промывание в спирте не проводят, т.к. это может повредить анализу. Личинок объединяют по 100-200 экземпляров, нимф - по 50-100 в зависимости от степени их упитанности. Затем помещают в стерильную ступку, растирают пестиком, добавляют 1-3 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают и полученную суспензию вводят биопробному животному.

4.2. БЛОХ, ГАМАЗОВЫХ КЛЕЩЕЙ, ВШЕЙ сортируют по видам (родам), а также видам зверьков, с которых они были собраны, помещают в стерильные пробирки и далее подвергают обработке по той же методике, что личинок и нимф иксодовых клещей.

4.3. КРОВОСОСУЩИХ ДВУКРЫЛЫХ насекомых слегка усыпляют парами эфира для ограничения подвижности. У слепней предварительно отстригают ноги и крылья, комаров и мошек исследуют целиком. В один анализ включают 25-50 слепней, или 100 комаров, или 250 мошек. Насекомых растирают в ступке, добавляют 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию вводят биопробному животному

4.4. БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ ЖИВОТНЫЕ - ГИДРОБИОНТЫ. Гидробионтов - ручейников, бокоплавов, дафний, циклопов и др. перед исследованием промывают в нескольких порциях воды и 1-2 порциях стерильной дистиллированной воды. У животных, имеющих чехлики или раковинки, последние по возможности удаляют. Животных объединяют в группы по 5-10-50 экземпляров в зависимости от размеров особей отдельных видов, растирают в ступке, добавляют физиологический раствор 2-5 мл и полученную суспензию вводят биопробному животному.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ.

Исследование объектов внешней среды является эффективным способом обнаружения возбудителя туляремии, т.к последний обнаруживает значительную устойчивость во внешней среде, особенно при низкой температуре.

Так, в замороженной воде при -5 град. С возбудитель сохраняется до 10,5 месяцев, во влажной почве при 4 град. С- до 4-х месяцев, в зерне, соломе при -5 град. С - до 6 месяцев, при 8-12 град. С - 2 месяца, в замороженных трупах мышей - 6 месяцев, зайцев - 112 дней.

5.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ. Пробы воды берут из различных водоемов: речек, ручьев, прудов, озер, болот, колодцев и т.п. Из каждой точки желательно брать 2 пробы. Пробы берутся в затененном месте, на глубине 10-20 см от поверхности стоячей или слабо проточной воды. Желательно отбирать пробы в местах обитания зверьков (возле кормовых столиков, нор, хаток бобров или ондатр). Воду в количестве 100-200 мл отбирают в стерильные бутылочки емкостью 200-250 мл, закрывают пробкой, бумажным колпачком и обвязывают шпагатом. Бутылочки с водой помещают в клеенчатые или полиэтиленовые мешки, упаковывают в металлический ящик и доставляют в лабораторию. В зимнее время пробы берут в прорубях, в незамерзающих местах ручьев, мелиоративных каналов, рыболовных лунках. При глубоком промерзании водоема со дна берут лед или ил. После взятия каждой пробы руки (перчатки) и инвентарь обрабатывают 70 град. спиртом. Исследование воды проводят в день ее доставки в лабораторию биологическим методом. Для концентрирования возбудителя используют фильтрование, цетрифугирование, магнитные сорбенты и другие приемы. После этого белой мыши вводят подкожно до 1 мл, а морской свинке до 5 мл воды (желательно по 2 биопробы). Наиболее эффективно применение исследования воды в пойменно - болотных очагах туляремии в зимнее время.

5.2. ЗЕРНО, СОЛОМА, ПОДСНЕЖНЫЕ ГНЕЗДА ГРЫЗУНОВ, ДРУГИЕ СУБСТРАТЫ. С зерна, соломы, гнездового материала и других субстратов делают смыв физиологическим раствором. Для этого 5-10 г исследуемого субстрата помещают в стерильный сосуд, заливают двойным по весу количеством физиологического раствора и тщательно встряхивают. Смыв набирают в шприц (через кусочек ваты) и вводят биопробному животному. Зимой с соломы ометов собирают замерзшую мочу, экскременты грызунов, которые также используют для биопробы. Подснежные гнезда грызунов исследуют биологическим и серологическим методами.

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ. Домашние животные (крупный рогатый скот, свиньи, овцы, северные олени) относятся к видам, малочувствительным к туляремии (3-я группа). При их исследовании используют главным образом серологические методы (РА и РПГА), реже - внутрикожную пробу с тулярином. Посевы из органов или биологические пробы применяют только при обследовании павших, забитых или больных животных. Исследуют в первую очередь лимфатические узлы и селезенку. При серологическом исследовании следует учитывать возможность обнаружения перекрестных реакций с бруцеллами и микробной флорой кишечника животных. Целесообразно исследовать сыворотки домашних животных по крайней мере в двух серологических реакциях: РА и РПГА, считая диагностически значимыми титры в РА -1:40 и выше и в РПГА - 1:160 и выше. Положительные реакции в РПГА следует контролировать в реакции торможения гемагглютинации (РТПГА). Обнаружение специфических антител у домашних животных имеет ориентировочное значение и служит сигналом для проведения на данной территории детальных эпизоотологических исследований на туляремию.

 

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

 

В практике эпизоотологического исследования на туляремию основное место принадлежит бактериологическим методам, обеспечивающим выявление и выделение возбудителя туляремии. Вместе с тем существенную роль приобретают серологические методы исследования, позволяющие с меньшими трудозатратами и в короткий срок дать заключение об эпизоотическом состоянии территории. И, наконец, в последние годы разрабатываются и находят применение высокочувствительные методы молекулярной биологии (ПЦР-анализ), позволяющие по обнаружению специфической ДНК возбудителя туляремии судить о наличии эпизоотии и выявлять "некультивируемые" или "покоящиеся" формы возбудителя туляремии в различных объектах.

1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1. БАКТЕРИОСКОПИЯ. Ввиду очень мелких размеров туляремийный микроб может быть достоверно обнаружен в окрашенных мазках - отпечатках только из обильно обсемененного патологического материала Четко положительные результаты получают при содержании в 1 г ткани более 1 млрд микробов. Поэтому бактериоскопия эффективна при исследовании павших диких или биопробных животных, но обычно безуспешна при исследовании убитых на ранних стадиях заболевания зверьков. Она не используется также при исследовании воды, смывов с объектов внешней среды, где концентрация возбудителя может быть незначительной.

Мазок - отпечаток делают, прикладывая к обезжиренному стеклу поверхность свежего среза исследуемого органа - лимфатического узла, селезенки, печени, а также мазок крови из сердца. Препарат хорошо просушивают, после чего 15-20 мин. фиксируют в смеси Никифорова (этиловый спирт и серный эфир в равных пропорциях). После фиксации мазок окрашивают по Романовскому - Гимзе. Раствор краски готовят из расчета 3-4 капли на 1 мл дистиллированной воды (рН 7,0- 7,2). Окраска продолжается не менее 1 часа (можно до 24 часов). В правильно окрашенном мазке бактерии туляремии имеют сиреневый цвет и легко определяются по размерам, форме и тенденции к кучечному расположению.

С целью ускоренной окраски мазков применяют метод, основанный на одновременной фиксации и окраске мазка. Для этого краску Романовского - Гимза смешивают в равных частях с метиловым спиртом (или химически чистым ацетоном). Смесь можно длительно хранить в посуде с притертой стеклянной пробкой. На свежий (не более 2-х суток), высушенный и не фиксированный мазок наносят 20 капель смеси. Через минуту к краске приливают 10 мл дистиллированной воды (рН 7,2). Осторожным покачиванием краску смешивают с водой. Через 10-15 мин. краску сливают, мазок промывают водопроводной водой, высушивают и просматривают под микроскопом. Бактерии туляремии окрашиваются в темно - фиолетовый цвет и четко дифференцируются от светло - сиреневого окружающего фона. Количество бактерий, обнаруженных в мазках - отпечатках из органов и крови, учитывают по 4-х балльной шкале. Достоверным для диагностики является обнаружение туляремийных бактерий в количестве, оцениваемом Ш-1У баллами (большое количество крупных, средних и небольших по величине скоплений бактерий в каждом поле зрения).

1.2. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ. В основе метода лежит реакция иммунофлуоресценции (РИФ) в ее прямом варианте. Люминесцентная микроскопия является эффективным методом экспресс - диагностики туляремии, позволяющим выявлять как живые, так и мертвые туляремийные бактерии при концентрации 1 млн м. кл. в 1 мл. При меньших концентрациях - 100 тыс., 10 тыс. и 1 тыс. м. кл. в 1 мл возбудитель может быть обнаружен, но его выявление не носит закономерного характера. РИФ позволяет обнаружить туляремийные бактерии при отрицательном результате световой бактериоскопии. Объектами исследования в РИФ могут служить бактериальные взвеси, отпечатки органов и тканей животных, гомогенаты органов животных, беспозвоночных переносчиков. Метод используют для выявления возбудителя в органах павших и убитых биопробных животных, в трупах диких животных, органах отловленных диких животных. Метод прост в постановке, не имеет себе равного в быстроте получаемого ответа (1,5-2 часа) и рекомендуется для ускоренного выявления и идентификации возбудителя туляремии. При приготовлении препаратов для РИФ на обезжиренном предметном стекле делают мазки - отпечатки из лимфатического узла, селезенки, печени, легкого или гомогенатов исследуемых органов. В последнем случае используют суспензию, приготовленную для биологической пробы или серологического исследования, делая по возможности тонкий мазок. Дальнейшие процедуры постановки РИФ и учета ее результатов подробно описаны в приложении 4 настоящего документа.

1.3. ПОСЕВ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. Посев на питательные среды применяют для выделения культуры возбудителя туляремии из органов павших или забитых диких животных, павших или убитых лабораторных животных, а также зверьков, у которых обнаружены патологоанатомические изменения, характерные для туляремии. Иксодовых клещей, воду, почву, смывы с объектов внешней среды не исследуют посевом ввиду их загрязнения посторонней микрофлорой.

Возбудитель туляремии не растет на обычных питательных средах (мясо - пептонном агаре и бульоне), что служит одним из признаков при идентификации культуры. Наиболее практичной и обычно применяемой средой для выделения и культивирования туляремийного микроба является свернутая желточная среда.

Посевы могут быть произведены методом отпечатков кусочками органа или путем тщательного втирания кусочка органа по всей поверхности среды. При обильном засеве рост туляремийных бактерий на свернутой желточной среде появляется в виде сплошного роста уже через 18-24 часа инкубирования при 37 град. С; при засеве малым количеством бактерий отдельные колонии становятся заметными на 3-5 сутки и позднее. Посевы следует выдерживать в термостате до 10-12 суток. По внешнему виду рост туляремийных бактерий на свернутой желточной среде хорошо отличается от большинства других бактерий, имеет вид извилистого, слегка блестящего (не сухого), почти бесцветного нежного налета.

Для выделения и культивирования туляремийного микроба используют также агаровую среду с добавлением желтка. Среда готовится на основе сухого питательного агара Иркутского НИПЧИ: на 100 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до 45 град. С агара добавляют 5 мл куриного желтка с физиологическим раствором (в соотношении 3:2).

Для культивирования туляремийных бактерий применяются различные варианты агаровых сред на рыбных, мясных, дрожжевых основах с обязательным добавлением цистина (цистеина) 0,1%; глюкозы 1%; дрожжевого экстракта (источник витамина В). Чувствительность указанных агаровых сред можно повысить добавлением дефибринированной кроличьей или лошадиной крови (5-10%).

Разработаны и используются на практике питательные сухие агаровые среды для культивирования и выделения туляремийного микроба, содержащие все необходимые факторы роста и не требующие добавления крови (или желтка). Примером является FT агар, выпускаемый Государственным Научным Центром прикладной микробиологии.

На свежей агаровой среде приживаются единичные бактерии, при этом формируются колонии, которые становятся заметными через 2-3 суток инкубации, редко - в более отдаленные сроки. Посевы следует выдерживать при 37 град. С до 10-12 суток. При посеве взвеси из растертых тканей животного высокоэффективные агаровые среды позволяют обнаруживать единичные бактерии и не уступают биологической пробе. При исследовании трупов животных в первую очередь производят посев из селезенки, печени, лимфатического узла. При посеве из недостаточно свежих органов животных полезно использовать селективные добавки (СД). В качестве СД можно применять пенициллин (100 ед/мл), ампициллин (100 ед/мл), полимиксин (50-100 мкг/мл), кефзол (или цефалексин), амфотерицин В (или амфоглюкамин), ристомицин - сульфат и некоторые другие.

СВЕРНУТАЯ ЖЕЛТОЧНАЯ СРЕДА МАККОЯ. Среду готовят из желтков куриных яиц, которые тщательно моют, протирают спиртом, обжигают на пламени горелки, разбивают, сливают желтки, отделяя их от белка, в стерильный градуированный сосуд, смешивают с физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) в соотношении: 60% желтка и 40% физиологического раствора. Жидкую среду разливают в пробирки по 4-5 мл и помещают в аппарат для свертывания сывороток при наклонном положении пробирок, чем достигают скашивания среды. Свертывание среды производят при 80 град. С в течение 1 часа. Среду сохраняют при 4-6 град. С, предохраняя от высыхания. Правильно приготовленная среда должна иметь на дне пробирки конденсационную жидкость. Приготовленную среду можно использовать в течение 1 месяца.

КРОВЯНАЯ СРЕДА ЕМЕЛЬЯНОВОЙ. Среду готовят на рыбно - дрожжевом гидролизате. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 20 мл гидролизата свежей рыбы, 10 мл гидролизата желатины, 2,5 мл аутолизата дрожжей, 0,5 г хлорида натрия, 1 г глюкозы, 0,1 г цистина (цистеина), 1,5-2,5 г агара (в зависимости от его качества); рН среды 7,0-7,2. После стерилизации в расплавленную и охлажденную до 45 град. С среду добавляют 10 мл свежей кроличьей или лошадиной дефибринированной крови, разливают в пробирки (или чашки) и скашивают. Правильно приготовленная кровяная среда хранится при 4-6 град. С в течение 1 месяца. Однако в процессе хранения чувствительность среды постепенно снижается. При необходимости в среду одновременно с кровью добавляют селективные добавки (СД).

FT АГАР. Питательная среда выпускается в виде комплекта, состоящего из рыбно - солевого агара (РСА), глюкозо - витаминной добавки (ГВД) и селективной добавки (СД). Состав и способ приготовления среды полностью описаны в инструкции по применению FT агара, прилагаемой к комплекту.

