МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

 

ПРИКАЗ

 

13 января 1983 г.

 

N 31

 

ОБ УНИФИКАЦИИ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ МЕДИЦИНСКИХ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

 

Для унификации методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов утверждаю:

Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов.

Приказываю:

1. При проведении контроля медицинских иммунобиологических препаратов, изготовляемых предприятиями Минздравов СССР, РСФСР, Союзных республик, институтами Академии Медицинских наук СССР руководствоваться "Сборником инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов".

2. Считать утратившим силу приказ по Министерству здравоохранения СССР от 19 февраля 1979 г. N 192 "О совершенствовании контроля стерильности бактерийных и вирусных препаратов".

 

Заместитель Министра

П.Н.БУРГАСОВ

 

 

 

 

 

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Министра

здравоохранения СССР

П.Н.БУРГАСОВ

11.01.1983 г.

 

СБОРНИК ИНСТРУКЦИЙ

ПО ОБЩИМ МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ СТЕРИЛЬНОСТИ,

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ, ПИРОГЕННОСТИ,

НА ОТСУТСТВИЕ КОНТАМИНИРУЮЩИХ АГЕНТОВ И ТОКСИЧНОСТИ

МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

 

Настоящий Сборник инструкций разработан в Государственном научно-техническом институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича Министерства здравоохранения СССР.

 

I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИЛЬНОСТИ

 

Определение стерильности препаратов проводят с применением тиогликолевой среды, которая выпускается отечественной промышленностью в виде сухого препарата по утвержденной НТД.

Контроль отсутствия специфической микрофлоры, которая в силу особенностей технологии производства может контаминировать некоторые препараты, должен осуществляться в соответствии с методиками, изложенными в НТД на конкретные препараты.

"Входной" контроль каждой новой серии сухой тиогликолевой среды и контроль каждой партии среды, приготовленной из компонентов (включая случаи приготовления среды из сухого порошка, но с добавлением тиогликолевой кислоты или тиогликолята extempore), должен предусматривать оценку качества среды по стерильности, ростовым и нейтрализующим свойствам.

Контроль качества каждой их последующих партий тиогликолевой среды, приготовляемых из одной серии сухого препарата (прошедшей полный "входной" контроль), должен предусматривать оценку качества только по стерильности и ростовым свойствам.

Для проверки стерильности препаратов без ртутного консерванта (мертиолята) тиогликолевая среда может быть использована в течение двух недель со дня приготовления. Среду после приготовления следует хранить в защищенном от света месте при комнатной температуре.

Для проверки стерильности препаратов, содержащих мертиолят, готовая к употреблению тиогликолевая среда должна быть использована не позднее 1-3 суток со дня приготовления. Конкретные сроки годности (1, 2, 3 суток) каждой партии тиогликолевой среды устанавливают путем испытания ее нейтрализующих свойств через сутки, двое, трое - соответственно.

В случае использования сухой тиогликолевой среды срок годности для всех партий среды, приготовляемых из одной серии сухого препарата, устанавливают в процессе осуществления "входного" контроля.

 

1. Требования к качеству тиогликолевой среды

 

Готовая к употреблению тиогликолевая среда должна отвечать следующим требованиям:

1.1. Стерильность - быть стерильной.

    1.2. Ростовые свойства - не позднее 48 часов инкубации посевов

обеспечивать рост  тест-штамма Alcaligenes faecalis 415  не  ниже,

                              -7

чем из разведения культуры  10   и  тест-штамма  Clostridium novyi

                                               -5

(oedematiens) 198 не ниже, чем из разведения 10  .

    1.3. Нейтрализующие свойства - не позднее  5  суток  инкубации

посевов обеспечивать  рост  тест-штамма  Alcaligenes  faecalis 415

при посеве его с мертиолятом в концентрации 1:10000 не  ниже,  чем

                         -7

из разведения культуры 10  .

 

2. Методика контроля качества тиогликолевой среды <*>

 

2.1. Определение стерильности

--------------------------------

<*> Методика разработана И.А.Гавристовой, З.М.Андреевой, Л.Г.Бендас

 

Для оценки стерильности готовой тиогликолевой среды после ее автоклавирования пробирки со средой в количестве не менее 2% от партии помещают в термостат при температуре 37 град. С. Учет результатов проводят через 48 часов путем визуального осмотра всех пробирок со средой. В случае пророста (помутнения) среды в оставленных на контроль пробирках, бракуют всю партию.

Образцы среды, выдержавшие двое суток при температуре 37 град. С, для проверки стерильности препаратов не используют.

 

2.2. Определение ростовых свойств

 

Для определения данных свойств тиогликолевой среды используют следующие тест-штаммы:

аэроб - Alcaligenes faecalis 415 и

анаэроб - Clostridium novyi (oedematiens) 198.

 

Характеристика тест-штаммов

 

Alcaligenes faecalis 415. Получен из института Листера (г.Лондон) в 1946 г. Подвижная грам-отрицательная палочка. Строгий аэроб. Непатогенен для человека и животных.

Clostridium novyi (oedematiens) 198. Выделен в 1930 г. Крупная грам-положительная спорообразующая палочка. Споры овальной формы, расположены субтерминально. Строгий анаэроб. Штамм непатогенен для морских свинок и мышей.

Тест-штаммы по требованию выдает ГИСК им. Л.А.Тарасевича с соответствующим паспортом. Замена указанных тест-штаммов другими не допускается.

 

Хранение и подготовка тест-штаммов для посева

в тиогликолевую среду Alcaligenes faecalis 415

 

Вскрывают ампулу с сухой культурой <*> Alcaligenes faecalis 415, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 0,5 мл) бульон Хоттингера (приложение п. 2.), тщательно перемешивают до получения гомогенной суспензии и переносят в пробирки (по 1 шт) с бульоном Хоттингера и скошенным агаром Хоттингера (приложение п. 3.). Посевы инкубируют в течение 20-24 часов при 37 град. С.

--------------------------------

<*> после вскрытия ампулы проверяют основные свойства культуры, подтверждающие ее подлинность согласно паспорту.

 

Полученную с плотной среды <*> культуру пересевают на 2-3 косяка с той же средой (агар Хоттингера), далее инкубируют посевы в течение 20-24 часов при 37 град. С, после чего полученную культуру "уколом" пересевают на среду (8-10 пробирок) Романова (приложение п. 4.). Через 20-24 часа инкубации посевов при 37 град. С на ватные пробки пробирок, содержащих культуру, надевают резиновые колпачки и хранят при температуре (+4 град. С) - (+8 град. С) (не более 6 месяцев). Допускается, в случае необходимости (получение дополнительной партии пробирок с культурой, закладываемых на хранение), произвести пересев штамма Alcaligenes faecalis 415 со среды Романова на агар Хоттингера и вновь на среду Романова. Большее количество пассажей культуры не допускается.

--------------------------------

<*> В случае отсутствия роста культуры на плотной среде пересев на косяк с агаром Хоттингера производят из бульонной культуры.

 

Для получения рабочей культуры тест-штамм Alcaligenes faecalis 415 со среды Романова пересевают на 2-3 пробирки со скошенным агаром Хоттингера. Посевы инкубируют в течение 20-24 часов при 37 град. С, затем вторично пересевают на 2-3 пробирки с агаром Хоттингера и после выращивания в течение 18-24 часов при 37 град. С используют для оценки ростовых и нейтрализующих свойств тиогликолевой среды.