1.4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОБА. Биологическая проба является самым эффективным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом материале. Биологическим методом можно исследовать органы павших или убитых диких млекопитающих, кровососущих членистоногих, гидробионтов, воду, смывы с различных субстратов, т.е. материалы, где могут содержаться живые туляремийные бактерии. Для биологической пробы обычно используют белых мышей, которые заболевают и гибнут от туляремии при подкожном введении суспензии, содержащей единичные бактерии. При массивном инфицировании исследуемых объектов мыши погибают уже на 3-4 сутки; при меньшей обсемененности материала гибель животных может затянуться до 7-9 суток, иногда до 15-20 суток. В большинстве случаев животные погибают от туляремии с характерными патологоанатомическими изменениями: обнаруживаются воспалительные изменения ткани на месте заражения (плотный инфильтрат), увеличение, уплотнение и гиперемия лимфатических узлов, особенно близлежащих к месту заражения, резкая гиперемия сосудов подкожной клетчатки, уплотнение и увеличение селезенки, печени, увеличение и гиперемия надпочечников, гиперемия тонкого кишечника. В мазках - отпечатках из селезенки, печени и крови (при окраске по Романовскому - Гимзе или путем люминесцентной микроскопии) обнаруживают большое количество туляремийных бактерий, а в посеве на специальные питательные среды селезенки и печени уже через 18-24 часа появляется рост культуры возбудителя туляремии. Для биологической пробы могут быть использованы и морские свинки, обладающие такой же высокой чувствительностью к туляремии, как и белые мыши, а также дикие грызуны 1-ой группы (обыкновенные полевки, домовые мыши), отловленные на неэпизоотических территориях и выдержанные в карантине 30 суток. Биопробных животных содержат поодиночке. При гибели биопробных животных или обнаружении у забитых характерных для туляремии патологоанатомических изменений осуществляют следующий пассаж через белую мышь (подкожным или накожным методами).Биопробных животных выдерживают: белых мышей до 21 суток, морских свинок - до 25 суток, после чего забивают.

1.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ. Идентификацию осуществляют на основании совокупности следующих признаков: 1) морфологии и окраски бактерий в мазках и специфического свечения в РИФ; 2) характера роста на питательных средах; 3) отсутствия роста на простых питательных средах; 4) агглютинации специфической туляремийной сывороткой; 5) патогенности для белых мышей и морских свинок.

Выделенная культура должна иметь характерный для микроба туляремии рост на свернутой желточной среде в виде извилистого, слегка блестящего (не сухого) почти бесцветного налета не очень сильно выраженной слизистой консистенции, хорошо снимающегося петлей. Культура легко суспендируется. Для изучения морфологии и тинкториальных свойств готовят мазок на предметном стекле, который фиксируют и окрашивают по Граму. В мазке возбудитель туляремии представляет собой мелкую, грамотрицательную коккобактерию. В окрашенных мазках из культуры с плотной среды обнаруживается обильная слизь. Присутствие в мазке окрашенной слизи весьма характерно для возбудителя туляремии. Для проверки отсутствия роста на простых питательных средах используют слабощелочной питательный агар и бульон.

    Антигенную специфичность  выделенной  культуры   проверяют   с

помощью    реакции   агглютинации   с   лошадиной   (коммерческой)

агглютинирующей  сывороткой.   Для   этого   испытуемую   культуру

выращивают  в течение  2-х  суток  при  37  град. С  на  свернутой

желточной   среде   в  количестве  2-3  пробирок.  Чистоту  посева

контролируют бактериоскопией.  Реакцию  агглютинации  (РА)  ставят

общепринятым способом в пробирках.  В качестве антигена используют

живую  испытуемую  культуру,  суспендированную  в  физиологическом

                                        9

растворе (рН 7,0-7,2) до концентрации 10  м. кл./мл по оптическому

стандарту мутности,  соответствующей 10 единицам. После добавления

антигена  к  разведениям сыворотки пробирки выдерживают 2 часа при

37 град.  С,  затем 12-18 часов при комнатной  температуре,  после

чего проводят учет результатов.  Культура должна агглютинироваться

до титра или 2/3 титра сыворотки.  При  этом  должна  иметь  место

четкая  реакция,  сопровождающаяся полным просветлением жидкости и

выпадением на дно пробирки плотного агглютината.  При встряхивании

пробирки  аггютинат  разбивается  на  крупные  хлопья,  а жидкость

остается прозрачной.  Специфичность выделенной культуры может быть

подтверждена   также   с   помощью  РИФ.  При  обработке  культуры

туляремийной люминесцирующей сывороткой обнаруживают специфическое

яркое зелено - желтое свечение бактерий.

    Желательна проверка  вирулентности  выделенных культур,  но не

позднее  месячного   срока   после   их   выделения.   Определение

вирулентности  проводят,  как  правило,  на  одном  из  двух видов

животных (белые  мыши  или  морские  свинки).  Взвесь  исследуемой

культуры  готовят  на  физиологическом  растворе  (рН  7,0-7,2)  с

              -9

содержанием 10   м. кл/мл   по  оптическому   стандарту  мутности,

                                                       -1       -9

которую затем титруют путем 10-кратных разведений от 10   до  10

                                                          -9

от  исходной взвеси.  Для  заражения используют 2 дозы: 10   (1 м.

         -8

кл.) и  10  (10  м.  кл.)  по  2-3  животных   на   каждую   дозу.

Свежевыделенные   туляремийные  культуры  при  подкожном  введении

вызывают гибель белых мышей (морских свинок) при дозе  1 м. кл.  с

обнаружением  характерных  для  туляремии  изменений  в  органах и

выделением чистой культуры.

    На территории  Российской  Федерации  циркулируют и выделяются

культуры  голарктического   подвида   возбудителя   туляремии   F.

tularensis     subspecies     holarctica,     различающиеся     по

чувствительности  к  эритромицину    другим   макролидам).   Для

определения  этого  свойства  используют  диски  с  эритромицином,

содержащими  15  мкг  антибиотика.  Эта  концентрация  антибиотика

позволяет  дифференцировать  штаммы  туляремийного  микроба на два

биологических варианта:  биовар 1 Ery(s) и биовар  П  Ery(r).  Для

определения  принадлежности  к  тому  или  иному  биовару  готовят

                                                   9

суспензию испытуемой  культуры  в  концентрации  10  м. кл./мл  по

оптическому стандарту мутности.  0,5 мл такой суспензии вносят  на

чашку  с  агаровой средой,  равномерно распределяя по поверхности,

после  чего  накладывают  в  центральную  часть   чашки   диск   с

эритромицином.  Чашку помещают в термостат при 37 град.  С. Учет и

оценку результатов производят  через  1  -  2  суток.  При  посеве

чувствительной к эритромицину культуры вокруг диска с антибиотиком

обнаруживают выраженную зону задержки роста диаметром 2-3 см;  при

посеве культуры,  резистентной к эритромицину, по всей поверхности

чашки отмечается равномерный рост.

Возбудитель туляремии - грамотрицательные, неспорообразующие мелкие коккобактерии, не способные расти на простых питательных средах, обладают слабой ферментативной активностью (способны утилизировать до кислоты немногие углеводы и спирты на специальных средах), патогенные для теплокровных животных с приуроченностью размножения главным образом в паренхиматозных органах и способностью вызывать у чувствительных животных геморрагическую септицемию.

2. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В настоящее время в практике эпизоотологического обследования находят все большее применение серологические методы, предназначенные для обнаружения туляремийного антигена и антител к нему. Значительно расширился круг объектов исследования. Возможность исследования материала, не пригодного для бактериологического исследования, делает серологические методы в ряде случаев основным методическим приемом, позволяющим выявить туляремийные эпизоотии.

2.1. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ АНТИТЕЛ. Наиболее эффективными и доступными методами выявления антител являются реакция агглютинации (РА) и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Титры антител у переболевших диких животных колеблются в пределах 1:10 - 1:320, редко выше, в зависимости от давности заболевания. У сельскохозяйственных животных они могут достигать 1:320 - 1:640, но чаще бывают низкими. Для выявления антител у животных могут быть использованы сыворотка, плазма или "смывы" из грудной полости. Наличие антител у животных указывает на контакт животного с возбудителем туляремии и наличие эпизоотии. Техника постановки серологических реакций, их учет и анализ результатов подробно представлен в приложении 4 настоящего документа.

2.2. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО АНТИГЕНА. Все найденные трупы грызунов подлежат обязательному серологическому исследованию на наличие туляремийного антигена параллельно с бактериологическим исследованием, включая люминесцентную микроскопию. Серологические методы особенно эффективны при поисках антигена в ПП, ПХМ, субстратах гнезд и других объектов внешней среды.

2.2.1. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА К ИССЛЕДОВАНИЮ. При исследовании трупов диких или лабораторных животных готовят суспензию из кусочков органов животных (селезенка, печень) путем растирания их в ступке с добавлением физиологического раствора из расчета 1:5 или 1:10. Полученную суспензию прогревают на кипящей водяной бане 10-15 мин., фильтруют (лучше через асбестовую вату) для получения относительно прозрачного фильтрата. Можно использовать остатки суспензии из органов, приготовленных для постановки биологической пробы.

Для исследования субстрата гнезда грызунов желательно брать его целиком вместе с прилегающими слоями почвы. Материал заливают физиологическим раствором с избытком (примерно 10 мл). Через 1-6 часов надосадочную жидкость отсасывают, прогревают на кипящей водяной бане 10-15 мин., фильтруют и используют в серологических реакциях.

    Для серологического    исследования   бактериальной   культуры

последнюю выращивают  2 суток при  37  град. С  на  желточной  или

агаровой  среде,  готовят  взвесь  на физиологическом растворе (рН

                           9

7,0-7,2) с концентрацией 10  м. кл./мл по   оптическому  стандарту

мутности, обеззараживают  прогреванием  10-15  мин.   на   кипящей

водяной  бане.  Взвесь  разводят  в 10 раз до концентрации 100 млн

м. кл./мл, которую используют в серологических реакциях.

Наиболее эффективной и специфичной серологической реакцией для выявления туляремийного антигена при исследовании органов животных, ПП, ПХМ, субстрата гнезд, почвы и т.п. является реакция нейтрализации (РНАт) с туляремийным эритроцитарным диагностикумом. При исследовании некоторых объектов (бактериальные суспензии, органы животных и др.) помимо РНАт можно применять иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию объемной агломерации (РОА), реакцию коагглютинации (РК) и некоторые другие методы, с успехом используемые в отдельных регионах и учреждениях.

2.2.2. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ АНТИТЕЛ (РНАт). Этот метод является универсальным для выявления туляремийного антигена в любом исследуемом материале. РНАт может обнаруживать 1-2 млн туляремийных бактерий и служит простым дополнительным методом идентификации выделенной культуры. РНАт - трехкомпонентная серологическая реакция, механизм которой состоит в специфической нейтрализации вводимых в реакцию туляремийных антител антигеном, содержащимся в исследуемом материале В РНАт используют туляремийный антигенный эритроцитарный диагностикум.

ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ И УЧЕТ РНАт. Первоначально проводят ориентировочное исследование материала в 3-4 разведениях. Для этого в лунки полистироловой пластины наливают по 0,25 мл разводящей жидкости (1%-ный раствор нормальной кроличьей сыворотки на физиологическом растворе рН 7,0- 7,2, предварительно инактивированной при 56 град. С 30 мин.). Затем в первую лунку вносят 0,25 мл исследуемого материала и титруют переносом по 0,25 мл. Из последней лунки лишние 0,25 мл выливают. После этого во все лунки добавляют по 0,25 мл раствора туляремийной агглютинирующей сыворотки, содержащей 2 гемагглютинирующие единицы (2ГЕ) сыворотки.

Для определения гемагглютинирующей единицы (ГЕ) сыворотки в 6 лунок полистироловой пластины наливают по 0,5 мл разводящей жидкости. В первую лунку добавляют 0,5 мл туляремийной сыворотки в разведении 1:10000 (сыворотку предварительно инактивируют при 56 град. С 30 мин.) и титруют переносом из одной лунки в другую по 0,5 мл. Получают ряд разведений сыворотки 1:20000; 1:40000; 1:80000 и т.д. Затем во все лунки добавляют по 1 капле (0,05мл) антигенного диагностикума 2,5%-ной концентрации. Результаты учитывают через 2-3 часа. Разведение сыворотки в последней лунке с отчетливой агглютинацией эритроцитов соответствует 1 ГЕ. Для РНАт сыворотку берут в 4-х кратной концентрации, принимая во внимание, что в лунки добавляют по 0,25 мл, т.е. именно в данном объеме должны содержаться 2ГЕ. Например, если 1ГЕ составляет 1:80000 (в объеме 0,5 мл), то 2ГЕ = 1:40000, а поскольку в РНАт сыворотку добавляют в объеме 0,25 мл, то применительно к данному примеру для постановки реакции следует использовать сыворотку в разведении 1:20000.

Смесь исследуемого материала и сыворотки оставляют на 1-1,5 часа при комнатной температуре. Затем во все лунки добавляют по одной капле (0,05 мл) антигенного эритроцитарного диагностикума 2,5%-ной концентрации. Пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола. Учет производят через 2-3 часа.

Если в исследуемом материале содержится антиген туляремийного микроба, то он нейтрализует сыворотку и эритроциты не агглютинируются, а образуют на дне лунки маленькое колечко с ровными краями. Результат реакции в таких лунках отмечается как положительный, а в протоколах отмечают знаком (-). При отсутствии в исследуемом материале туляремийного антигена наблюдается агглютинация эритроцитов во всех лунках. Результат отмечают как отрицательный, а в протоколах обозначают знаком (+). В каждом опыте должен быть контроль количества ГЕ.

Пробы, в которых в предварительном опыте был обнаружен антиген, отбирают и реакцию повторяют в развернутом опыте (на 6-10 лунок) для определения точного титра реакции. За титр реакции принимают последнее разведение исследуемого материала, вызывающее полное подавление агглютинации эритроцитов. Окончательный опыт дополняют следующими контролями: 1) 0,25мл исследуемой пробы + 0,25 мл разводящей жидкости + 1 капля диагностикума; 2) 0,5 мл разводящей жидкости + 1 капля диагностикума. В обоих случаях агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

При небольшом количестве материала целесообразно ставить РНАт в микрообъемах, используя микротитратор типа Такачи или круглодонные микропланшеты с микропипетками. Чувствительность реакции при этом существенно не меняется. Техника постановки, последовательность всех манипуляций, учет и оценка результатов, а также соответствующие контроли такие же, как и при постановке РНАт в макрообъемах. Более подробно описание техники постановки реакций в микрообъемах см. в приложении 4.

При массовых исследованиях ПП, ПХМ, других объектов внешней среды за диагностический титр принимают разведение фильтрата 1:20 и выше. Реакции в более низких титрах расценивают как сомнительные.

    2.2.3. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ НА ТВЕРДОФАЗНОМ НОСИТЕЛЕ (ИФА).

Метод  используется  для  выявления   туляремийного   антигена   в

различных  объектах:  органы  животных,  ПП,  ПХМ,  другие объекты

внешней  среды,  а  также  для  идентификации  выделенных  культур

возбудителя     туляремии.     Метод    характеризуется    высокой

чувствительностью,  специфичностью,  возможностью количественной и

автоматизированной   оценки   результатов,   воспроизводимостью  и

стандартностью  основных  ингредиентов  анализа.  С  помощью   ИФА

                        4       4

возможно обнаружение  10  - 5.10  туляремийных бактерий в 1 мл или

1-5 нг/мл туляремийного антигена.

Для постановки ИФА используют диагностическую иммуноферментную тест - систему для определения туляремийного антигена. В соответствии с назначением тест - система представляет собой набор ингредиентов для проведения ИФА и включает в себя: иммуноглобулины туляремийные, выделенные из лошадиной сыворотки; иммуноглобулины туляремийные, выделенные из лошадиной сыворотки, меченные пероксидазой; туляремийный антиген (ЛПС), полученный из вакцинного штамма туляремийного микроба; набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов; субстрат - О - фенилендиамин (ОФД); твин-20; бычий сывороточный альбумин (БСА); планшеты для ИФА однократного применения.

Выявление туляремийного антигена в ИФА происходит за счет специфического взаимодействия иммуноглобулинов туляремийных, сорбированных на планшете, с туляремийным антигеном, содержащимся в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антитело - антиген" выявляют с помощью туляремийных антител, меченных пероксидазой.

 

ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ ИФА

 

1. СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ ТВЕРДОЙ ФАЗЫ. В лунки планшета вносят с помощью дозатора по 200 мкл раствора туляремийных иммуноглобулинов в рабочем разведении (20 мкг/мл) в 0,02 М растворе фосфатно - солевого буфера (ФСБ) рН 7,2. Адсорбцию туляремийных иммуноглобулинов проводят в течение 120 минут при температуре 37 град. С или 18 часов при температуре 20 град. С. По окончании адсорбции иммуноглобулины удаляют из лунок планшета встряхиванием и отмывают трехкратно по 5 мин. раствором ФСБ, содержащим 0,05% детергента - твин-20.

    2. ВНЕСЕНИЕ  ИССЛЕДУЕМОГО  МАТЕРИАЛА.  Исследуемый  материал в

разведениях (двух- или десятикратных) на  ФСБ-твин,  содержащий 1%

БСА,  вносят по 100 мкл в каждую лунку. Параллельно с исследуемыми

образцами готовят серию последовательных  разведений  контрольного

                                                                 4

образца туляремийного антигена (ЛПС) в концентрациях от 1  до  10

нг/мл и каждое разведение антигена в количестве 100 мкл  вносят  в

лунки планшета.

Планшеты выдерживают в термостате при температуре 37 град. С в течение 1 часа, после чего жидкость из планшета удаляют встряхиванием и отмывают планшеты, как указано в п.1.

3. ВНЕСЕНИЕ КОНЪЮГАТА. В каждую лунку вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении (указанном на этикетке); конъюгат разводят на ФСБ-твин, содержащий 1% БСА. Планшеты выдерживают в термостате при температуре 37 град. С в течение 1 часа. Жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают планшеты, как указано в п. 1.

4. ПРОЯВЛЕНИЕ. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора, содержащего 0,04% ОФД и 0,04% H2O2 в 0,1 М цитратно - фосфатном буфере рН 5,5. Инкубацию проводят в темноте при комнатной температуре 15-30 минут и останавливают внесением в лунки по 100 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.

5. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ. Оценку результатов проводят по изменению окраски субстратной смеси (от светло - коричневой до оранжево - коричневой) визуально или с помощью микроэлектрофотометра типа Multiscan при 492 нм, сравнивая интенсивность окраски контрольных и опытных проб. Пробы рекомендуется исследовать параллельно в 2 лунках с последующей раститровкой положительных образцов. При исследовании материала на наличие антигена его следует первично разводить 1:100 (по весу или объему), а при получении положительных результатов - раститровать пробы путем двукратных разведений. Появление желто - оранжевого окрашивания в опытных лунках (и положительном контроле с ЛПС) при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями свидетельствует о наличии туляремийного антигена в пробах. При фотометрическом учете результатов анализа проба считается положительной, если ее оптическая плотность (ОП) в 2 и более раза превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей, которое не должно превышать 0,25.

3. МОЛЕКУЛЯРНО - БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В последние годы в ряде случаев используют метод определения ДНК возбудителя туляремии в различных объектах с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод превышает по чувствительности как бактериологические, так и серологические методы, а также позволяет выявлять некультивируемые или "покоящиеся" формы возбудителя туляремии, что важно для прогнозирования эпизоотической ситуации и определения потенциальной эпидемической опасности природных очагов.

 

Заместитель руководителя

Департамента госсанэпиднадзора

С.И.ИВАНОВ

 

 

 

 

 

Приложение N 3

к приказу Министерства

здравоохранения

Российской Федерации

от 14.04.1999 г. N 125

 

КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ТУЛЯРЕМИИ

 

(Методические указания)

 

Туляремия - острое лихорадочное заболевание токсико - аллергического, реже септического характера, вызываемое мелкой грамотрицательной коккобактерией Francisella tularensis.

Широкий круг животных - источников инфекции и разнообразие путей заражения людей обусловливает полиморфизм клинических проявлений этого заболевания.

Международная статистическая классификация болезней (десятый пересмотр, ВОЗ 1995 год) предусматривает следующие клинические формы туляремии: ульцерогландулярная туляремия (по старой классификации - язвенно - бубонная, синоним - кожно - бубонная); окулогландулярная туляремия (глазо - бубонная, офтальмическая); легочная туляремия (торакальная); желудочно - кишечная туляремия (абдоминальная); генерализованная туляремия; другие формы туляремии (в том числе ангинозно - гландулярная); туляремия неуточненная.

По тяжести инфекционного процесса различают легкие, средней тяжести и тяжелые клинические формы туляремии. По длительности течения различают острую, затяжную и рецидивирующую формы туляремии.

Во время эпидемических вспышек выявляют инапарантную (бессимптомную, латентную) туляремию.

Пути внедрения возбудителя в организм в значительной мере определяют последующее развитие той или иной клинической картины.

Инкубационный период при туляремии в большинстве случаев в среднем составляет 3-7 дней с колебаниями в ту или иную сторону (от нескольких часов до 2-3 недель), в зависимости от дозы заражения и входных ворот инфекции. Для туляремийной инфекции нехарактерно наличие продромального периода. Независимо от клинической формы для туляремии типично острое (редко постепенное) начало с познабливанием или потрясающим ознобом и резким повышением температуры тела до 38-40 град. С и выше. Вначале лихорадка носит постоянный характер, а затем могут быть различные варианты. Для начального периода характерны слабость, головная боль, головокружение, снижение аппетита, язык обложен серовато - белым налетом, имеют место разной локализации мышечные боли, особенно в поясничной области и икроножных мышцах, нарушение сна, повышенная потливость, особенно в ночные часы, отставание пульса от температуры (относительная брадикардия), тенденция к снижению кровяного давления.

Продолжительность начального периода общих клинических проявлений 2-3 дня, затем обнаруживаются признаки той или иной клинической формы. Длительность лихорадочного периода при туляремии 2-3 недели и более в зависимости от клинической формы, тяжести заболевания и начала специфического лечения. В тяжелых случаях - сильная головная боль, бессонница, эйфория; характерен своеобразный внешний вид больного - синюшно - багровый цвет лица, наиболее выраженный на веках, вокруг глаз, на губах, на мочках ушей. Нередко вокруг подбородка - бледный треугольник - facies tularaemica, отмечаются явления конъюнктивита, сосуды склер инъецированы, точечные кровоизлияния на слизистой оболочке полости рта, возможны носовые кровотечения. Печень увеличивается и пальпируется со 2-3 дня болезни, селезенка обычно увеличивается позже - с 6-9 дня болезни.

При осмотре кожных покровов можно выявить элементы сыпи, эритематозного, папулезного, розеолезного и петехиального характера. Сыпь чаще обнаруживается при затяжном течении болезни, возникая с 3 дня, и держится до 8-12 дня болезни. После угасания сыпи появляется пластинчатое или пластинчато - отрубевидное шелушение; пигментация после сыпи сохраняется до недели.

Температура быстро нарастает ко 2-3 дню болезни; типы температурных кривых самые разнообразные: ремиттирующая, неправильно интермиттирующая, постоянная и ундулирующая. Волнообразная лихорадка связана с поражением лимфатической системы, ее подъемы совпадают с периодом нагноения лимфоузлов. Продолжительность лихорадки колеблется от 5-7 дней до 30 дней, чаще 2-3 недели. Фаза выздоровления сопровождается непостоянным субфебрилитетом. В случае присоединения осложнений (пневмония, плеврит) изменяется и характер лихорадочной ремиссии (ремиттирующая и интермиттирующая).

Продолжительность болезни составляет в среднем от 16 до 30 суток, при преобладании поражения лимфатической системы (по старой классификации - развитии бубонов) болезнь затягивается до 2-3 месяцев.

Для туляремии характерна умеренная лейкопения или нормоцитоз в первые дни болезни, в разгаре болезни наблюдается палочкоядерный сдвиг, токсическая зернистость в нейтрофилах, лимфоцитоз, моноцитоз (в 3-4 раза), эозинопения, при тяжелом течении - анэозинофилия, лейкоцитоз, ускоренная СОЭ.

В месте заноса возбудителя лимфогенно и/или гематогенно могут образовываться характерные для туляремии очаговые некрозы, со своеобразной клинической симптоматикой.

Лимфадениты занимают центральное место в клинике туляремии.

Поскольку начальный период заболевания не имеет патогномоничных симптомов для диагностики туляремии исключительно важное значение имеет тщательный эпидемиологический анамнез. Характерным для туляремии в эпидемиологическом отношении является отсутствие контагиозности, т.е. опасности заражения здоровых людей от больного человека. Учитывая это обстоятельство, при необходимости больной может быть госпитализирован в терапевтическое или другое отделение.

 

1. УЛЬЦЕРОГЛАНДУЛЯРНАЯ ФОРМА ТУЛЯРЕМИИ (ПО СТАРОЙ КЛАССИФИКАЦИИ ЯЗВЕННО - БУБОННАЯ). Для этого клинического варианта характерно наличие кожного дефекта (язвочки), или как принято называть первичного аффекта, в месте внедрения возбудителя. Язвочка, а она может быть не одна, чаще образуется в результате трансмиссивного заражения - укуса слепня, комара и редко при непосредственном присасывании клеща. Язвочка, как правило, локализуется на открытых частях тела (шея, предплечья, голени), проходит динамику развития: пятно, папула,везикула,пустула, язва.

Трансмиссивный путь заражения типичен для летнего (теплого) времени года.

Данная форма туляремии может быть также результатом контактного заражения при снятии шкурок, разделке тушек инфицированных животных, таких как зайцы, ондатры, водяные полевки. Размер язвочек, как правило, не превышает 5 - 7 мм в поперечнике. Края ее несколько приподняты за счет инфильтрации ткани; отделяемое язвочки серозно - гнойное, скудное, болезненность незначительная. Образование первичного аффекта в виде изъязвления кожи всегда сопровождается лимфаденитом - увеличением и умеренной болезненностью лимфатических узлов, их локализация связана с местом внедрения возбудителя. Наличие лимфангоита для ульцерогландулярной формы туляремии нетипично. Язвочка заживает под коркой довольно медленно, в течение 2-3 недель, а иногда и больше и оставляет после отпадения корочки депигментированное пятно или уплощенный рубец.

Эта форма туляремии протекает обычно легко и значительно реже - средней тяжести. Длительность заболевания обычно не превышает 2-3 недель, особенно при своевременно предпринятом специфическом лечении. Язвочка в силу небольших размеров и потому, что не причиняет особых болезненных ощущений, иногда остается незамеченной больными (примерно в 15% случаев). Иногда дефект кожи на месте заражения может вообще отсутствовать и тогда ведущим в клиническом симптомокомплексе заболевания является увеличенный лимфоузел, т.е. воспаление регионарного лимфатического узла. Локализация лимфаденита в этих случаях является четким указанием на место входных ворот инфекции.

2. ГЛАНДУЛЯРНАЯ ФОРМА ТУЛЯРЕМИИ (ПО СТАРОЙ КЛАССИФИКАЦИИ БУБОННАЯ). Как правило, лимфаденит при туляремии наблюдается в результате контактного заражения, т.е. при обработке и разделке тушек инфицированных животных. Возможно заражение также и трансмиссивным путем и через инфицированную воду при переходе вброд. Чаще заражение происходит через кожу рук с последующим вовлечением в воспалительный процесс группы локтевых и подмышечных лимфатических узлов. Лимфаденит развивается через 2-3 дня от начала болезни, постепенно увеличиваются лимфоузлы и достигают максимума размеров к 5-8 дню болезни. Различают первичный и вторичный лимфаденит. Первичный аффект возникает вследствие лимфогенного распространения возбудителя, вторичный лимфаденит развивается при гематогенном распространении возбудителя, как результат септического туляремийного процесса. Лимфаденит бывает одиночным и множественным - вовлекается группа регионарных лимфоузлов, возникают конгломераты лимфоузлов и отчасти в процессе участвуют и прилегающие ткани (периаденит). Отдельные лимфоузлы в составе конгломерата претерпевают различные изменения. В то время как в одних наблюдается острое воспаление, другие нагнаиваются и самопроизвольно вскрываются.

Выделяют несколько периодов развития лимфаденита: начальный, период полного формирования, период угасания или обратного развития.

Размеры лимфаденита могут варьировать от лесного ореха до размеров куриного яйца, а иногда и больше. Подвижность лимфоузла ограничена, болезненность не резко выражена, явления периаденита умеренно выражены или отсутствуют. Исход лимфаденита, как и при других клинических формах, может быть различным: полное рассасывание, нагноение с последующим самопроизвольным или хирургическим вскрытием, заканчивающимся рубцеванием.

При изъязвлении лимфоузла выделяется густой сливкообразный гной с формированием свища и дальнейшим рубцеванием и склеротизацией - стойким уплотнением лимфоузла в результате замещения ткани узла соединительной тканью.

При нагноении и четкой флюктуации следует произвести хирургическое вскрытие. В этом случае происходит более быстрое заживление. Один из исходов туляремийного лимфаденита - уменьшение его в размерах, уплотнение за счет замены дифференцированной ткани соединительной тканью. В таком состоянии лимфатический узел может оставаться длительное время (месяцами). Обычно размеры таких склеротизированных лимфатических узлов невелики (не превышают размеров боба или лесного ореха), они безболезненны и практически больных не беспокоят. Лимфоузлы рассасываются медленно и волнообразно со сменой периодов обострения и ремиссии. Исход лимфаденита, длительность заболевания находятся в прямой зависимости от своевременного специфического лечения.

Что касается дифференциального диагноза ульцерогландулярной и гландулярной формы туляремии, то следует иметь в виду лимфадениты при чуме, кожную форму сибирской язвы, туберкулез лимфатических узлов, инфекционный мононуклеоз и другие заболевания, характеризующиеся воспалением и увеличением периферических лимфатических узлов.