 

Clostridium novyi (oedematiens) 198

 

Вскрывают ампулу с сухой культурой <*>, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 1 мл) предварительно регенерированную <**> среду Тароцци (приложение п. 5.), тщательно перемешивают и полученную гомогенную суспензию переносят в две пробирки с той же средой (посевной материал вносят на дно пробирки). Посевы инкубируют в течение 48 часов при 37 град. С.

--------------------------------

<*> после вскрытия ампулы проверяют основные свойства культуры, подтверждающие ее подлинность согласно паспорту.

<**> во всех случаях при посеве культуры С novyi 198 на среду Тароцци пользуются регенерированной средой. Регенерацию среды осуществляют перед посевом путем выдерживания пробирок со средой в кипящей водяной бане в течение 10-15 мин. и последующего быстрого охлаждения в холодной воде.

 

Полученную культуру из обеих пробирок, соблюдая правила асептики, переносят во флакон емкостью 20-30 мл (кусочки мяса не должны попадать) и центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 20 минут. Далее, с помощью пипетки отсасывают надосадочную жидкость, в полученную биомассу добавляют небольшое количество разводящей жидкости (приложение п. 6.), перемешивают и переносят <*> в пробирку для подведения под оптический стандарт мутности, соответствующий 10 единицам.

--------------------------------

<*> следует иметь в виду, что при работе с анаэробной

культурой перемешивание осуществляют с помощью пипетки, при этом во избежание попадания воздуха в культуру, пипетку не вынимают из жидкости.

 

После подведения под стандарт суспензию культуры по 1 мл высевают на 10-15 пробирок с 10 мл предварительно регенерированной питательной среды (приложение п. 7.) (аналогично регенерации среды Тароцци) для получения споровой культуры. (Для определения чистоты культуры при всех пересевах рекомендуется производить высев на скошенный агар Хоттингера). Далее, посевы инкубируют в течение 48 часов при 37 град. С, после чего содержимое пробирок перемешивают с помощью стерильной пипетки, делают мазки полученной культуры (окрашивание производят 1% раствором генцианвиолета в течение 30 секунд), микроскопируют и определяют количество спор (М) в % по формуле:

 

                               n

                          М = --- x 100%

                               N

 

где n - число спор в 3-5 полях зрения,

N - общее число (не менее 100) сосчитанных клеток (палочки и споры) в 3-х - 5-ти полях зрения.

На ватные пробки пробирок, содержащих культуру, в которой не менее 5% спор, надевают резиновые колпачки и хранят при температуре +4 град. С - +8 град. С.

В случае необходимости (частый контроль) иметь большее количество пробирок с культурой, закладываемых на хранение, полученную культуру в споровой форме следует пересеять на среду Тароцци (5-6 пробирок), инкубировать посевы при температуре 37 град. С в течение 48 часов и далее получить споры по описанной выше методике.

Для получения рабочей культуры Clostridium novyi 198 споровую культуру тест-штамма, хранящуюся на полужидкой среде, перемешивают с помощью пипетки и по 1 мл пересевают на 2-3 пробирки с 10 мл среды Тароцци. Содержимое одной пробирки со споровой формой Clostridium novyi 198 используют для 2-3-х посевов. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов при 37 град. С до обнаружения отчетливо видимого роста культуры в виде диффузного помутнения среды с четко выраженной прозрачной зоной. После чего осуществляют второй пересев тест-штамма на 2-3 пробирки с той же средой, инкубируют в течение 17-19 часов при 37 град. С и используют для оценки ростовых свойств тиогликолевой среды.

Для ускорения контроля 24-48 часовую культуру Clostridium novyi 198, полученную после высева из ампулы, следует пересеять на 2-3 пробирки со средой Тароцци, инкубировать 17-19 часов при 37 град. С и полученную культуру использовать для посева непосредственно в тиогликолевую среду.

 

Посев тест-штаммов в тиогликолевую среду

Alcaligenes faecalis 415

 

Рабочую культуру Alcaligenes faecalis 415, выращенную на агаре Хоттингера (2 пассаж), смывают с косяка стерильным физиологическим раствором и тщательно перемешивают с помощью стерильной пипетки. Затем некоторое количество полученной суспензии переносят в стерильную пробирку для подведения под оптический стандарт, соответствующий 10 единицам мутности.

    После подведения под стандарт суспензию  культуры  Alcaligenes

faecalis 415 в количестве 1 мл переносят в пробирку,  содержащую 9

                                                           -1

мл стерильного физиологического  раствора  (разведение  -10  ),  и

подобным образом последовательно получают десятикратное разведения

           -8

культуры 10  , меняя пипетку для каждого разведения.

    Для контроля  тиогликолевой  среды  используют   3   последних

                       -6     -7     -8

разведения культуры (10  ,  10  ,  10  ).  Из  каждого  указанного

разведения культуры (начиная с последнего) по 0,5 мл взвеси вносят

в 3 пробирки с 10  мл  тиогликолевой  среды  (погружая  пипетку  в

среду) и  проводят инкубирование посевов при 37 град. С.  Через 48

часов производят учет результатов.

 

Clostridium novyi (oedematiens) 198

 

    Рабочую культуру,  выращенную  в  среде  Тароцци  (2  пассаж),

центрифугируют  и  подводят  под оптический стандарт мутности.  Из

полученной суспензии 1 мл культуры пипеткой переносят в  пробирку,

содержащую  9  мл  стерильной  разводящей   жидкости   (разведение

  -1

10  ) отпуская пипетку в раствор. Подобным образом последовательно

получают  десятикратные  разведения  культуры  до  шестой пробирки

включительно

   -6

(10  ) <*>

    Для посева  на  испытуемую  среду  используют  три   последних

                       -4     -5     -6

разведения культуры (10  ,  10  ,  10  ).  Из  каждого  указанного

разведения, начиная  с  последнего,  по 0,5 мл взвеси вносят в три

пробирки с 10 мл тиогликолевой среды (погружая пипетку  в  среду).

Посевы  инкубируют при 37 град. С.  Через 48 часов производят учет

результатов.

--------------------------------

<*> Не допускается выдерживание культуры в разводящей жидкости более 30 минут.

 

2.3. Определение нейтрализующих свойств

 

Для определения данных свойств тиогликолевой среды используют тест-штамм Alcaligenes faecalis 415, характеристика, хранение и подготовка которого для посева в тиогликолевую среду описаны выше (п. 2.2.).

Стерильный 0,85% раствор хлористого натрия предварительно разливают в три пробирки, в первую из которых вносят 8 мл физиологического раствора и 1 мл раствора мертиолята в концентрации 1:1000 <*>, а в две другие - по 9 мл физиологического раствора и 1 мл раствора мертиолята. Содержимое двух последних пробирок перемешивают с помощью стерильной пипетки и удаляют из них по 1 мл раствора с целью обеспечения в каждой пробирке объема раствора, равного 9 мл.

--------------------------------

<*> Раствор мертиолята в концентрации 1:1000 (0,1 г мертиолята на 100 мл стерильного физиологического раствора) готовят во флаконе из темного стекла и хранят не более 4-х месяцев при +4 град. С - +8 град. С.

 

    Для получения разведений тест-штамма  Alcaligenes faecalis 415

в необходимой  концентрации  с  мертиолятом  в  качестве  исходной

                                            -5

используют   культуру   из   разведения   10   полученного по выше

описанной методике (см. определение ростовых свойств).

                                   -5

    Из   данного   разведения   (10  )   отбирают  1 мл культуры и

переносят в   первую   из  трех  пробирок,  содержащих  мертиолят.