Указанные клинические варианты туляремии могут быть результатом заражения не только в теплое время года, но и в другие сезоны, что определяется особенностями хозяйственной деятельности людей и их контактами с природой. Трансмиссивные вспышки или групповые заболевания обычно охватывают и детей.

3. ОКУЛОГЛАНДУЛЯРНАЯ ФОРМА ТУЛЯРЕМИИ (ОФТАЛЬМИЧЕСКАЯ, ПО СТАРОЙ КЛАССИФИКАЦИИ - ГЛАЗО - БУБОННАЯ). Как следует из названия, эта форма развивается в результате заражения через слизистую оболочку глаза. Для этого клинического варианта характерным является острый специфический конъюнктивит с сильным слезотечением, выраженной отечностью век до резкого сужения глазной щели, резко выраженное набухание переходной складки, слизисто - гнойное отделяемое. На слизистой оболочке, особенно нижнего века, отмечаются воспалительные образования в виде желтовато - белых узелков, размером с просяное зерно. Иногда из-за отечности век больной не в состоянии открыть глаз. Специфические поражения глаз при туляремии, как правило, односторонние, сопровождающиеся воспалительной реакцией со стороны предушных и подчелюстных лимфатических узлов, т.е. формирование лимфаденита. Заражение происходит при умывании водой из инфицированных водоисточников или при купании, а также при случайном внесении в глаз инфекции руками. В связи с этим окулогландулярная (офтальмическая) форма может проявляться в сочетании с ульцерогландулярной или гландулярной формами туляремии.

Офтальмическая форма туляремии протекает довольно тяжело, однако встречается сравнительно редко -1-2% случаев. Объяснением этому служит бактерицидное действие лизоцима слезы, поэтому специфический туляремийный конъюнктивит может развиваться в результате попадания на слизистую оболочку глаза большой дозы возбудителя.

Случаи офтальмической формы туляремии регистрируются среди различных контингентов людей - охотников, промысловиков, жителей того или иного населенного пункта, пользующихся водой из инфицированного колодца, ручья или другого водоисточника.

Длительность заболевания, возможные осложнения в виде дакриоцистита - воспаления слезного мешка до флегмоны включительно и исход конъюнктивита зависят от своевременного специфического лечения. В дифференциальной диагностике туляремийный конъюнктивит следует отличать от конъюнктивита, вызываемого стрептококком, стафилококком и др. патогенными агентами.

4. ЛЕГОЧНАЯ ФОРМА ТУЛЯРЕМИИ (ТОРАКАЛЬНАЯ). Для этой формы туляремии характерно развитие первичного воспалительного процесса в легких, частота пневмоний колеблется от 11 до 30%. Заражение происходит аспирационным путем при обмолотах, других сельскохозяйственных работах (перекладка ометов, скирд, стогов, подвозка кормов, обслуживание животноводческих ферм), когда возможно вдыхание инфицированной пыли. Такой путь заражения может иметь место на предприятиях по переработке сельскохозяйственных продуктов в случае использования сырья, инфицированного выделениями больных грызунов или попаданием их трупов (мельницы, элеваторы, крахмально - паточные заводы и т.п.). В редких случаях аспирационное заражение туляремией может произойти в условиях специализированных лабораторий.

В результате аспирационного заражения патологический процесс развивается непосредственно в легких и клиническая картина выражается в пневмонии (очаговой, сегментарной, лобарной, диссеминированной), бронхопневмонии, бронхите. В отдельных случаях процесс может ограничиться трахеитом. Наиболее тяжело протекает пневмонический вариант, который характеризуется резким повышением температуры тела до 39-40 град. С. Лихорадочная реакция может быть в виде двух волн; характерно наличие одышки, вначале сухой кашель, а затем - с небольшим количеством слизистой или слизисто - гнойной вязкой мокроты, а в последующем возможна и примесь крови. Выражена общая интоксикация, состояние адинамии, профузные поты, особенно в ночные часы. Нередко больных беспокоят загрудинные боли, связанные с вовлечением в воспалительный процесс трахеобронхиальных лимфатических узлов. Физикальные явления скудные и появляются поздно. Перкуторно определяется притупление звука, аускультативно - наличие разного калибра сухих и влажных хрипов; вовлекается в процесс плевра. Нередко наблюдается увеличение печени, селезенки, ослабление сердечной деятельности. В периферической крови отмечается лейкоцитоз, а в тяжелых случаях лейкопения, ускорение оседания эритроцитов. Для легочной и других клинических форм туляремии не характерны такие катаральные явления, как насморк, герпес.

Туляремийная пневмония не отличается какими-либо патогномоничными симптомами, на основании которых на ранних этапах можно заподозрить туляремийную пневмонию, поэтому клинический диагноз нередко связан с затруднениями в начальный период болезни. Рентгенологически определяется усиление легочного рисунка за счет периваскулярных и перибронхиальных инфильтратов. При туляремийной пневмонии кроме того отмечается усиление теней в области бифуркации бронхов в результате вовлечения в патологический процесс трахеобронхиальных лимфатических узлов. Обнаруживается увеличение прикорневых, паратрахиальных и медиастинальных лимфатических узлов в первом и втором косых положениях, но не ранее 7 дня болезни. Заболевание продолжается 4-6 недель и более в зависимости от тяжести и сроков начала специфического лечения. Болезнь протекает тяжело и длительно (до 2-х месяцев и более), с наклонностью к рецидивам и развитию специфических осложнений (абсцессы, бронхоэктазы, плевриты и др.). Некротизация в пораженных участках легкого может привести к образованию полостей различной величины (туляремийные каверны). Период реконвалесценции обычно продолжительный с медленным восстановлением сил больного и трудоспособности, особенно у людей пожилого возраста. Туляремийные бронхиты или трахеиты, без развития пневмонии, протекают со средней степенью тяжести или легко.

От первичной легочной формы туляремии следует отличать вторичную, которая может присоединиться как осложнение к любой другой клинической форме. Вторичная пневмония развивается в более поздние сроки болезни, сопровождается ухудшением состояния больного.

Клинические проявления, длительность болезни, развитие осложнений при туляремии зависят от клинической формы, сроков начала лечения, возраста больного, наличия других сопутствующих заболеваний, в том числе хронических. Как правило, туляремия заканчивается выздоровлением, летальность не превышает десятых долей процента (в прошлом до 5%).

5. ЖЕЛУДОЧНО - КИШЕЧНАЯ ФОРМА ТУЛЯРЕМИИ (АБДОМИНАЛЬНАЯ). Так же как при ангинозно - гландулярной, абдоминальная форма является результатом алиментарного (орального) заражения, т.е. при употреблении продуктов, инфицированных выделениями больных грызунов, недостаточно термически обработанного мяса, чаще инфицированного зайца, реже - при употреблении воды из инфицированных источников. В сравнении с другими клиническими вариантами абдоминальная форма туляремии встречается сравнительно редко и недостаточно изучена. Возможно поэтому она не всегда правильно диагностируется. Развитие абдоминальной туляремии происходит лишь при массивной дозе заражения, так как желудочный сок с нормальным или повышенным содержанием соляной кислоты является мощным фактором неспецифической защиты на пути продвижения возбудителя по желудочно - кишечному тракту. В отдельных случаях нельзя исключить возможность заражения людей с низким содержанием соляной кислоты в желудочном соке. В числе симптомов для этой клинической формы характерны высокая температура тела, боли в животе разной интенсивности и продолжительности - ноющие, схваткообразные, боли, разлитые по всему животу или сосредоточенные в определенной области, имитирующие картину острого живота. Язык обложен суховатым серо - белым налетом; характерны тошнота, рвота, метеоризм, проявление общей интоксикации, вовлечение в процесс мезентериальных (регионарных) лимфатических узлов и лимфатических образований в стенке тонкого кишечника. Может иметь место увеличение печени и селезенки. Со стороны желудочно - кишечного тракта чаще наблюдается задержка стула, но возможен и жидкий стул, причем с самого начала заболевания. Описаны случаи обнаружения язв в слизистой подвздошной и толстой кишки, а также пилорической части желудка и 12-перстной кишки.

В сравнении с другими клиническими вариантами абдоминальная форма туляремии протекает более тяжело и весьма сходна с клинической симптоматикой брюшного тифа, что в свое время послужило основанием называть ее тифоидной. В отдельных случаях у больных с тонкой брюшной стенкой и слабо выраженным жировым слоем удается прощупать увеличенные и плотные мезентериальные лимфатические узлы или их конгломераты. Лимфадениты указанной локализации могут вызывать раздражение брюшины и быть причиной болей в животе. Наиболее тяжелым осложнением является нагноение и самопроизвольное вскрытие мезентериальных лимфатических узлов (с развитием перитонита).

С учетом клинических проявлений и их динамики, для дифференциальной диагностики решающее значение должны иметь данные эпидемиологического анализа и лабораторные исследования. Следует иметь в виду, что в тяжелых случаях появление специфических антител может быть отмечено только через 3-4 недели от начала заболевания.

6. ГЕНЕРАЛИЗОВАННАЯ ФОРМА ТУЛЯРЕМИИ (ТИФОИДНАЯ, СЕПТИЧЕСКАЯ) характеризуется тяжелым течением, развитием общих симптомов болезни, без предшествующих локальных изменений. Выражен токсикоз, иногда отмечается потеря сознания, бред, адинамия. Наблюдаются сильные головные и мышечные боли, анорексия.

Лихорадка волнообразная, продолжительностью до 3-х недель и более. На коже отмечаются высыпания, поражаются сосуды. Сыпь появляется обычно во второй половине заболевания. Нередко возникают симметричные высыпания на нижних и верхних конечностях, у некоторых больных на лице, шее, груди. Сыпь розово - красного цвета, постепенно становится багрово - медной и в последующем приобретает лиловые оттенки. Описаны "перчатки", "гетры", "носки", "воротник", "маска" - места сгущения сыпи. Держится сыпь 8-12 дней, сыпь разрешается шелушением, напоминающим скарлатину или псевдотуберкулез.

Высыпание нередко сопровождается припухлостью суставов (кисти, стопы), болезненностью, отечностью пальцев, что затрудняет движения. Печень и селезенка увеличены. Выздоровление наступает медленно, возможны рецидивы болезни, в том числе и через несколько лет. Эту форму наблюдали в случае внутрилабораторного заражения.

7. АНГИНОЗНО - ГЛАНДУЛЯРНАЯ ФОРМА ТУЛЯРЕМИИ (АНГИНОЗНО - БУБОННАЯ). В этом случае заражение происходит через рот при употреблении продуктов, инфицированных больными грызунами, их выделениями на складах, в амбарах, кладовых, других хранилищах, при употреблении воды из инфицированных водоисточников при попадании в них больных грызунов или их трупов. Ангинозно - гландулярная форма развивается также при употреблении недостаточно термически обработанного мяса, чаще зайца. Последнее наблюдается, как правило, в семьях охотников. Случаи ангинозно - гландулярной формы наблюдаются при пищевых или водных вспышках. Входными воротами инфекции служит слизистая оболочка миндалин, хотя при заражении через рот практически внедрение микроба может произойти на любом участке слизистой желудочно - кишечного тракта. Для этого клинического варианта характерно наличие специфической ангины, а именно: гиперемия и отечность миндалин с синюшным оттенком, серовато - белые налеты, сливающиеся или в виде островков, возможны изъязвления. Туляремийные ангины чаще могут быть односторонними. Нередко отмечается отечность и гиперемия дужек и мягкого неба, язык обложен серовато - белым налетом. При глотании ощущается болезненность, но не столь выраженная в сравнении с изменениями миндалин язвенно - деструктивного характера. В ряде случаев патологический процесс на слизистой глотки может ограничиться явлениями катаральной ангины. Одновременно с развитием ангины наблюдается увеличение, нередко до размеров куриного яйца и больше, подчелюстных, переднешейных, а иногда и надключичных лимфатических узлов. В области лимфаденита кожа обычно мало изменена или не изменена, при пальпации ощущается болезненность, уплотнение, ограничение подвижности лимфатических узлов. Иногда такого совпадения во времени - образования лимфаденита с развитием процесса на миндалинах - не наблюдается, и формирование лимфаденита происходит значительно позже. В случае заражения массивной дозой возбудителя не исключено сочетание ангинозно - гландулярной и абдоминальной форм туляремии, особенно у людей с пониженным содержанием кислотности желудочного сока.

Продолжительность туляремийной ангины колеблется от 8 до 24 дней.

При диагностике ангинозно - гландулярной формы туляремии, при которой процесс, как правило, односторонний, наиболее важно дифференцировать с дифтерией. Однако необходимо иметь в виду и определенное сходство между туляремийной ангиной и дифтерией. Здесь, как и в других случаях, необходимо ориентироваться на эпидемиологические и лабораторные данные.

ДИАГНОЗ ТУЛЯРЕМИИ основывается на данных клинического, эпидемиологического и лабораторного анализов. Весьма важное значение принадлежит эпидемиологическому анамнезу, который должен быть детальным и исчерпывающим. Особое внимание должно быть уделено выяснению наличия вакцинации против туляремии в прошлом и ее сроков, данным о переболевании этой инфекцией ранее, выяснение профессиональной занятости и ряду других факторов, которые необходимы для того, чтобы в каждом отдельном случае подтвердить или исключить диагноз туляремии. Последнее необходимо для определения тактики лечения, а также проведения профилактических мероприятий. В случаях туляремии с наружно выраженными клиническими проявлениями: ульцерогландулярная, гландулярная, офтальмическая, тонзиллогландулярная формы и учетом эпидемиологических данных, диагноз туляремии не должен вызывать затруднений. Что касается легочной и абдоминальной форм туляремии, то здесь существенная роль принадлежит анамнестическим данным и результатам лабораторного анализа.

В ряде случаев при позднем начале лечения заболевание принимает затяжной характер, а в последующем возможны рецидивы. Рецидив может наступить через короткие сроки после перенесенного заболевания (4-6 месяцев), а также через 2-6 лет спустя и более. Чаще всего рецидив проявляется в виде воспаления лимфатических узлов на месте первоначального регионарного лимфаденита. Воспаление лимфатических узлов при рецидивах развивается постепенно без повышения температуры тела и особого расстройства в общем состоянии больного. Несколько позже присоединяется субфебрилитет, слабость, возможны потливость, нарушение сна. Лимфоузлы обычно не достигают таких размеров, как при первичном заболевании, болезненность их не выражена. Исход лимфаденита при рецидивах может быть таким же, как и при первичном заболевании, однако нагноение происходит значительно реже.

Патогенез туляремийных рецидивов мало изучен, но можно предполагать, что развитие их обусловлено длительной персистенцией возбудителя в организме. В каждом конкретном случае диагноза "рецидив туляремии" необходимо установить связь с ранее перенесенным заболеванием и исключить возможность повторного заражения, проследить за наличием антител в крови и нарастанием их титра. Имеются также немногочисленные данные, указывающие на возможность хронического течения туляремии, но этот вопрос нуждается в уточнении.