Суспензию  перемешивают  и  получают  таким   образом   разведение

           -6

культуры 10   с  концентрацией  мертиолята  1:10000.  Из   данного

разведения 1 мл суспензии переносят во вторую пробирку, содержащую

физиологический раствор с мертиолятом, получая разведение культуры

  -7

10   с той  же концентрацией  мертиолита  (1:10000).  Подобным  же

                                       -8

образом получают разведение культуры 10   (с той же  концентрацией

мертиолята) <*>.

    --------------------------------

    <*> не допускается выдерживание культуры с  мертиолятом  более

30 мин до посева.

 

    Для оценки   способности  тиогликолевой  среды  нейтрализовать

                                                               -6

действие  мертиолята  используют  три  разведения  культуры (10  ,

  -7    -8

10 ,  10  )  с  мертиолятом.  Из  каждого  разведения,  начиная  с

последнего,  по  0,5  мл  взвеси  вносят  в  три  пробирки с 10 мл

тиогликолевой  среды  (погружая  пипетку  в  среду)   и   проводят

инкубирование посевов при 37 град. С.  Учет результатов производят

через 2-5 суток.

 

2.4. Учет результатов контроля

 

По окончании соответствующих сроков инкубации посевов проводят визуальный просмотр засеянных пробирок. Результаты контроля регистрируют в специальном журнале (приложение п. 8.) и дают ответ о качестве тиогликолевой среды.

    Среду признают годной по ростовым свойствам,  если не  позднее

48   часов   инкубации   посевов   визуально  обнаруживается  рост

тест-штаммов:  1. Alcaligenes faecalis 415  в  разведении культуры

  -7                                      -7

10 . При  отсутствии роста в разведении 10  , но при наличии роста

                -8

в разведении  10  ,  ответ  считают  положительным  (рост культуры

наблюдается в виде помутнения верхней части  столбика  среды).  2.

                                                -5

Clostridium novyi 198 - в разведении культуры 10  . При отсутствии

                             -5

наличии роста в разведении 10  , но при наличии роста в разведении

  -6

10  , ответ  считают  положительным  (рост  культуры через 24 часа

наблюдается в виде отдельных колоний шарообразной формы,  через 48

часов - в виде диффузного  помутнения  среды  с  четко  выраженной

прозрачной зоной в верхней части столбика среды).

    Тиогликолевую среду   признают   годной   по    нейтрализующим

свойствам,  если не позднее 5-ти суток инкубации посевов визуально

обнаруживается четко выраженный рост Alcaligenes faecalis 415  при

посеве  его  с  мертиолятом  в  концентрации  1:10000 в разведении

           -7                                           -7

культуры 10  . При  отсутствии  роста  в  разведении  10  , но при

                           -8

наличии роста разведении 10  , среду признают годной.

Партия тиогликолевой среды, не прошедшая контроль по нейтрализующим свойствам и прошедшая по ростовым может быть использована для контроля стерильности препаратов, не содержащих ртутный консервант.

 

3. Методика контроля стерильности биологических препаратов

 

Контроль стерильности биологических препаратов, вакцин, сывороток, анатоксинов, аллергенов, иммуноглобулинов и т.д. проводят путем исследования образцов готового препарата в полуфабрикате и готовой серии препарата. Готовым препаратом в полуфабрикате считают препарат, находящийся в одной производственной емкости (или разлитый в бутылки из этой емкости), из которой производят розлив в ампулы или флаконы.

Примечание. Контроль полуфабриката на более ранних стадиях должен осуществляться в соответствии с технологическими регламентами.

Готовая серия препарата - это совокупность емкостей (ампул или флаконов), разлитых из одной производственной емкости, запаянных или герметизированных тем или другим способом, идентичных в отношении опасности загрязнения во время розлива или высушивания.

Примечание. Совокупность емкостей, высушенных в одной сушильной камере, контролируется как отдельная серия.

Образец для контроля - это количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду по представленной ниже схеме (не менее 2 мл). В том случае, если емкости (ампулы или флаконы) содержат меньший объем препарата, то образец составляют из смеси содержимого нескольких емкостей.

 

3.1. Правила отбора образцов препаратов

для контроля стерильности

 

3.1.1. Отбор образцов готового препарата в полуфабрикате

 

Для контроля стерильности готового препарата в полуфабрикате берут выемку препарата в количестве не менее 6 мл. Предварительно содержимое бутылки или др. производственной емкости, в которой находится полуфабрикат, тщательно перемешивают. Взятая выемка полуфабриката должна быть посеяна в виде трех или более образцов (не менее 2 мл каждый) по схеме, представленной ниже (3.2.).

 

3.1.2. Отбор образцов препарата в процессе розлива

 

В процессе розлива препарата для контроля стерильности берут не менее, чем по одному образцу в начале, середине и в конце розлива. Для контроля могут быть взяты пробы, отобранные в процессе розлива в отдельные лабораторные емкости (пробирки, флаконы) или герметизированные емкости, в которые осуществляется розлив препарата.

    Примечание: При розливе   препаратов,   которые  в  дальнейшем

                подвергаются лиофильному  высушиванию,  необходимо

                оставлять   до   окончания  контроля  стерильности

                высушенной продукции утроенное количество образцов

                (не   менее   9)  разлитого  жидкого  препарата  в

                герметизированном виде.  Эти  образцы  могут  быть

                исследованы в случае пророста образцов высушенного

                препарата для выяснения причин контаминации.

 

3.1.3. Отбор образцов готового (разлитого, высушенного)

препарата

 

При контроле стерильности готового (разлитого, высушенного) препарата количество контролируемых емкостей (ампул или флаконов) определяется с учетом общего количества емкостей в серии. Для определения минимального числа емкостей, необходимого для контроля стерильности, следует в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения произвести расчет по формуле:

 

                                     ---

                        n = 0,4 x (\/ N),

 

где

n - необходимое для контроля число емкостей,

N - число емкостей в серии.

Принимая во внимание, что за образец для контроля принято количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду (не менее 2 мл), число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов может не совпадать. В случаях, когда объем препарата в каждой емкости равен или превышает 2 мл, число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов будет одинаковым. При меньшем объеме розлива (менее 2 мл в емкости) число засеваемых образцов будет меньше, чем число контролируемых емкостей за счет объединения нескольких емкостей в один образец.

Для удобства расчетов предлагается таблица I, позволяющая определять число емкостей и образцов, необходимое для контроля, с учетом объема серии и объема препарата в каждой емкости.

Примечание 1. Число емкостей необходимое для контроля стерильности представляет собой суммарное число емкостей контролируемых на разных этапах - в производственном отделении и в ОБК.

Примечание 2. Если серия включает в себя менее 500 емкостей, количество контролируемых емкостей должно быть не менее 10.

Примечание 3. При необходимости, с учетом особенностей технологии изготовления отдельных видов препаратов и особенностей фасовки, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные требования в отношении необходимого количества контролируемых емкостей, обеспечивающие надежность контроля стерильности препаратов.

Примечание 4. При отбраковке разлитого препарата из-за несоответствия физических свойств требованиям ТУ (помутнение, появление хлопьев), отбракованные ампулы или флаконы должны быть переданы в ОБК для выяснения характера помутнения и при необходимости проведения контроля стерильности.

Количество емкостей, отправленное в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, должно соответствовать общему количеству, контролируемому в производственном отделе и в ОБК с учетом величины серии и объема препарата, разлитого в ампулы или флаконы.

 

Таблица I

 

 

КОЛИЧЕСТВО ЕМКОСТЕЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СТЕРИЛЬНОСТИ

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОБЩЕГО ЧИСЛА ЕМКОСТЕЙ В СЕРИИ И ОБЪЕМА

ПРЕПАРАТА В КАЖДОЙ ЕМКОСТИ

 

Количество емкостей в серии	Объем препарата в емкости
	0,5 мл						1-1,5 мл						2,0 мл и более
	количество контролируемого препарата						количество контролируемого препарата						количество контролируемого препарата
	всего		производ- ство		ОБК		всего		производ- ство		ОБК		всего		производ- ство		ОБК
	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей	об- раз- цов	ем- кос- тей
501-1000	4	16	2	8	2	8	6	12	3	6	3	6	12	12	6	6	6	6
1001-2000	6	24	3	12	3	12	8	16	4	8	4	8	18	18	9	9	9	9
2001-3000	6	24	3	12	3	12	10	20	5	10	5	10	22	22	11	11	11	11
3001-4000	6	24	3	12	3	12	12	24	6	12	6	12	26	26	13	13	13	13
4001-5000	8	32	4	16	4	16	14	28	7	14	7	14	28	28	14	14	14	14
5001-6000	8	32	4	16	4	16	16	32	8	16	8	16	32	32	16	16	16	16
6001-7000	8	32	4	16	4	16	16	32	8	16	8	16	34	34	17	17	17	17
7001-8000	10	40	5	20	5	20	18	36	9	18	9	18	36	36	18	18	18	18
8001-9000	10	40	5	20	5	20	20	40	10	20	10	20	38	38	19	19	19	19
9001-10000	10	40	5	20	5	20	20	40	10	20	10	20	40	40	20	20	20	20
и более
Примечание: расчет необходимого для контроля стерильности количества емкостей препарата в случаях   иной расфасовки необходимо производить по формуле, представленной в тексте инструкции.

 

 

3.2. Техника проведения контроля стерильности

 

Лица, проводящие контроль стерильности, непосредственно перед работой в боксе моют руки с мылом при помощи щетки. В предбокснике обувь меняют на специальную боксовую, надевают стерильный халат, колпак или косынку и 4-х слойную марлевую повязку (маску), которая должна закрывать нос и рот. При работе в боксе движения, разговоры, перемещения должны быть максимально ограничены.

Перед внесением в бокс ампулы (флаконы) с препаратами должны быть проверены на герметичность путем тщательного просмотра, а препараты, высушенные под вакуумом, должны быть проверены на вакуум. После этого ампулы (флаконы) обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Перед началом работы в боксе руки должны быть обработаны спиртом.

Перед вскрытием ампул или флаконов оттянутый конец ампулы или горлышко флакона протирают спиртом и обжигают в пламени горелки.

Исследуемый препарат набирают стерильной пастеровской пипеткой при помощи ножной или ручной груши. Перед посевом пипетка проводится через пламя горелки, но не прокаливается. Посев каждого образца препарата производят отдельной стерильной пипеткой в толщу питательной среды без выдувания. Использованные пипетки, ампулы и флаконы от препаратов помещают в 3% раствор перекиси водорода и оставляют на 24 часа, после чего производится их дальнейшая обработка.

Примечание 1. Запрещается прокаливать ампулы и пастеровские пипетки в пламени горелки.

Примечание 2. Запрещается производить посев пипеткой без груши (ртом).

Перед посевом жидких препаратов содержимое ампул или флаконов необходимо встряхивать (т.к. микробы - контаминанты могут осесть на дно).

Образцы сухих препаратов предварительно растворяют стерильным растворителем (изотонический раствор хлорида натрия, дистиллированная вода и т.д.) в объеме, предусмотренном соответствующей технической документацией и после растворения засевают на питательную среду. Стерильность используемого растворителя проверяют путем его посева (по одному мл) на две пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды, пробирки выдерживают при температуре 35-37 град. С и 20-22 град. С соответственно в течение 14 суток одновременно с опытными пробирками. Посев растворителя для контроля стерильности производят до начала работы и после ее окончания. Если при посеве сухих препаратов используют несколько флаконов растворителя, стерильность каждого флакона должна быть проверена аналогичным способом.

 

3.3. Схема контроля стерильности

 

Контролируемый на стерильность образец засевают пастеровской пипеткой приблизительно по 1 мл на две пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды, одну из которых инкубируют при температуре +35-37 град. С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую - при температуре +20-22 град. С для выявления грибов.

Для препаратов, не вызывающих помутнения питательной среды (иммуноглобулины, инфекционные и неинфекционные аллергены, различные сыворотки и растворители и т.п.) пробирки выдерживают в течение 14 суток при указанных выше температурах.

Для препаратов, вызывающих помутнение питательной среды (препараты, содержащие сорбенты, микробную массу, мозговую ткань и т.п.) посев производят по указанной выше схеме, но через 5-7 суток из каждой пробирки производят пересев приблизительно по 0,5 мл на две пробирки, содержащие по 10,0 мл тиогликолевой среды, выдерживают после пересева при 35-37 град. С и 20-22 град. С соответственно. Эти пробирки инкубируют в течение 7-9 суток, в зависимости от срока пересева с таким расчетом, чтобы общий период инкубации первичного посева и пересева составлял 14 суток.

Примечание 1. Пробирки, из которых произведен пересев, сохраняются до окончания контроля стерильности.

Примечание 2. При необходимости, с учетом особенностей технологии изготовления отдельных видов препаратов, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные, экспериментально обоснованные требования в отношении срока и режима инкубации.

 

3.4. Учет результатов контроля стерильности

 

Окончательный учет результатов контроля стерильности производят путем макроскопического, а в случаях пророста и микроскопического исследования всех посевов через 14 суток после первичного посева на тиогликолевую среду.

Серия считается стерильной, если ни в одной из засеянных пробирок не наблюдается роста.

В случаях роста хотя бы в одной из засеянных пробирок контроль стерильности повторяют на том же количестве образцов, проверяя каждый образец в соответствии с представленной выше схемой. В случае роста должна быть проведена микроскопия выросших микробов. Мазки должны быть окрашены по Граму. В документации отмечают температуру, при которой произошел пророст, морфологию и окраску микробов по Граму. При отсутствии роста при повторном контроле препарат считают стерильным. При наличии роста при повторном контроле хотя бы в одной пробирке и идентичности микрофлоры при первичном и повторном посевах препарат бракуют, как нестерильный. Если при первичном и повторном посевах выявлена различная микрофлора, а также и в том и в другом случае отмечался пророст лишь в отдельных пробирках, в порядке исключения, допускается посев образцов в третий раз. При отсутствии роста препарат признают стерильным. Если в этом случае обнаруживают рост хотя бы в одной пробирке, независимо от характера микрофлоры, препарат признают нестерильным и бракуют.

Результаты контроля исследуемых препаратов регистрируют в специальных производственных журналах.

 

Приложение

 

                      1. Тиогликолевая среда

 

    Состав:                                                 г/л

    1. Панкреатический гидролизат казеина неглубокой

       степени расщепления (ТУ.42.14.1-74)                  - 15,0

    2. Дрожжевой экстракт                                   - 5,0

    3. Натрия хлорид                                        - 2,5

    4. Глюкоза                                              - 5,0

    5. Цистин                                               - 0,75

    6. Тиогликолевая кислота (мл)                           - 0,3

                или

       тиогликолят натрия                                   - 0,5

    7. Агар                                                 - 0,75

                                     -----------------------------

                           рН 7,0 +/-  0,2 (после автоклавирования

                                                                 1

                                               среды при 120 - 20

 

                       2. Бульон Хоттингера

 

    Состав:                                                 г/л

    Гидролизат Хоттингера                                   - 20,0

    Натрия хлорид                                           - 5,0

                                     -----------------------------

                          рН 7,1 +/-  0,1 (после автоклавирования)

 

    Приготовление:

    Гидролизат Хоттингера <*>  смешивают   с   водой   из  расчета

содержания в 1 л среды 20 г сухих веществ, вносят хлористый натрий

                                -

до 5 г/л (с учетом содержания Cl  в гидролизате Хоттингера).