 

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУЛЯРЕМИИ

 

Спорадическая заболеваемость туляремией, полиморфизм клиники вызывают определенные трудности постановки диагноза. Особенно это затруднительно в начальном периоде болезни. Именно в этот период туляремию часто смешивают с гриппом, брюшным или сыпным тифом, пневмонией и др. В последующем следует дифференцировать ее от сибирской язвы, язвенно - некротической ангины, листериоза, гнойных лимфаденитов и лимфангоитов, паротита, бубонной формы чумы, бруцеллеза, доброкачественного лимфоретикулеза и содоку.

Гландулярную форму туляремии следует отличать от таковой при чуме. При чуме более выражен токсикоз, состояние больного значительно тяжелее. Туляремийный лимфаденит отличается выраженными контурами, меньшей болезненностью по сравнению с чумными бубонами, относительно умеренным периаденитом, отсутствием грозных осложнений и благоприятным исходом. Язвы при туляремии также менее болезнены, чем при чуме. Туляремийная пневмония отличается отсутствием кровавой мокроты (за редким исключением). Больные при туляремии не контагиозны.

Гнойные банальные лимфадениты (стафилококковые и стрептококковые) характеризуются резкой болезненностью, ранним нагноением по сравнению с туляремией, развитием периаденита и лимфангоита. При туберкулезных лимфаденитах начало болезни постепенное, с субфебрильной температурой, лимфоузлы плотные, болезненность их отсутствует и, как правило, не достигают размеров как при туляремии. Туляремийные лимфадениты в отличие от лимфаденопатии, наблюдаемой при бруцеллезе, отличаются строгой привязанностью к входным воротам инфекции. Помогают диагностике лабораторные исследования.

В отличие от дифтерии ангина при туляремии характеризуется более острым началом, чаще односторонней локализацией и редкостью распространения налетов за пределами миндалин. Однако может быть много сходных черт, поэтому решающее слово остается за результатами лабораторных исследований и аллергической пробой. Туляремийные высыпания чаще симметричны и более полиморфны в отличие от брюшного или сыпного тифа.

При паротите шейные лимфатические узлы увеличены незначительно. Отмечается резкая болезненность при надавливании на козелок уха, имеется выраженная отечность той или другой половины лица.

Поскольку туляремия является острым лихорадочным заболеванием, может возникнуть необходимость проведения дифференциального диагноза с такими болезнями, как малярия, лихорадка Ку, сепсис, сифилис, туберкулез, паротит и др. Всегда необходимо помнить, что трудность распознавания туляремии по клиническим признакам обусловливает необходимость комплексной диагностики с учетом данных эпидемиологического анализа, клинических наблюдений и лабораторного исследования.

 

ЛЕЧЕНИЕ

 

Больные туляремией, как правило, подлежат госпитализации. Лечение туляремии включает как неспецифическую, так и специфическую терапию. Успех лечения в значительной мере зависит от специфической терапии и сроков ее начала. Лечение должно быть сугубо индивидуальным, патогенетически обоснованным, этиотропным и комплексным, включая и симптоматическую терапию. В каждом отдельном случае необходимо учитывать особенности той или иной клинической формы, фазы, тяжести заболевания, возраста больного, наличие сопутствующих заболеваний и др. В настоящее время имеется ряд антибиотиков, весьма эффективных для лечения туляремии, в частности, препаратов группы аминогликозидов. Так, в тяжелых и средней тяжести случаях применяют гентамицин или амикацин (полусинтетическое производное канамицина) при парентеральном введении. Тот и другой препарат имеют широкий спектр действия, обладают выраженными бактерицидными свойствами. Оба препарата быстро проникают в ткани и жидкости организма. При внутримышечном введении как гентамицин, так и амикацин сульфат, применяют в виде готового раствора в ампулах: гентамицин в 1 мл - 20 или 40 мг препарата, а амикацин в 1 мл - 40 или 50 мг. Указанные дозы могут быть увеличены в зависимости от тяжести заболевания и локализации процесса. Последние определяют и длительность курса лечения (7-10 дней). Оба препарата обладают ото- и нефротоксичностью, частота которой зависит от применения и длительности курса лечения и выделительной функции почек. При нарушении функции почек следует применять антибиотики в меньших дозах и с большим интервалом между повторными введениями. Одновременное применение гентамицина (или амикацина) с другими препаратами, обладающими ото- и нефротоксическим действием, не допускается. Противопоказанием к применению гентамицина и амикацина является аллергия к препаратам, заболевания слухового и вестибулярного аппарата, не следует назначать эти препараты беременным, если это не обусловлено жизненными показаниями. Из возможных побочных явлений, связанных с приемом гентамицина или амикацина, отмечается тошнота, альбинурия, повышение печеночной трансаминазы.

При ульцерогландулярной, гландулярной или ангинозно - гландулярной формах туляремии, протекающих легко или средней тяжести, показано пероральное применение антибиотиков группы тетрациклинов. Наиболее эффективным из них является доксициклин, обладающий пролонгированным действием. Доксициклин назначают по 200 мг в сутки для взрослых (по 100 мг каждые 12 часов) в первый день и в последующие дни по 100 мг в сутки. В терапевтических дозах препарат действует бактериостатически. Доксициклин при приеме внутрь всасывается более полно и быстро в сравнении с другими препаратами группы тетрациклинов. Доксициклин выводится из организма медленно, терапевтическая концентрация поддерживается в крови и тканях 24 часа после однократного приема. Применение доксициклина не допускается одновременно с другими препаратами тетрациклиновой группы, а также при беременности, детям моложе 8 лет, при нарушении функции почек, печени, выраженной лейкопении.

Для лечения туляремии при приеме внутрь также эффективен полусинтетический препарат широкого спектра действия - рифампицин - один из представителей антибиотиков группы рифамицинов. Разовая доза этого препарата составляет 0,3 г, средняя суточная доза - 0,9 г, применяемая в три приема. Препарат выпускают в капсулах, содержащих 150-300 мг. Детям старше 8 лет рифампицин назначают из расчета 8-10 мг/кг массы тела в сутки. Препарат хорошо переносится больными, побочные явления наблюдаются редко. Последние выражаются в снижении аппетита, тошноте, дисфункции кишечника, возможны кожные высыпания.

Рифампицин хорошо всасывается и при приеме внутрь длительно поддерживается его концентрация в крови. Применение рифампицина противопоказано при повышенной чувствительности к препарату, при беременности, при заболевании почек, сопровождающемся снижением их выделительной функции. Следует иметь в виду, что применение рифампицина довольно быстро приводит к развитию устойчивости возбудителя к препарату. Для профилактики возможных осложнений, связанных с приемом антибиотиков, одновременно назначается нистатин, обладающий противогрибковым действием.

Если специфическое лечение начато в ранней стадии заболевания (в первые три дня), может иметь место задержка образования специфических антител. В тяжело протекающих случаях (легочная, абдоминальная формы туляремии) возможно более позднее обнаружение специфических антител (третья неделя).

Наряду со специфическим лечением при необходимости следует применять симптоматическую терапию, в частности, сердечные средства и др. Может быть назначено применение аскорбиновой кислоты в дозе 0,5 г 2-3 раза в день, питье в виде соков, чая с молоком, чая с лимоном.

На область лимфаденита рекомендуется применить УВЧ, умеренное сухое тепло, а при нагноении лимфоузла с отчетливой флюктуацией должно быть произведено хирургическое вскрытие, после которого заживление наступает значительно быстрее в сравнении с самопроизвольным вскрытием лимфоузла.

Улучшение состояния больного, снижение температуры тела, уменьшение размеров лимфоузлов наступает, как правило, в первые дни специфического лечения, особенно если оно начато в ранние

сроки от начала заболевания.

В период реконвалесценции при вполне удовлетворительном состоянии больного при клинических формах с наружно выраженными проявлениями, если размеры регионарных лимфатических узлов не превышают размеров боба или косточки сливы, подвижных и безболезненных, больной может быть выписан из стационара. Для решения вопроса о выписке больного, перенесшего окулогландулярную форму туляремии, рекомендуется консультация окулиста. При выписке больного, перенесшего легочную форму туляремии, рекомендуется контрольная рентгеноскопия или рентгенография грудной клетки.

 

ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ТУЛЯРЕМИИ

 

Диагноз туляремии устанавливается на основании сопоставления результатов аллергического и серологического исследований. Для серологической диагностики применяют обычно реакцию агглютинации (РА) или реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА). Другие серологические методы, например, ИФА, применяют в сомнительных случаях и для подтверждения достоверности результатов, достигнутых другими методами (РА и РПГА). Выделение возбудителя от больного, как было указано выше, не всегда эффективно и доступно только специально оснащенным лабораториям, имеющим разрешение на работу с возбудителем туляремии (П группа патогенности микроорганизмов). Кожная туляриновая проба может служить методом ранней диагностики туляремии, так как становится положительной уже с 3-5 суток болезни. Однако в случаях, когда имеются противопоказания к применению накожного тулярина (повышенная сенсибилизация), прибегают к методу аллергодиагностики ин витро - реакции лейкоцитолиза. Вместе с тем, следует иметь в виду, что методы аллергодиагностики не позволяют дифференцировать свежие случаи заболевания от анамнестических реакций, так как специфическая клеточная реактивность у переболевших и привитых сохраняется многие годы.

В этой связи нецелесообразно основывать диагностику туляремии только на результатах аллергических методов, а использовать и различные серологические методы диагностики. Выявление антител к туляремийному микробу при первом обследовании больного в титрах 1:50-1:100 при отсутствии нарастания титра сыворотки при последующем исследовании также не дает основания для диагноза свежего случая туляремии. Поэтому кровь больного исследуют по крайней мере дважды: первый раз немедленно после обращения больного за медицинской помощью и второй раз - спустя неделю после первого исследования. Если при повторном обследовании антитела не обнаружены или титр сыворотки остался без изменений, то кровь больного нужно исследовать третий раз, спустя неделю после второго обследования. Нарастание титра антител в РА и РПГА подтверждает диагноз туляремии, а его отсутствие указывает на анамнестический характер реакции.

Следует также учитывать, что раннее начало лечения больного антибиотиками (на 1-ой неделе болезни) приводит к снижению титра антител. У лиц, вакцинированных против туляремии или ранее перенесших это заболевание, основанием для диагностики свежего случая туляремии может служить лишь выраженное (в 2-4 и более раза) нарастание титров антител в сыворотке, а также наличие характерных клинических проявлений заболевания.

Окончательный диагноз туляремии обеспечивается сопоставлением результатов серо - аллергического обследования больного с клиникоэпидемиологическими данными.

 

Руководитель Департамента

организации медицинской

помощи населению

А.А.КАРПЕЕВ

 

Начальник Управления

охраны здоровья

матери и ребенка

Д.И.ЗЕЛИНСКАЯ

 

 

 

 

 

Приложение N 4

к приказу Министерства

здравоохранения

Российской Федерации

от 14.04.1999 г. N 125

 

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУЛЯРЕМИИ

 

(Методические указания)

 

Лабораторная диагностика туляремии у людей основывается, главным образом, на иммунологических методах (серо - аллергическая диагностика) и в меньшей степени на бактериологических методах. В методические указания включены методы лабораторной диагностики, позволяющие быстро и надежно выявлять это заболевание у человека и обеспеченные диагностическими препаратами, а также некоторые перспективные методы и приемы, находящиеся на стадии внедрения в практику.

 

1. АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

 

В патогенезе туляремийной инфекции значительную роль играет развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявление которой может служить методом аллергической диагностики туляремии. Метод основан на особенностях организма человека, заболевшего или переболевшего туляремией, отвечать местной аллергической реакцией, в виде гиперемии и инфильтрата, на введение туляремийного антигена (тулярина). У больных туляремией людей кожная аллергическая реакция становится положительной обычно с 3-5-х суток болезни, реже - в более поздние сроки, и сохраняется многие годы, благодаря чему аллергический метод служит для ранней или ретроспективной диагностики, являясь при этом строго специфичным. У привитых живой вакциной также возникает аллергическая реактивность, но она развивается медленнее (через 10-15 дней после вакцинации). Аллергический ответ у вакцинированных сохраняется 5-6 лет, иногда дольше, и может служить методом определения сохранности поствакцинального иммунитета. Кожную аллергическую реакцию выполняют как накожно, так и внутрикожно с соответствующим тулярином. Следует помнить, что аллергическая реакция на введение антигена - это общая реакция организма, которая при развившемся инфекционном процессе может вызвать ухудшение состояния больного, а местная реакция иногда сопровождается некрозом. Поэтому в качестве диагностического приема у больных людей проба с тулярином должна применяться с осторожностью.

1.1. ВНУТРИКОЖНАЯ ПРОБА С ТУЛЯРИНОМ. Для внутрикожной пробы применяют внутрикожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 град. С в течение 1 часа. Взвесь готовят на физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 500 млн. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл препарата (или 10 человеко - доз). Препарат предназначен в первую очередь для диагностики туляремии.

Техника постановки реакции. Тулярин в количестве 0,1 мл вводят стерильным шприцем строго внутрь кожи левого предплечья (на границе верхней и средней трети). Кожу предварительно обрабатывают спиртом и эфиром. На месте введения препарата образуется беловатый пузырек диаметром 3-4 мм, который примерно через 30 минут рассасывается.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 24-48 часов путем осмотра и ощупывания участка кожи, куда был введен тулярин. При положительной реакции на месте введения тулярина уже через 6-10 час обнаруживаются покраснение (гиперемия) и отек (инфильтрат). Через 24 часа реакция кожи выражена вполне отчетливо и имеет вид гиперемированного, нередко болезненного инфильтрата. Реакцию считают положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром не менее 0,5 см. Интенсивность реакции определяют по величине реагирующего участка (отека и гиперемии) кожи, который измеряют в сантиметрах в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Изменения кожи в виде гиперемии без инфильтрата, исчезающие через 48 часов, расценивают как отрицательный результат. В сомнительных и подозрительных случаях возможна повторная постановка реакции, так как отрицательный результат мог быть обусловлен ранним сроком от начала заболевания. Так, аллергическая реакция может запаздывать при тяжелых формах инфекции. Запаздывание реакции может также иметь место при раннем применении антибиотиков для лечения больного. В ряде случаев аллергическая реакция сопровождается образованием пустулы или кратковременным лимфангоитом с незначительным увеличением регионарных лимфатических узлов и повышением температуры тела на 1-1,5 град. С в течение 1-2 дней. Известны редкие случаи образования некроза на месте инъекции тулярина. В этой связи для диагностики туляремии предпочтительнее использовать аллергические методы in vitro или серологические методы.

1.2. НАКОЖНАЯ ПРОБА С ТУЛЯРИНОМ. Для накожной пробы применяют накожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 град. С в течение 1 часа. Взвесь готовят в физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 10 млрд. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл, что составляет 20 человеко - доз. Препарат предназначен в первую очередь для определения иммунитета у привитых против туляремии или для анамнестического обследования.