    Устанавливают рН 8,0-8,2 10% раствором NaOH, кипятят в течение

3-5 минут,  фильтруют  через ватно-марлевый фильтр,  устанавливают

рН 7,2-7,4 5%  раствором HCl.  Разливают  по 10 мл  в  пробирки  и

                                1

автоклавируют при 120 град. - 20 .

    --------------------------------

    <*> Во  всех  питательных  средах,  имеющих  в  своем  составе

гидролизат  Хоттингера,  используется  гидролизат,  предварительно

освобожденный  от  балластных  белков,   которые   удаляют   путем

подкисления до рН 4,5-4,7 раствором  соляной кислоты  (соотношение

с водой 1:1),   последующего  кипячения  в  течение  1-2  минут  и

фильтрации.

 

    Готовая среда годна к употреблению в течение  2-х  месяцев  со

дня  приготовления  при  условии  хранения  ее  при температуре +4

град. С. - +8 град. С.

 

                        3. Агар Хоттингера

 

    Состав:                                                 г/л

    Гидролизат Хоттингера                                   - 20,0

    Натрия хлорид                                           - 5,0

    Агар                                                    - 20,0

                                     -----------------------------

                          рН 7,1 +/-  0,1 (после автоклавирования)

 

    Приготовление:

    Гидролизат Хоттингера (см. прил.  п. 2.)  смешивают с водой из

расчета содержания  в  1  л  среды  20  г  сухих  веществ,  вносят

                                                  -

хлористый натрий  до 5 г/л (с учетом содержания Cl   в гидролизате

Хоттингера) и агар,  устанавливают  рН 8,0-8,2 10% раствором NaOH.

Расплавление агара  производят  в  автоклаве  при  100  град. С  в

течение часа, затем среду фильтруют  через  ватно-марлевый фильтр,

устанавливают рН 7,2-7,4 5% раствором HCl.  Разливают  по  5  мл в

                                             1

пробирки и автоклавируют при 120 град. С - 20 .

    Готовая среда  годна  к  употреблению в течение 2-х месяцев со

дня приготовления при  условии  хранения  ее  при  температуре  +4

град. С - +8 град. С.

 

                        4. Среда Романова

 

    Состав:                                                 г/л

    Панкреатический гидролизат казеина                      - 8,0

    Натрия хлорид                                           - 5,0

    Агар                                                    - 10,0

                                     -----------------------------

                          рН 7,1 +/-  0,1 (после автоклавирования)

 

    Приготовление:

    Панкреатический гидролизат  казеина  <*>  смешивают с водой из

расчета 8 г сухих веществ на 1 литр,  вносят хлористый натрий до 5

                              -

г/л (с  учетом  содержания  Cl    в   гидролизате казеина) и агар,

устанавливают рН 8,0-8,2 10%  растровом NaOH.  Расплавление  агара

производят  в  автоклаве при  100 град. С в течение 1 часа,  затем

среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2-

7,4 5% раствором HCl. Разливают по 5 мл в пробирки  и  стерилизуют

                    1

при 120 град. С - 20 .

    --------------------------------

    <*> Используют   панкреатический   гидролизат  казеина  (общий

азот - 12, 12,5%,  аминный азот 5-7% (предварительно освобожденный

от  балластных  белков  по методу,   изложенному  для  гидролизата

Хоттингера (см. приложение п. 2.).

 

    Готовая среда  годна  к  употреблению в течение 2-х месяцев со

дня приготовления при  условии  хранения  ее  при  температуре  +4

град. С - +8 град. С.

 

                         5. Среда Тароцци

 

    Состав                                                    г/л

    Гидролизат Хоттингера                                   - 25,0

    Глюкоза                                                 -  5,0

    Натрия хлорид                                           -  5,0

    Агар                                                    -  1,0

    Мясной фарш                                        - 0,3 - 0,5

    (на 1 пробирку с                ------------------------------

    10 мл среды)           рН 7,3 +\- 0,1 (после автоклавирования)

 

    Приготовление:

    Гидролизат Хоттингера (см. приложение  п. 2) смешивают с водой

из  расчета  содержания  в  1  л среды 25 г сухих веществ,  вносят

                                                 -

хлористый натрий до 5 г/л (с учетом содержания Cl   в  гидролизате

Хоттингера) и агар,  устанавливают  рН 8,0-8,2 10% раствором NaOH.

Смесь кипятят до расплавления агара (3-5 минут),  фильтруют  через

ватно-марлевый  фильтр,  добавляют глюкозу и устанавливают рН 7,4-

7,6 5% раствором HCl.  Разливают  по  10 мл в пробирки, содержащие

                                                1

мясной фарш и автоклавируют при 110 град. С - 30 .

    Готовая среда годна к употреблению в течение  2-х  месяцев  со

дня  приготовления  при  условии  хранения  ее  при температуре +4

град. С - +8 град. С.

    Приготовление фарша:

    Мясной фарш заливают холодной водой и кипятят в  течение  5-10

минут,   затем   сливают  воду,  фарш  промывают  холодной  водой,

отжимают,  снова заливают водой и повторяют операцию до  получения

полностью  обезжиренного  фарша.  После  чего  его  закладывают во

флаконы,  автоклавируют  при  120  град. С  30 минут  и  хранят  в

холодильнике при температуре +4 град. С - +8 град. С.

    По мере  необходимости  фарш  раскладывают  по  пробиркам  (из

расчета 0,3-0,5 г на 10 мл среды),  автоклавируют  при 120 град. С

в течение  30  минут  и  ставят  в  термостат при 37 град. С  - 45

град. С до полного высыхания фарша.

     Следует иметь в  виду,  что  при  использовании  недостаточно

обезжиренного и высушенного фарша среда дает опалесценцию.

 

                6. Раствор для разведения культуры

 

    Состав:                                                   г/л

    Натрия хлорид                                            - 8,5

    Тиогликолевая кислота (мл)                               - 0,3

                                     -----------------------------

                           рН 7,0 +/- 0,2 (после автоклавирования)

 

    Приготовление: (1 л)

    Растворяют 8,5 г соли в 1 л дистиллированной  воды,  добавляют

0,3 мл  тиогликолевой  кислоты,  устанавливают  рН 7,2 +/- 0,2 10%

раствором Na2HPO4,  разливают во флаконы,  автоклавируют  при  120

град. С в течение 20 минут. Разводящую жидкость можно использовать

в течение недели со дня  приготовления  при  соблюдении  следующих

условий:  если  срок  хранения  раствора  превышает  сутки  со дня

приготовления,  его необходимо регенерировать перед посевом  путем

выдерживания флаконов в кипящей водяной бане в течение 10-15 минут

с последующим охлаждением до температуры, не превышающей 40  град.

С.

    Следует иметь в виду,  что для удобства  в  работе  разводящую

жидкость  перед  регенерацией  рекомендуется  стерильно  разлить в

пробирки  по  9  мл,  регенерировать  ее  в  пробирках   и   затем

использовать для разведения культуры.

 

                   7. Среда для получения спор

 

    Состав:                                                    г/л

    Панкреатический гидролизат казеина неглубокой

    степени расщепления (ТУ.42.14 74)                         - 15

    Глюкоза                                                   - 2

    Натрия хлорид                                             - 5,0

    Агар (вымороженный корсаковский)                          - 1,0

    Казеин хлоркальциевый                                 - 0,3-0,5

    ( на 1 пробирку с 10 мл среды)

                                      ----------------------------

                           рН 7,8 +/- 0,1 (после автоклавирования)

 

    Приготовление:

    Гидролизат казеина смешивают с водой,  вносят хлористый натрий

и агар. Устанавливают рН 7,9-8,1 10% раствором NaOH. Смесь кипятят

до расплавления агара (3-5 минут), фильтруют через  ватно-марлевый

фильтр,  добавляют  глюкозу.   Разливают   по  10 мл  в  пробирки,

содержащие стерильный  казеин  (стерилизация  казеина 120 град. -

  1                                             1

30 ) и автоклавируют среду  при  120 град.  - 20 .  Готовая  среда

годна к употреблению в течение 2-х месяцев  со  дня  приготовления

при условии хранения ее при температуре +4 град. С - +8 град. С.

 

8. Журнал учета

результатов оценки качества тиогликолевой среды

 

┌───┬────┬────┬─────┬───────────────────────────┬───────────────────────┬──────┬───────┬─────┐

│ N │Дата│Но- │Дата │    Ростовые свойства      │Нейтрализующие свойства│Заклю-│Подпись│При- │

│п/п│кон-│мер │приг.├─────────────┬─────────────┼───────────────────────┤чение │отв. за│меча-│

│   │тро-│се- │сре- │     415     │    198      │  415 с мерт. 1:10000  │о при-│конт-  │ние  │

│   │ля  │рии │ды   ├──────┬──────┼──────┬──────┼──────┬───────┬────────┤годно-│роль   │     │

│   │    │сре-│     │24час.│48час.│24час.│48час.│24час.│48 час.│ 5 сут. │сти   │       │     │

│   │    │ды  │     ├──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┤среды │       │     │

│   │    │    │     │-6-7-8│-6-7-8│-4-5-6│-4-5-6│-6-7-8│-6-7-8 │ -6-7-8 │      │       │     │

│   │    │    │     │101010│101010│101010│101010│101010│101010 │ 101010 │      │       │     │

├───┴────┴────┼─────┼──────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼──────┼───────┼─────┤

│   Пример    │     │      │      │      │      │      │       │        │      │       │     │

│ 1.│15. │39- │14.2.│      │      │      │      │      │       │        │      │       │     │

│   │2.81│81г.│81   │ + + +│ + + +│ + + +│ + + +│ - - -│ + + - │ + + +  │При-  │       │     │

│   │    │    │     │ + + +│ + + +│ + + -│ + + +│ - - -│ + + - │ + + +  │годна │       │     │

│   │    │    │     │ + + -│ + + +│ + + -│ + + -│ - - -│ + - - │ + + -  │      │       │     │

└───┴────┴────┴─────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴────────┴──────┴───────┴─────┘

 

10. Требования, предъявляемые к боксам

 

Контроль стерильности медицинских биологических препаратов должен проводиться квалифицированным персоналом в специальных боксах с обеспечением строгих правил асептики.

Боксы представляют собой изолированные застекленные камеры достаточной площади и кубатуры для проведения в них бактериологических исследований. Боксы должны быть хорошо освещены и обеспечены вентиляцией. Оптимальным является оборудование боксов приточно-вытяжной вентиляцией с подачей стерильного кондиционированного воздуха.

Внутреннее устройство боксов должно обеспечивать легкость и надежность поддержания чистоты и возможность дезинфекционной обработки. С этой целью газовые и водопроводные трубы, а также электропроводку размещают вне бокса или в толще его стен. Отопительные батареи устанавливают гладкими без ребер, что препятствует осаждению пыли. Стены бокса на высоту не менее полутора метров от пола облицовывают метлахской плиткой, или как и потолок, окрашивают в светлые тона масляной краской. Полы покрывают линолеумом, метлахской плиткой или пластиком. Такая отделка поверхностей позволяет использовать при уборке помещения дезинфицирующие растворы. В боксе должно находиться минимальное количество мебели - стол и табуреты.

За последние годы хорошо зарекомендовали себя в работе настольные боксы с ломинарным потоком стерильного воздуха, позволяющие проводить исследования в условиях, исключающих возможность загрязнения испытуемого препарата.

Примечание: В боксах, предназначенных для проведения контроля стерильности медицинских биологических препаратов, работа с живыми микробными культурами не допускается.

К боксу должен примыкать предбоксник, отделенный от него стеклянной перегородкой с дверью и передаточными окнами - помещение, куда вносятся подготовленные для посева препараты, питательные среды, пипетки и биксы со стерильными халатами, косынками или колпаками, марлевыми повязками (масками). В предбокснике персонал переодевается в стерильную одежду и специальную обувь для боксов.

Перед входом в бокс и предбоксник помещают матерчатый или губчатый коврик, увлажненный 3% раствором перекиси водорода, для протирания обуви.

К предбокснику должна примыкать комната, где хранятся питательные среды, необходимые для проведения контроля стерильности стерильная посуда; в этой комнате проводят всю вспомогательную работу (обработка 3% раствором перекиси водорода образцов ампул и флаконов с препаратами, штативов для питательных сред, маркировка пробирок и т.д.).

Ежедневно бокс и предбоксник подвергают тщательной уборке и обеззараживают путем протирания ветошью, смоченной в 3% растворе перекиси водорода с 0,5% сульфанола или порошка "Новость". Для приготовления раствора перекиси водорода с моющими средствами используют любую посуду, в которой разводят пергидроль водой (добавляют в воду пергидроль, а затем моющие средства).

Для приготовления 10 л раствора берут следующие количества препаратов: 1200 мл пергидроля, 50 г моющего средства и 8750 мл воды при 40-50 град.

Примечание: Для простоты приготовления раствора целесообразно иметь вымеренную по объему посуду, соответствующую весу или объему ингредиентов, из которых готовят рабочий раствор.

Готовят раствор и обрабатывают бокс и предбоксник в резиновых перчатках и марлевой повязке (маске). Норма расхода дезинфицирующего раствора 70-100 мл/кв. м.

Раствор готовят непосредственно перед употреблением. При отсутствии возможности использовать дезинфицирующий раствор, производят обработку горячим (50-60 град.) мыльно-содовым раствором (1% раствора соды или стирального порошка и 0,5% нашатырного спирта) с последующим протиранием стен, полов, мебели одним из следующих дезинфицирующих растворов:

а. 2% раствор хлорамина,

б. 3% раствор фенола,

в. раствор антисептола.

Для приготовления антисептола берут 2 раствора: 50% раствор хлорной извести и 5% раствор кальцинированной соды. Перед употреблением растворы сливают в равных объемах и разбавляют в 50 раз водой. Работу с антисептолом производят в резиновых перчатках.

Для обеззараживания боксов применяют бактерицидные лампы БУВ, устанавливаемые из расчета: 1 лампа БУВ-30 на 12 куб. метров объема воздуха или 2-2,5 ватта мощности на квадратный метр поверхности (числа в названиях ламп обозначают их мощность в ваттах). Лампы размещают на потолке и на стенах. Облучение бокса производят до начала работы в течение 1,5-2 часов. Во время работы лампы должны быть выключены. Необходимо учитывать время эксплуатации ламп и по окончании гарантийного срока заменять лампы новыми, если даже они продолжают "светить".