Техника постановки реакции. Перед употреблением ампулу с накожным тулярином встряхивают до образования равномерной взвеси. Одну каплю тулярина глазной пипеткой наносят на обработанную спиртом и эфиром кожу наружной поверхности левого плеча в его средней трети. Через каплю стерильным скарификатором делают две параллельные насечки длиной 8-10 мм, соблюдая расстояние между насечками 5 мм, до появления росинок крови. Затем тулярин тщательно втирают в насечки плоской стороной скарификатора в течение 1 мин. Тулярин применяют немедленно после вскрытия ампулы.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 48-72 часа. Положительная реакция выражается отечностью кожи вокруг насечек и краснотой, которые иногда появляются уже через 24 часа после введения тулярина, через 48-72 часа реакция ярко выражена и далее постепенно угасает, полностью исчезая к 7- 10 дню. Диаметр реагирующего участка достигает 1-2 см. В редких случаях по ходу насечек появляются везикулы, исчезающие через 2-3 дня. Реакцию считают положительной при величине реагирующего участка кожи не менее 0,5 см и наличии вдоль насечек ясного покраснения и небольшой отечности (валик). При правильной технике постановки накожная туляриновая проба по чувствительности не уступает внутрикожной, но в отличие от последней не сопровождается повышенными местными или общими реакциями. Категорически запрещается накожный тулярин вводить внутрикожно или подкожно, так как он может вызвать бурную местную и общую реакции.

1.3. РЕАКЦИЯ ЛЕЙКОЦИТОЛИЗА (РЛ). Аллергические методы диагностики "in vivo (накожная и внутрикожная туляриновые пробы) просты в исполнении и до настоящего времени используются на практике. Вместе с тем, введение даже убитого антигенного препарата небезразлично для организма обследуемого. В этой связи заслуживает внимания эффективный метод выявления и оценки гиперчувствительности методом in vitro с помощью альтерации лейкоцитов - реакции лейкоцитолиза (Суханов с соавторами). РЛ основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена (антигена), регистрируемого методом in vitro. Реакция лизиса лейкоцитов становится положительной уже в первые дни после вакцинации или заболевания (3-4 день), удерживается в течение многих лет (у переболевших - до 40 лет). На 7-15 день после вакцинации показатели лизиса лейкоцитов составляют в среднем 49-50%, затем постепенно снижаются, но даже через 1-5 лет после вакцинации оставались на достаточно высоком уровне (30-31%). РЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через несколько часов после взятия крови, осуществляется in vitro, т.е. без введения в организм специфического аллергена.

    Техника постановки  РЛ.  В  2  лунки  полистироловой  пластины

вносят  по  50  мкл  10%  раствора цитрата натрия,  затем в первую

(опытную) лунку добавляют 50  мкл  антигена  (накожного  тулярина,

                10

содержащего 1,10   бактерий в 1 мл),  а во вторую (контрольную)  -

50 мкл  физиологического раствора.  Таким образом,  в обеих лунках

конечная концентрация цитрата  натрия  составляет  5%.  Кровь  для

исследования  берут из пальца руки и в количестве 100 мкл вносят в

каждую из двух лунок.  Пластинку закрывают и помещают на 2 часа  в

термостат  при  температуре 37 град.  С.  Кровь в лунках тщательно

перемешивают стеклянной палочкой.  Затем по 20 мкл крови из  обеих

лунок  поочередно  забирают  с помощью микропипеточного дозатора и

переносят в соответствующие лунки планшета для  макроагглютинации,

содержащие 0,4 мл 3%-ной уксусной кислоты,  подкрашенной до светло

- голубого цвета с помощью метиленовой синьки.

Учет и оценка РЛ. Количество лейкоцитов подсчитывают в крови из обеих лунок в камере Горяева. Разрушенные клетки, а также клетки, собирающиеся в кучки, не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляют по формуле:

 

                              Мк-Мо

                         К% = ----- х 100

                                Мк

 

    где Мо - количество лейкоцитов в опыте (первая лунка);

    Мк - количество лейкоцитов в контроле (вторая лунка).

    Для оценки результатов используют следующую шкалу показателей:

    К = 15% - отрицательный или сомнительный результат;

    К = 16-20% - слабо положительный результат;

    К = 21-30% - положительный результат;

    К = 31 % и выше - резко положительный результат.

 

2. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

 

2.1. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ. Наиболее распространенным и вместе с тем вполне точным методом серологической диагностики туляремии является реакция агглютинации (РА). Реакция служит для установления диагноза у больного или переболевшего (ретроспективный диагноз) и может быть использована при изучении иммунологического состояния привитых против туляремии. Обнаружение агглютининов у больного туляремией обычно отмечается через 10-15 дней, при этом агглютинационный титр сыворотки в этот период составляет 1:50-1:100, но далее быстро нарастает и на 4 - 6 неделе болезни достигает 1:400-1:800, реже 1:1600 и выше. По достижении максимальных показателей агглютинационный титр сыворотки затем медленно снижается и через 6-12 месяцев составляет 1:100-1:400, позднее падает до 1:10-1:50 и на этом уровне может удерживаться в течение многих лет. Длительность сохранения агглютининов делает возможным использование РА для ретроспективного диагноза. У привитых против туляремии агглютинины обнаруживаются через 2-3 недели, достигают через 4-6 недель максимальных титров 1:160-1:320, реже выше, затем снижаются до 1:10-1:40 и обычно выявляются в течение 5-7 лет после вакцинации (иногда дольше).

Кровь для исследования у больного (или вакцинированного) берут из локтевой вены в количестве 3-5 мл (для макроагглютинации) или из пальца руки (для микроагглютинации). Реакцию ставят с сывороткой, которая должна быть прозрачной.

2.1.1. РЕАКЦИЯ МАКРОАГГЛЮТИНАЦИИ (РА). Антигеном для постановки РА служит туляремийный диагностикум, представляющий собой убитую формалином взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма. В 1 мл препарата содержится 25 млрд. туляремийных бактерий. Для постановки РА туляремийный диагностикум предварительно разводят физиологическим раствором (рН = 7,0-7,2) в 5 раз до концентрации 5 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл.

Техника постановки РА. В каждую пробирку разливают по 0,5 мл сыворотки, разведенной физиологическим раствором рН 7,0-7,2, до 1:12,5; 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400. Во все пробирки доливают по 0,5 мл взвеси диагностикума в концентрации 5 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл. Таким образом, получают соответствующий ряд фактических разведений сыворотки 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800; с содержанием в каждой пробирке по 2,5 млрд туляремийных бактерий. В контрольной пробирке содержится 0,5 мл антигена и 0,5 мл физиологического раствора (контроль антигена). Для контроля сыворотки используют исходное разведение в объеме 1 мл без добавления антигена. После добавления антигена в опытные пробирки штатив встряхивают и помещают в термостат (37 град. С) на 2 часа. Реакцию оставляют затем при комнатной температуре до следующего дня.

Учет и оценка РА. Учет результатов РА производят через 18-24 часа невооруженным глазом. Оценку реакции осуществляют на основании степени прозрачности надосадочной жидкости в пробирках, количества и характера осадка микробной массы (агглютината):

1) резко положительная реакция - полное просветление жидкости с осадком микробов в виде "зонтика"; при встряхивании пробирки осадок разбивается на крупные хлопья; обозначается 4-мя плюсами (++++);

2) положительная реакция - значительное просветление жидкости с осадком, который при легком встряхивании поднимается со дна хлопьями; обозначается 3-мя плюсами (+++);

3) слабоположительная реакция - видимая невооруженным глазом агглютинация с незначительным осадком; обозначается 2-мя плюсами (++);

4) сомнительная реакция - видимая невооруженным глазом агглютинация без образования осадка; обозначается одним плюсом (+);

5) отрицательная реакция - отсутствие агглютинации и просветления жидкости; обозначается минусом (-).

Агглютинационный титр сыворотки учитывают по последнему разведению, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов). При учете результатов реакции следует иметь в виду возможность задержки агглютинации (проагглютинационная зона) в небольших разведениях сыворотки.

При серологической диагностике туляремии у человека диагностическим считается титр 1:100 и выше, однако обязательно должно быть прослежено его нарастание. При отрицательной или сомнительной реакции, а также при положительной реакции в низких разведениях сыворотки у подозрительных на туляремию больных рекомендуют повторить исследование сыворотки через 7-10 дней. Нарастание титра сыворотки в 2-4 и выше раза свидетельствует о свежем случае туляремии и подтверждении диагноза.

    2.1.2. РЕАКЦИЯ МИКРОАГГЛЮТИНАЦИИ (РМА).  Реакцию  агглютинации

можно  ставить  в микрообъемах,  используя для этого сыворотку или

плазму крови,  взятую из пальца  руки.  Диагностикум  для  реакции

микроагглютинации  готовят  из  убитой  культуры вакцинного штамма

туляремийного   микроба,   которую    окрашивают    гематоксилином

(модификация  Брикмана  и Мериновой).  Для этого взвесь культуры в

                 11

концентрации 1.10   м. кл./мл смешивают в равных объемах с  1%-ным

раствором  формалина.  После  2-х часовой экспозиции клетки дважды

отмывают от формалина физиологическим раствором.  Осадок  разводят

                      9

до  концентрации  5.10  м. кл./мл  и  смешивают  с  равным объемом

гематоксилина,   приготовленного   по   методу   Караччи:   0,1  г

гематоксилина растворяют в 100 мл дистиллированной воды, добавляют

25   мл   глицерина,  5,0  г  калийных  квасцов  и  2-3  кристалла

йодноватистого калия;  раствор имеет вишневую окраску. Окрашивание

производят  в водяной бане в течение 20-24 часов при 56 град.  С и

периодическом  встряхивании  культуры.  Затем  бактерии  3-4  раза

отмывают   физиологическим   раствором,  центрифугируют  при  6000

об./мин.  в течение 30 мин.  до получения бесцветной и  прозрачной

надосадочной   жидкости.   Осадок   окрашенных  бактерий  разводят

физиологическим  раствором  до  оптимальной  концентрации  (обычно

      9

2-5.10  м. кл./мл).  Для   определения   оптимальной  концентрации

диагностикума несколько   его   разведений  испытывают  в  реакции

микроагглютинации  с  диагностической   туляремийной   сывороткой.

Диагностикум сохраняют при температуре 4 град.  С,  предварительно

добавив в  него  формалин  до  конечной  концентрации  0,1%.  Срок

сохранения активности диагностикума не менее 2-х лет.

Техника постановки и учет РМА. Реакцию микроагглютинации ставят в полистироловых пластинах микротитратора Такачи. Для этого в ряд лунок полистироловой пластины микротитратора Такачи вносят 50 мкл физиологического раствора (рН = 7,0-7,2). Затем с помощью титратора с головкой объемом 50 мкл раститровывают исследуемую сыворотку, предварительно разведенную 1:5 (или неразведенную плазму крови) и добавляют в каждую лунку равный объем (50 мкл) цветного, окрашенного гематоксилином диагностикума. При этом происходит разведение сыворотки в 4 раза (с 1:5 до 1:20) и получают следующий ряд разведений сыворотки 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. Пластины тщательно встряхивают и помещают на 2 часа в термостат при температуре 37 град. С, затем выдерживают 12-18 часов при комнатной температуре. В лунках с положительным результатом антиген выпадает на дно в виде "зонтика" (агглютинат), а в случае отрицательного результата в виде "пуговки". Титры реакции микроагглютинации, как правило, совпадают или на одно разведение ниже титров РА, выполненной макрометодом.

2.2. РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РПГА). Реакция пассивной гемагглютинации является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунологического состояния привитых. У больных туляремией антитела обычно обнаруживаются в конце 1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1-1,5 месяца титры РПГА достигают максимальных показателей (1:10000-1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.

У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80.

Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах - в 0,5%-ной концентрации.

Техника постановки РПГА. Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 град. С в течение 30 минут. После этого в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам, сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.

Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок полистироловой пластины. При предварительном исследовании сывороток их целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду пластины (6 лунок). В случае выявления антител в коротком ряду сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок). После разлива разводящей жидкости, в первую лунку каждого ряда (короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном - с 1:10 до 1:20480. После титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл) рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Содержимое пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2-3 часа, окончательное определение титра производят после полного оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Все контроли должны дать четко отрицательную реакцию.

Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме: 1) резко положительная реакция (++++) - эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде "зонтика", у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев; 2) положительная реакция (+++) - эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки; 3) слабоположительная реакция (++) - агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки; 4) сомнительная реакция (+) - вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината; 5) отрицательная (-) - на дне лунки эритроциты оседают в виде "пуговки" или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.

Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов). Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА, необходимо проследить за его нарастанием.

РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.

Техника постановки РПГА в микрообъемах. РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки - капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Следует убедиться, что жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума. Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может быть произведен уже через 1-1,5 часа, в чем существенное преимущество РПГА в микротитраторе. Кроме того, этот прием требует малого количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.

Учет реакции производят по следующей схеме: 1) "+" - полноценная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде "зонтика", занимающего не менее 2/3 дна; 2) "+" - частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера; 3) "-" - отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой пуговки или колечка с ровным краем.

Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции - реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Техника постановки РТПГА. Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум. РТПГА обычно ставят в ряду из 7-8 лунок. Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титрование. Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда - по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий. Используют туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл), предварительно разведенный в 50 раз. Такая взвесь содержит 500 млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола. Учет производят через 2-3 часа.

Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или, при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в меньшем (на 2-4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена. Если же гемагглютинация будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных антител. В таком случае первичный результат РПГА признается неспецифическим.

Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА, также как и РПГА, может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора типа Такачи. Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл разводящей жидкости в два ряда по 7-8 лунок в каждом. Затем с помощью титратора забирают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремийного антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл) в каждую лунку, а во второй - 25 мкл разводящей жидкости. Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного эритроцитарного диагностикума (0,5%-ной концентрации). Учет и оценку результатов производят аналогично реакции в макрообъемах.

2.3. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ (ИФА). Метод используют для диагностики туляремии у больных и переболевших людей, определения иммунитета у вакцинированных против туляремии. У больных туляремией специфические антитела обнаруживаются в ИФА между 6-10 днями, достигают максимальных показателей к 4-7 неделям, затем уровень их снижается, но они продолжают длительно (более 10 лет) выявляться после переболевания. ИФА обеспечивает более раннюю (в сравнении с РА и РПГА) и эффективную иммунологическую диагностику. Титры антител у больных и вакцинированных колеблются в значительных пределах от 1:400 до 1:40000 и выше и, как правило, в 10-20 раз превышают таковые в РА и РПГА.