Ежедневно в начале работы и в конце работы контролируют чистоту воздуха в боксе и предбокснике, помещая на 15 минут открытые чашки Петри с питательным агаром и со средой Сабуро, с последующим термостатированием первых при температуре 35-37 град. С в течение двух суток, а во вторых при 20-22 град. С в течение трех суток.

Допустимым считается рост не более 5 колоний микробов - сапрофитов на одной чашке. Рост большего числа колоний указывает на повышенную загрязненность воздуха в боксе. В этих случаях необходимо провести дополнительную дезинфицирующую обработку бокса и предбоксника. В случае появления колоний грибов помимо дезинфекции обращают особое внимание на снижение влажности в боксе и предбокснике путем просушивания с помощью электронагревательных приборов. Если в боксе выявляются спорообразующие микроорганизмы или грибы, то при уборке помещения увеличивают концентрацию перекиси водорода до 6%.

 

11. Журнал

по проверке боксовых помещений на обсемененность

 

Дата конт- роля	Дата учета	До работы		После работы		Заключение (характер  микрофлоры, принятые   меры)	Под- пись
		Питатель- ный агар	Агар Са- буро	Питатель- ный агар	Агар Са- буро
		Количество колоний		Количество колоний

 

12. Журнал учета

обсемененности рук у лиц, работающих в боксах

 

Дата конт- роля	Дата учета	Фамилия, имя, отчество	Питатель- ный агар	Агар Сабуро	Заключение (характер  микрофлоры, принятые   меры)	Под- пись
			Количество колоний

 

У лиц, работающих в боксе, периодически проверяют степень обсемененности рук после мытья. Эту проверку проводят следующим образом: пальцами рук прикасаются к поверхности плотной питательной среды в чашке Петри и делают несколько круговых движений, "засеянные" чашки термостатируют при 35-37 град. в течение двух суток. Появление более 5 колоний сапрофитов указывает на недостаточную чистоту рук для проведения асептической работы.

Результаты проверки обсемененности воздуха бокса и предбоксника и обсемененности рук должны быть зарегистрированы в специальных журналах.

Постоянно следует обращать особое внимание на надежность стерилизации используемых для работы в боксе инструментов, лабораторной посуды, дистиллированной воды и различных растворов. Должен быть обеспечен надежный контроль указанных материалов, а также тщательный контроль стерильности используемых питательных сред.

 

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИЧЕСКИХ, ХИМИЧЕСКИХ И

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕДИЦИНСКИХ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

 

1. Определение фенола

 

1.1. Метод с реактивом Фолина

 

Метод основан на свойстве реактива Фолина давать цветную реакцию с фенолом.

Методика определения. 1 мл препарата разводят в мерной колбе емкостью 50 мл водой. К 0,5 мл разведенного препарата добавляют 9,5 мл воды и 0,5 мл реактива Фолина, содержимое перемешивают. Добавляют 2 мл 20% раствора карбоната натрия, перемешивают; затем пробу помещают в кипящую водяную баню на 1 минуту. После охлаждения измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя в 10 мм при длине волны 310 нм против контрольного раствора (10 мл воды, 0,5 мл реактива Фолина, 2 мл 20% раствора карбоната натрия). Содержание фенола в препарате вычисляют по калибровочной кривой.

Калибровочная кривая. 500 мг (точная навеска) дважды перегнанного фенола растворяют в воде и объем доводят до 50 мл (10 мг/мл). Этот раствор хранят в склянке из темного стекла при температуре 4-8 град. (может быть использован в течение года). Перед употреблением 1 мл этого раствора разводят в 100 раз (100 мкг/мл) и готовят разведения с содержанием фенола 5-25 мкг с интервалом 5 мкг. Объем проб доводят по 10 мл водой, добавляют реактивы и определяют оптическую плотность растворов, как указано выше.

Примечание.

Получение чистого фенола. Для приготовления стандартного раствора используют дважды перегнанный фенол. Перегонка фенола проводится при температуре 182 град. следующим образом: в перегонную колбу выливают расплавленный фенол (3/4 от объема колбы), добавляют стеклянные капилляры длиной 40-50 мм, диаметром 1-2 мм. Перегонку ведут на электрической плитке с закрытой спиралью (между колбой и плиткой должен быть небольшой воздушный зазор 10-20 мм).

Перегонный аппарат состоит из перегонной колбы (шлиф N 29), дефлегматора, холодильника, который устанавливается вертикально, алонжа и приемника.

Перегонку вести осторожно, так как пары фенола взрывоопасны. Фенол хранить в темной склянке с надписью: "яд!".

Приготовление реактива Фолина. Метод изложен в разделе "Определение белка по методу Лоури".

 

1.2. Спектрофотометрический метод

 

Метод основан на способности фенола поглощать ультрафиолетовый свет и заключается в измерении оптической плотности растворов при лямбда = 269 нм и лямбда = 290 нм с последующим определением содержания фенола по калибровочной кривой. Метод может быть применен при содержании белкового азота не более 0,5 мг/мл.

Методика определения. 0,5 мл препарата разводят водой в мерной колбе на 50 мл. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при Л = 269 нм и Л = 290 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора, которым является вода. Находят разность между первым и вторым показателем и, используя ее, по калибровочной кривой определяют концентрацию фенола в разведенном препарате. Концентрацию фенола в исходном препарате в % (Х) вычисляют по формуле:

 

                         а х 100 х 100    а

                     Х = ------------- = ---,

                           1 000 000     100

 

где а - количество фенола в мкг/мл, найденное по калибровочной кривой.

 

Калибровочная кривая. Готовят раствор фенола с концентрацией 10 мг/мл, как указано в методике 1.1. Перед определением раствор фенола разводят в 100 раз. К 0,5-2,5 мл этого раствора с интервалом 0,5 мл добавляют воду до 5 мл (концентрация фенола 10, 20, 30, 40, 50 мкг/мл) и измеряют оптическую плотность, как указано выше.

 

2. Определение формальдегида

 

Метод основан на образовании хиноидного красителя при взаимодействии фуксинсернистого реактива с воднорастворимыми альдегидами.

Методика определения. 1 мл препарата доводят водой до 5 мл, прибавляют 1 мл раствора фуксинсернистой кислоты, перемешивают, пробирки закрывают резиновыми пробками и оставляют на час. Оптическую плотность раствора измеряют при синем светофильтре (лямбда = 400 +/- 5 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора (5 мл воды и 1 мл раствора фуксинсернистой кислоты). Расчет производят по пропорции на основании сравнения окраски препарата со стандартом, имеющим оптическую плотность, наиболее близкую к оптической плотности испытуемого раствора. При наличии опалесценции в препарате производят визуальное определение путем сравнения со стандартом на фоне белой бумаги.

Калибровочная кривая. 1 мл 40% раствора формальдегида доводят водой до 100 мл (0,4% раствор формальдегида). Предварительно определяют содержание формальдегида в исходном растворе. Если содержание формальдегида в растворе меньше 40%, то производят соответствующий перерасчет. Перед употреблением 0,4% раствор формальдегида разводят в 100 раз. 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мл этого раствора доводят водой до 5 мл, добавляют реактив и анализируют, как описано выше (концентрация формальдегида в пробах соответствует 0,002; 0,004; 0,008; 0,012; 0,016 и 0,02%).

Примечание.