Для постановки ИФА используют диагностическую тест - систему иммуноферментную для определения туляремийных антител. Выявление туляремийных антител в сыворотках людей происходит за счет специфического взаимодействия антигена туляремийного микроба, адсорбированного на планшете, с туляремийными антителами в исследуемой сыворотке. Образовавшийся комплекс "антиген - антитело" определяют с помощью антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой.

В соответствии с назначением тест - система представляет собой набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на твердофазном носителе и включает в себя: туляремийный липополисахарид; антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой; контрольную положительную сыворотку; контрольную отрицательную сыворотку; набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов; субстрат - О-фенилендиамин (ОФД); твин-20; бычий сывороточный альбумин (БСА); планшеты для ИФА однократного применения.

Техника постановки ИФА.

1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью дозатора по 200 мкл раствора туляремийного антигена в концентрации 10 мкг/мл в 0,02М растворе фосфатно - солевого буфера (ФСБ) рН 7,2. Адсорбцию туляремийного антигена на планшетах проводят в течение 120 мин. при температуре 37 град. С или 18 часов при температуре 20 град. С. Затем антиген удаляют встряхиванием планшет с последующей трехкратной отмывкой (по 5 мин.) раствором ФСБ (рН 7,2), содержащим 0,05% детергента - твин-20.

2. Внесение исследуемого материала. Исследуемые сыворотки, разведенные 1:200 и далее последовательно путем двукратных разведений на ФСБ-твин, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), вносят по 100 мкл в каждую лунку. Параллельно с исследуемыми сыворотками (на каждом планшете) вносят аналогичным образом разведенные заведомо отрицательную и положительную туляремийную сыворотку человека. Планшеты выдерживают а термостате при температуре 37 град. С в течение 1 часа. После чего жидкость удаляют встряхиванием и отмывают планшеты, как указано в п.1.

3. Внесение конъюгата. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении (указанном на этикетке); конъюгат разводят на ФСБ-твин, содержащем 1% БСА. Планшеты выдерживают в термостате при температуре 37 град. С а течение 1 часа. Жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают планшеты, как указано в п. 1.

4. Проявление. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора, содержащего 0,04% 0-фенилендиамина и 0,04% Н2О2 в 0,1 М цитратно - фосфатном буфере рН 5,5. Инкубацию проводят в темноте при комнатной температуре 15-30 мин. и останавливают внесением в лунки по 100 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 мол/л.

5. Учет и оценка результатов ИФА. Результаты реакции можно учитывать визуально, сравнивая окраску в опытных лунках с контрольными, или определять интенсивность окрашивания субстратной смеси инструментально, используя микроэлектрофотометр типа Multiskan, при длине волны 492 нм. Появление желто - оранжевого окрашивания в опытных лунках при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результатов проба считается положительной, если ее оптическая плотность (ОП) в 2 и более раза превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей.

Пробы рекомендуется первоначально исследовать параллельно в 2 лунках в разведении 1:200 с последующей раститровкой положительных сывороток для определения титра антител, используя 2-кратные разведения сывороток.

При постановке ИФА предусматриваются следующие контроли (на каждом планшете):1) отрицательная сыворотка в разведении 1:200 и выше - отсутствие окрашивания раствора; 2) положительная сыворотка в разведении 1:200 и выше - выраженное окрашивание раствора (при инструментальной оценке ОП не менее, чем в 2 раза выше ОП отрицательной сыворотки); 3) контроль конъюгата (вместо сыворотки вносят раствор ФСБ-твин) - отсутствие окрашивания раствора; 4) контроль субстратной смеси (вместо конъюгата вносят раствор ФСБ-твин) - отсутствие окрашивания раствора. В сомнительных случаях для подтверждения специфичности результатов рекомендуется постановка реакции торможения специфическим антигеном. Диагностическим титром в ИФА считают разведение сыворотки 1:400 и выше. Более подробно методика ИФА отражена в Инструкции по применению тест - системы иммуноферментной для определения туляремийных антител (1986 год).

В последние годы для диагностики туляремии разработаны и некоторые другие методы, в частности, основанные на использовании синтетических носителей для сенсибилизации антигена, с успехом используемые в отдельных регионах и учреждениях.

2.4. ПРИМЕНЕНИЕ НЕПРЯМОГО ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ АНТИТЕЛ. При применении непрямого ИФМ для обнаружения антител к туляремийному микробу заранее готовят мазки из 1-2 суточной агаровой культуры возбудителя (1 млрд взвесь). При этом на одном предметном стекле делают 8 мазков, фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин., не обжигая, высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. Исследуемую сыворотку разводят 2-кратно с разведения 1:10 до 1:640 - 1:1280 и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат (37 град. С на 30 мин.). Мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную камеру, докрашивая антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении. Дальнейшая обработка препарата ведется, как при прямом иммунолюминесцентном методе. После просмотра препарата под люминесцентным микроскопом устанавливают титр антител в исследуемой сыворотке.

В качестве контролей служат препараты, в которых туляремийные бактерии обработаны туляремийной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к возбудителю туляремии (отрицательный контроль). При исследовании сыворотки больного с подозрением на туляремию диагностическим считается титр не менее 1:40.

 

3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

 

Бактериологические методы диагностики туляремии имеют дополнительное значение и не всегда эффективны, что определяется особенностями течения инфекции у человека с малой обсемененностью органов и тканей возбудителем. Следует учитывать, что не в любом материале, взятом от больного, содержатся живые туляремийные бактерии. Кроме того, выделение возбудителя наиболее вероятно в течение первых 2-3-х недель от начала заболевания и реже в более поздние сроки.

Выделение и идентификация возбудителя туляремии могут быть произведены только в специально оборудованных режимных лабораториях. Забор и доставку патологического материала в лабораторию производят с соблюдением предосторожностей и правил работы с особо опасными инфекциями П группы патогенности.

3.1. ПОСЕВ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. Использование бактериологического метода при диагностике туляремии возможно, но, по сравнению с биологическим методом, малоэффективно, так как в организме больного туляремийные бактерии содержатся в малом количестве. Лишь в редких случаях удавалось высевать возбудитель туляремии из патологического материала от больных людей (содержимое язвы на коже, содержимое бубона и т.д.). Патологический материал от больных может быть исследован методом посева лишь в первые 2-3 недели от начала заболевания. Для этого используют специальные среды, применяемые для культивирования туляремийного микроба. Наиболее чувствительными и доступными являются свернутая желточная среда, желточно - агаровая среда, различные варианты агаровых сред, содержащих цистин, глюкозу, кровь, другие факторы роста, а также специальные среды для культивирования туляремийного микроба (подробно см. приложение 2). Скорость появления роста культуры зависит от количества микробов в исследуемом материале: при посеве слабо инфицированного материала рост отдельных колоний возможен в отдаленные сроки, поэтому посевы следует выдерживать в термостате при 37 град. С в течение не менее 10 суток.

3.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОБА. Биологическая проба является самым чувствительным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом материале, в том числе и при исследовании материала от больных людей, т.к. биопробные животные (белые мыши, морские свинки) заболевают туляремией со смертельным исходом при подкожном введении единичных бактерий. Однако при обследовании больных людей даже биологический метод не всегда надежен, так как не в любом образце материала, взятом от больного, имеются жизнеспособные туляремийные бактерии. В отделяемом кожной язвы и в пунктате из пораженного лимфатического узла возбудитель туляремии может быть обнаружен в течение 3 недель от начала заболевания, редко позднее. Известны случаи выделения возбудителя из мокроты, материала, взятого из зева (с миндалин) или конъюнктивы глаза. В редких случаях удается выделить возбудитель из крови, но обычно не позднее первой декады болезни.

Патологический материал (отделяемое кожной язвы, конъюнктивы глаза, миндалин или мокроту, пунктат из бубона) смешивают с небольшим количеством физиологического раствора (0,3-0,5 мл) и вводят подкожно белой мыши или внутрибрюшинно морской свинке. Кровь для исследования (3-5 мл) берут из локтевой вены, разводят пополам физиологическим раствором и вводят подкожно белым мышам (по 0,5 - 1,0 мл) или внутрибрюшинно морским свинкам (5-7 мл). Сроки гибели биопробных животных зависят от степени инфицированности патологического материала и составляют 4-9 и более суток (до15) для белых мышей и 6-15 (до 20) для морских свинок. Культуру туляремийных бактерий от биопробных животных выделяют посевом на специальные питательные среды (см. выше). Идентификацию свежевыделенной туляремийной культуры осуществляют на основании совокупности следующих признаков: 1) морфологии клеток и грамотрицательной их окраски в мазках: 2) характера роста на желточной среде или специальных средах; 3) отсутствие роста на простых мясо - пептонных средах: 4) агглютинация туляремийной сывороткой: 5) специфическим свечением в реакции иммунофлуоресценции; 6) способностью вызывать гибель белых мышей и морских свинок при их заражении испытуемой культурой с характерными для туляремии патологоанатомическими изменениями в органах и выделением чистой культуры возбудителя.

3.3. РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ), ПРЯМОЙ МЕТОД. При исследовании патологического материала от больных может быть эффективен прямой иммунофлуоресцентный метод, позволяющий выявлять как живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена. Имеются данные, когда методом РИФ у больного туляремией через 2 месяца от начала заболевания в мазках - отпечатках из бубона были обнаружены туляремийные бактерии, тогда как выделение возбудителя бактериологическими (биологическими) методами оказалось безуспешным. В качестве объектов, подвергающихся исследованию в РИФ, могут быть мазки, приготовленные из патологического материала больного: содержимого кожного аффекта, пунктата бубона, отделяемого слизистой глаза, смывы с зева, миндалин и др.

Техника приготовления препарата. Каплю исследуемого материала наносят на тщательно обезжиренное стекло и делают тонкий мазок. Препараты подсушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют в 96 град. этиловом спирте в течение 15-20 мин. Фиксированные препараты подсушивают на воздухе. До обработки препаратов люминесцирующей сывороткой их хранят при 4 град. С.

Техника постановки реакции. Для постановки РИФ (прямой метод) используют сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку, которая представляет собой высушенную лиофильно иммуноглобулиновую фракцию сыворотки с присоединенным к ней химическим путем флуоресцирующим красителем - изотиоционатом флуоресцеина.

При исследовании в РИФ тканевого материала в целях повышения специфичности результатов анализа и для контрастирования неспецифического свечения туляремийную люминесцирующую сыворотку используют вместе с бычьим альбумином, меченным родамином, который сообщает клеткам и тканям, а также прочим органическим включениям, содержащимся в исследуемых препаратах, оранжево - красное неспецифическое свечение различных оттенков.

Сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку и сухой бычий альбумин растворяют в указанных на этикетках ампул объемах дистиллированной воды. Затем, непосредственно перед нанесением на препарат, люминесцирующую туляремийную сыворотку и меченный бычий альбумин разводят физиологическим раствором рН 7,0-7,2, доводя до их рабочего разведения, указанного на ампуле. Далее каплю смеси туляремийной люминесцирующей сыворотки и меченного родамином бычьего сывороточного альбумина наносят на фиксированный и подсушенный препарат, равномерно распределяя смесь по всему препарату, и помещают его во влажную камеру. "Окраску" препарата производят в течение 20 мин. при комнатной температуре (18-20 град. С). По окончании "окраски" препарата каплю смеси люминесцирующей сыворотки и меченного бычьего альбумина стряхивают и препарат промывают в течение 5-10 мин. проточной водопроводной водой или в нескольких сменяемых порциях физиологического раствора (рН 7,2-7,4). Затем препарат подсушивают на воздухе, наносят на него каплю разведенного глицерина (9 частей глицерина + 1 часть физиологического раствора рН 7,2-7,4) и покрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Такой препарат готов для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Учет и оценка РИФ. Мазки просматривают в падающем свете люминесцентного микроскопа с лампой ДРШ-250 и системой светофильтров. Используют иммерсионный объектив 90х(1,26) и окуляры 5х или 7х. При микроскопировании используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло.

В положительных случаях, т.е. когда исследуемый материал содержит туляремийные бактерии, в люминесцентном микроскопе обнаруживается специфическое изумрудно - зеленое свечение туляремийных бактерий. Удается обнаружить более яркое свечение периферии бактериальной клетки и более слабое - в ее центральной части. Посторонние микроорганизмы, клетки ткани и прочие органические частицы приобретают оранжево - красную (различных оттенков) флуоресценцию. Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему регистрации результатов. Положительным результатом считается флуоресценция, оцениваемая на ++++ или +++ при достаточном количестве (2-5 клеток в нескольких полях зрения микроскопа) специфически флуоресцирующих бактерий. При оценке исследуемого препарата необходимо учитывать не только интенсивность специфического свечения, но и обращать особое внимание на характерную морфологию бактерий и учитывать расположение клеток относительно друг друга.

При исследовании различных препаратов необходимо иметь контрольный мазок, приготовленный из взвеси туляремийных бактерий и обработанный подобно опытным образцам.

3.4. В качестве дополнительного метода диагностики туляремии у человека может быть рекомендовано обнаружение специфической ДНК в патологическом материале современным методом молекулярной биологии с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).

 

Заместитель руководителя

Департамента госсанэпиднадзора

С.И.ИВАНОВ

 

 

 

 

 

Приложение N 5

к приказу Министерства

здравоохранения

Российской Федерации

от 14.04.1999 г. N 125

 

ПРОФИЛАКТИКА ТУЛЯРЕМИИ

 

(Методические указания)

 

Основу профилактики туляремии составляют вакцинация угрожаемых контингентов населения высокоэффективной живой противотуляремийной вакциной, а также профилактические мероприятия, квалифицируемые как средства и методы неспецифической профилактики.

 

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

 

Необходимость проведения профилактической вакцинации и ее объемы определяется центрами госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации на основании многолетнего анализа эпизоотической и эпидемической обстановки на подведомственной территории, энзоотичной по туляремии.

Энзоотичной по туляремии считается территория (административный район), где были зарегистрированы местные случаи заболевания людей, изолированы культуры возбудителя или регулярно выявлялся антиген в объектах внешней среды (погадки птиц, помет хищных млекопитающих, подснежные гнезда грызунов, вода, фураж и т.п.).

Такие территории должны находиться под постоянным наблюдением центров госсанэпиднадзора и подвергаться дифференцированному эпизоотологическому мониторингу в зависимости от степени их эпизоотической активности и эпидемической опасности.

Активными природными очагами считают такие, в которых регистрируют случаи заболевания людей (даже единичные), выделяют культуры возбудителя туляремии (от грызунов, членистоногих, объектов внешней среды) или регулярно выявляют туляремийный антиген в погадках птиц и помете хищных млекопитающих (при наличии антигена не менее чем в 10% образцов в годы высокой численности грызунов при статистически достоверной выборке >= 100 погадок, собранных на территории конкретного природного очага). Активные природные очаги следует обследовать ежегодно при минимально необходимых объемах зоолого - паразитологических и лабораторных исследований, позволяющих оценить степень эпизоотической активности и эпидемической опасности, но не реже, чем весной и осенью.

Малоактивными природными очагами считают такие, в которых заболевания людей и выделение культур возбудителя не регистрируют, но имеют место нерегулярные находки туляремийного антигена в объектах внешней среды. Эти очаги следует обследовать один раз в 2-3 года. Необходимо также осуществлять разведку новых потенциально опасных территорий (1 раз в 3-5 лет) на возможное обнаружение природных очагов туляремии.

Данные эпизоотологического и эпидемиологического обследования, а также составленные по их результатам научно обоснованные прогнозы являются основой профилактических мероприятий против туляремии, в первую очередь, вакцинации населения.

 

1. Планирование и организация прививок против туляремии

 

Вакцинацию против туляремии проводят населению, проживающему на энзоотичных по туляремии территориях, а также контингентам, подвергающимся риску заражения этой инфекцией. Планирование и подбор контингентов, подлежащих вакцинации против туляремии, осуществляют центры госсанэпиднадзора с учетом степени эпизоотической активности природных очагов, а также экономических и хозяйственных связей с сопредельными территориями.

Вакцинацию (и ревакцинацию) против туляремии проводят с применением живой туляремийной вакцины в строгом соответствии с действующей инструкцией по ее применению в любое время года, учитывая календарь других прививок. Допускается одновременная накожная вакцинация взрослых против туляремии и бруцеллеза, туляремии и чумы на разных участках наружной поверхности трети плеча. Интервал между вакцинацией против туляремии и другими прививками должен быть не менее одного месяца, а в отношении детских контингентов - не менее двух месяцев. Вакцинацию осуществляют медицинские работники лечебно - профилактических учреждений.

Различают плановую и внеплановую (по эпидпоказаниям) вакцинацию против туляремии.

 

1.1. Плановая вакцинация

Плановыми прививками охватывают население, проживающее (или работающее) на территории с наличием активных природных очагов луго - полевого, степного, пойменно - болотного (и его вариантов), предгорно - ручьевого типов при 100%-ном охвате прививками лиц, за исключением детей до 7 лет и лиц, имеющих противопоказания к прививкам.

1.1.1. В очагах луго - полевого типа не прививают детей в возрасте до 14 лет, а также лиц, не занимающихся сельскохозяйственными работами и не имеющих скота в личном пользовании.

1 1.2. В природных очагах тундрового, лесного типов, а также в пойменно - болотных очагах при отсутствии водяной полевки (где основным источником инфекции является ондатра) вакцинацию проводят только лицам с профессиональным риском инфицирования: охотники, рыболовы (и члены их семей), пастухи, полеводы, мелиораторы, оленеводы, а также лицам, направляемым на временную работу: геологи, строители и т.п.

1.1.3. На территориях с малоактивными природными очагами туляремии, а также в городах, прилегающих к природным очагам, вакцинируют только группы риска, а именно:

- работников зерно- и овощехранилищ, сахарных заводов, элеваторов, мельниц, мясокомбинатов, комбикормовых заводов, спиртозаводов, предприятий по переработке сельскохозяйственных продуктов и сырья животноводческих и птицеводческих ферм, работающих с зерном, фуражом, сахарной свеклой и др., а также скотом, поступающим на переработку из энзоотичных по туляремии степных и луго - полевых очагов;

- лиц, принимающих и обрабатывающих шкурки промысловых зверьков, поступающих из энзоотичных по туляремии территорий.

1.1.4. Вакцинации подлежит персонал отделов особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора, противочумных и научно - исследовательских учреждений, лабораторий и эпидотрядов, работающих с возбудителем туляремии или осуществляющих сбор и исследование мелких млекопитающих, членистоногих, объектов внешней среды из энзоотичных по туляремии территорий, а также подразделений различных служб, проводящих дератизационные и дезинсекционные мероприятия.

Ревакцинацию проводят через 5 лет контингентам, подлежащим плановой вакцинации.

Принимая во внимание стойкость природных очагов туляремии и их длительное существование, отмена плановых прививок допускается только на основании представленных центрами госсанэпиднадзора материалов, свидетельствующих об отсутствии циркуляции возбудителя в биоценозе, в том числе в связи с влиянием хозяйственной деятельности человека (полная осушка болот и водоемов на больших площадях, сплошная распашка и последующее освоение крупных земельных массивов при отсутствии лесополос, оврагов и т.п.). Эти материалы должны быть подтверждены отрицательными результатами ежегодных эпизоотологических и эпидемиологических исследований с применением бактериологического и серологических методов в пределах границ конкретных очаговых территорий и охватывающих не менее трех очередных периодов массового размножения грызунов (не менее 10-12 лет).

 

1.2. Вакцинация по эпидпоказаниям.

Внеплановую вакцинацию против туляремии проводят:

1.2.1. В населенных пунктах, расположенных на территориях, ранее считавшихся благополучными по туляремии, при заболевании людей (даже единичные случаи) или выделении туляремийных культур из каких - либо объектов;

1.2.2. В населенных пунктах, расположенных на территориях активных природных очагов туляремии, при выявлении низкой иммунной прослойки (менее 70% в луго - полевых очагах и менее 90% пойменно - болотных очагах);

1.2.3. В городах, непосредственно прилегающих к активным природным очагам туляремии, контингентам, подвергающимся риску заражения, - членам садоводческих кооперативов, владельцам (и членам их семей) личного авто- и водного транспорта, работникам водного транспорта и т.п.;

1.2.4. Лицам, выезжающим для постоянных или временных работ на территории активных природных очагов туляремии: охотники, лесники, мелиораторы, геодезисты, заготовщики шкурок промысловых зверьков (водяные полевки, зайцы, ондатры), геологи, члены научных экспедиций, лица, направляемые на сельскохозяйственные, строительные, изыскательские или иные работы, туристы и др.

Вакцинацию вышеуказанных лиц и групп организуют и проводят учреждения здравоохранения в местах их формирования.

 

Контроль за состоянием противотуляремийного иммунитета.

Контроль за своевременностью и качеством вакцинации против туляремии, а также за состоянием иммунитета осуществляют центры госсанэпиднадзора.

Состояние иммунитета у вакцинированных проверяют через 5 лет после вакцинации и в последующем - 1 раз в 2 года. Ревакцинацию проводят в случае отрицательных результатов иммунологических показателей (аллергические или серологические реакции).

Иммунную структуру населения определяют путем выборочной проверки взрослого работоспособного населения также с помощью аллергического (туляриновая проба) или одного из серологических методов исследования (реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации, иммуноферментный анализ). При этом предпочтительнее использовать серологические методы исследования. Общее число проверяемых людей в конкретном административном районе должно составлять не менее 1% к общему числу проживающих (или не менее 10% в отдельном населенном пункте). Ревакцинацию проводят при выявлении уровня иммунной прослойки ниже 70% в луго - полевых очагах и ниже 90% - в пойменно - болотных очагах (см. Раздел 1.2.2.). Отбор контингентов для проверки иммунной структуры населения, оценки результатов иммунологических реакций осуществляют при обязательном участии работников центров госсанэпиднадзора (отделов особо опасных инфекций, врачей - эпидемиологов и др.).

У персонала отделов особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора, противочумных, научно - исследовательских учреждений, эпидотрядов, проводящих работу с возбудителем туляремии и привитых с положительным результатом, состояние иммунитета проверяют 1 раз в 2 года. К работе допускают лиц с наличием противотуляремийного иммунитета, определяемого с помощью аллергических (туляриновая проба или реакция лейкоцитолиза) или одного из серологических методов (реакция агглютинации, реакция пассивной гемагглютинации, иммуноферментный анализ). Ревакцинацию проводят только в случае получения отрицательных иммунологических показателей при очередной проверке иммунитета.

 

НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

 

Неспецифической профилактике туляремии предшествует организация поиска эпизоотий в природных очагах этой инфекции. Исходя из результатов эпизоотологического обследования планируют и реализуют соответствующий комплекс профилактических мероприятий.

Неспецифическая профилактика туляремии проводится по двум основным направлениям:

- устранение условий заражения людей (общесанитарные и гигиенические мероприятия, включая информационно - разъяснительную работу);

- снижение лоймопотенциала природных очагов (мероприятия по дератизации и дезинсекции).

Неспецифические мероприятия имеют свои особенности при различных типах заболеваемости.

При трансмиссивных заражениях через кровососущих двукрылых рекомендуется применение репеллентов, защитной одежды, ограничение доступа непривитого населения на неблагополучные территории, а в редких случаях - дезинсекция водоемов.

При промысловых заражениях проводят комплекс регулирующих численность носителей и (или) ограничительных санитарно - противоэпидемических мероприятий в местах промысла зверьков, а также мероприятия по дезинсекции и дезинфекции на складах хранения шкурок. На охоте рекомендуется дезинфицировать руки после снятия шкурок и потрошения зайцев, ондатр, кротов и водяных полевок. Необходима тщательная термическая обработка заячьего мяса перед употреблением его в пищу. Употребление в пищу малосольной зайчатины может вызвать заболевание туляремией.

При вспышках, связанных с контактом населения с зараженным водоемом, необходимо прекратить купание и водопользование, использовать для питья только кипяченую воду, а при заражении колодезной воды - принять меры по очистке колодца от трупов грызунов и дезинфицировать воду.

При заражении во время зимних сельскохозяйственных работ в природных очагах туляремии недопустимо привлечение к ним непривитого населения. Подвергающиеся риску заражения лица должны быть обеспечены защитной одеждой, респираторами, перчатками. Инфицированное зерно, корм и другие субстраты либо уничтожаются, либо обеззараживаются.

При бытовых заражениях обеспечивают, по возможности, грызунонепроницаемость жилых и подсобных помещений, дератизацию и влажную уборку с применением дезинфицирующих средств.

При производственных и продуктовых заражениях осуществляют санитарно - противоэпидемические мероприятия на предприятиях или на складах, включающие обеззараживание инфицированного сырья и продуктов. На мясокомбинатах производят дезинсекцию скота, поступившего для переработки.

При посещении леса, сборе ягод и т.п. следует проводить само- и взаимоосмотры, удаляя и уничтожая (но не раздавливанием) всех наползших или прикрепившихся иксодовых клещей. Место их прикрепления обрабатывают настойкой йода или бриллиантовой зелени. Это же делают при обнаружении ссадин на коже и других повреждениях. При подозрении попадания инфекции в глаз следует промыть его кипяченой водой, а затем закапать в глаз раствор протаргола.

Лоймопотенциал природных очагов туляремии может быть снижен за счет проведения комплексных мероприятий, направленных на сокращение численности основных носителей и переносчиков инфекции, а также в результате антропогенной трансформации ландшафта.

Снижение численности клещей достигается: изменением сроков (позднее начало) весеннего выпаса скота, когда заканчивается период активации клещей, сокращением площади естественных лугов, выпасом скота на искусственных и культурных пастбищах, плановой или экстренной обработкой заклещевленного скота. В случае массового заклещевления обработка скота должна проводиться регулярно с интервалами 7-10 дней для наиболее полного уничтожения взрослых клещей и через 12-15 дней против личинок и нимф. Уничтожение клещей на скоте проводят химическими веществами (акарицидами) или механическим путем.

Дератизационные мероприятия включают как собственно уничтожение грызунов разными методами, так и агротехнические приемы, препятствующие повышению численности мелких млекопитающих. Хорошие результаты, в частности, дает прессование сена в тюки, качественная обработка стогов сена и ометов соломы аммиачной водой, складирование кормов после уборки урожая в хорошо оборудованные, грызунонепроницаемые хранилища. Не рекомендуется устанавливать стога сена и ометы соломы по краям оврагов или опушкам леса. Из этих стаций зверьки активно заселяют стога и ометы. В некоторых хозяйствах практикуется зимняя буксировка сена волоком при помощи тракторов непосредственно к фермам. При этом доставляются и все обитающие в стогах и ометах грызуны и повышается риск заражения работников фермы. Полевую дератизацию следует проводить в зимний и ранне - весенний (сразу после схода снежного покрова) периоды.

Переселение мышевидных грызунов из естественных мест обитания в населенные пункты начинается с уборкой урожая и вывозом сельскохозяйственных продуктов с полей, а с наступлением осенних холодов этот процесс становится массовым, особенно в годы высокой численности грызунов. Таким образом, к грызунам, обитающим в населенных пунктах, присоединяются грызуны из естественных мест обитания. Во время осенних миграций в населенный пункт дикими грызунами может быть занесен возбудитель туляремии и, вследствие этого развиться эпизоотия этой инфекции среди синантропных грызунов. Поэтому планомерное уничтожение грызунов позволяет предупредить развитие эпизоотии.

Борьба с грызунами в населенных пунктах включает в себя обеспечение грызунонепроницаемости зерно- и овощехранилищ, фуражных складов, других хозяйственных и жилых построек, водоисточников. Истребление грызунов осуществляют при помощи разнообразных орудий лова, отравленных приманок, в том числе с созданием точек долговременного отравления грызунов, химических средств, бактериальных препаратов. Важным условием качественного проведения дератизации является координация усилий всех заинтересованных организаций и учреждений.

Дезинфекция, дезинсекция и дератизация должны планироваться и проводиться на основании результатов эпизоотического обследования и обязательно сопровождаться оценкой эффективности проводимых мероприятий.

 

Заместитель руководителя

Департамента госсанэпиднадзора

С.И.ИВАНОВ

 

 

 

 

1. Методические указания "Эпидемиологический надзор за туляремийной инфекцией" (приложение 1) подготовлены д.б.н. Мещеряковой И.С. (Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф.Гамалеи РАМН), д.м.н. Кокушкиным А.М. (Российский научно - исследовательский противочумный институт "Микроб"), Федоровым Ю.М., Жилиной Н.Я. (Министерство здравоохранения Российской Федерации).

2. Методические указания "Эпизоотологический мониторинг за природными очагами туляремии" (приложение 2) подготовлены д.б.н. Мещеряковой И.С. (Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф.Гамалеи РАМН), Опочинским Э.Ф. (Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России).

3. Методические указания "Клиника, диагностика и лечение туляремии" (приложение 3) подготовлены к.м.н Савельевой Р.А. (Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф.Гамалеи РАМН), д.м.н. Беляевой Н.М. (Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России), Хадарцевым О.С. (Министерство здравоохранения Российской Федерации).

4. Методические указания "Лабораторная диагностика туляремии" (приложение 4) подготовлены д.б.н. Мещеряковой И.С. (Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалеи РАМН).

5. Методические указания "Профилактика туляремии" (приложение 5) подготовлены д.б.н. Мещеряковой И.С. (Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН), Маненковой Г.М. (Центр госсанэпиднадзора в г. Москве).

 

 



Все нормативно-правовые акты по медицине // Здравоохранение, здоровье, заболевания, лечение, лекарства, доктора, больницы //

Рейтинг@Mail.ru Яндекс цитирования

Copyright © Медицинский информационный ресурс www.hippocratic.ru, 2012 - 2018