1. Приготовление раствора фуксинсернистой кислоты. 1 г фуксина основного или парафуксина для фуксинсернистой кислоты растворяют в 500 мл горячей воды на кипящей водяной бане. Раствор охлаждают до 18-20 град., фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу емкостью на 1 л и прибавляют 30 мл 20% раствора пиросернистокислого калия (или раствора пиросернистокислого натрия - 25 мл), через 20 минут к смеси прибавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты, доводят объем водой до метки и выдерживают не менее суток. Перед использованием раствора фуксинсернистой кислоты его титруют 0,1 н. раствором йода (индикатор - 0,5% раствор крахмала).

На титрование 3 мл фуксинсернистой кислоты должно расходоваться от 3 до 4 мл раствора йода. Если объем раствора йода, израсходованного на титрование меньше 3 мл, то к 100 мл приготовленного реактива прибавляют пиросернистокислый калий (или натрий) из расчета 200 мг на каждый мл разницы между 3 мл и израсходованным объемом раствора йода. Если объем раствора йода, израсходованного на титрование больше 4 мл, то к 100 мл реактива прибавляют раствор фуксина основного (или парафуксина) в количестве, рассчитываемом по формуле:

 

                        V = 27 х V1 - 100,

 

где

V - объем 0,1 н. раствора йода, израсходованного на титрование 3 мл реактива, мл.

Приготовленный реактив применяется не ранее, чем через сутки. Реактив должен быть бесцветным, допускается слегка желтоватая окраска.

Для осветления раствора не допускается применение активированного угля. Реактив хранят в склянке из оранжевого стекла с притертой пробкой.

2. Количественное определение формальдегида. 1 г препарата (точная навеска) разбавляют водой в мерной колбе емкостью 100 мл до метки. К 5 мл этого раствора в колбе с притертой пробкой прибавляют 20 мл 0,1 н. раствора йода и 10 мл 1 н. раствора едкого натрия, перемешивают и оставляют в темном месте на 10 минут. Затем прибавляют 11 мл 1 н. раствора серной кислоты, выделившийся йод титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия до обесцвечивания (индикатор - 0,5% раствор крахмала). 1 мл 0,1 н. раствора йода соответствует 0,001501 г формальдегида, которого в препарате должно быть не менее 36% и не более 40%. Если содержание формальдегида меньше 40%, то для приготовления 1% раствора формальдегида производят соответствующий перерасчет.

Периодически проверяют содержание формальдегида в 0,4% растворе формальдегида по указанной выше методике не реже одного раза в месяц.

 

3. Определение мертиолята

 

3.1. Колориметрический метод

 

Метод основан на выделении из мертиолята ртути в виде свободных ионов и последующем колориметрическом определении дитизоната ртути.

Методика определения. 0,2 мл препарата вносят в колбу с притертой пробкой емкостью 100 мл, прибавляют 1,2 мл разведенной по объему в 2 раза концентрированной серной кислоты (при наличии гидроокиси алюминия в препарате смесь осторожно нагревают на водяной бане до полного ее растворения), 5 мл 5% раствора перманганата калия хорошо перемешивают и оставляют на один час. Избыток перманганата калия удаляют добавлением 1,5 мл 20% раствора сульфата гидроксиламина, добавляют 30 мл дважды дистиллированной воды, 5 мл 6 М раствора уксусной кислоты и перемешивают. К полученному раствору из бюретки добавляют 10 мл 0,001% раствора дитизона и встряхивают 30 секунд. Содержимое колбы переносят в делительную воронку и после разделения слоев нижней хлороформенный слой фильтруют через предварительно прокипяченную и высушенную вату в кювету с толщиной слоя 20 мм. Определяют оптическую плотность хлороформенного раствора на фотоэлектроколориметре с оранжевым светофильтром (лямбда = 580 +/- 10 нм) или красным светофильтром (лямбда = 597 +/- 10 нм). Одновременно по этой же методике готовят контрольный раствор, содержащий все вышеперечисленные компоненты, кроме испытуемого препарата. На основании оптической плотности, измеренной по отношению к контрольному раствору, по калибровочной кривой находят содержание ртути в испытуемом растворе.

Содержание мертиолята в препарате в мкг/мл (Х) вычисляют по формуле:

 

                          а х 100

                    Х = ----------- = а х 10,1

                        0,2 х 49,55

 

где а - количество ртути в мкг, найденное по калибровочной кривой

0,2 - количество испытуемого препарата в мл;

49,55 - содержание ртути в 100 частях мертиолята.

Калибровочная кривая. 0,5 г металлической ртути (точная навеска) растворяют в 15 мл концентрированной азотной кислоты и объем доводят до 500 мл (1 мг/мл). Определяют содержание ртути. Перед употреблением раствор разводят водой в 100 раз. К 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мл полученного раствора добавляют по 1,2 мл разведенной по объему в два раза концентрированной серной кислоты, 30 мл дважды дистиллированной воды, 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 5 мл 6 М раствора уксусной кислоты, далее проводят анализ, как в опытной пробе.

Калибровочную кривую проверяют перед каждым определением.

Примечание. 1. Приготовление 0,001% раствора дитизона. 10 мг дитизона (точная навеска) растворяют в хлороформе и объем доводят до 100 мл. Раствор хранят в темном месте при 4 град. - 8 град. в течение месяца. Перед употреблением раствор разводят в 10 раз.

2. Определение содержания ртути. К 10 мл раствора с концентрацией ртути 1 мг/мл добавляют 10 капель 10% раствора железоаммонийных квасцов и медленно титруют 0,01 н. раствором роданида аммония до изменения окраски в оранжевый цвет. 1,0 мл 0,01 н. раствора роданида аммония соответствует 0,001003 г ртути.

3. При отсутствии дважды дистиллированной воды применяют воду, обработанную дитизоном. Воду помещают в делительную воронку и добавляют на 1 л воды 10 мл 0,01% раствора дитизона. Тщательно взбалтывают и отделяют хлороформенный слой. Если цвет раствора дитизона изменяется, то процедуру повторяют до прекращения изменения цвета раствора дитизона. Для удаления остатка дитизона воду промывают несколько раз свежими порциями хлороформа.

 

3.2. Полярографический метод

 

Метод основан на полярографической активности мертиолята.

Методика определения. К 4,5 мл испытуемого препарата добавляют 0,5 мл 2 М раствора хлорида калия. Пробу помещают в электролизер, термостатируемый при 20 град. С. Через испытуемый раствор пропускают в течение 10-15 минут газообразный азот. Ртутный капельный электрод опускают в электролизер и снимают полярограмму на полярографе с регистрирующим устройством в области потенциала от 0,2 до 1,0 в (внутренний анод).

Содержание мертиолята в препарате в мкг/мл (Х) рассчитывают по формуле:

 

                          а х 5,0

                      Х = ------- = 1,1 х а

                            4,5

 

где а - концентрация мертиолята в анализируемой пробе в мкг/мл, рассчитанная по калибровочной кривой.

 

Калибровочная кривая.

1,5 г мертиолята (точная навеска) растворяют в воде и доводят объем до 100 мл. Раствор хранят при 4-8 град. С в течение 3 месяцев. Перед определением 1,0 мл этого раствора доводят водой до 100 мл. К 1,0-4,5 мл полученного раствора с интервалом в 0,5 мл добавляют 0,5 мл 2 М раствора хлорида калия, доводят общий объем водой до 5 мл и проводят анализ, как описано выше. На полученных полярограммах измеряют высоту волны и строят калибровочный график, на оси ординат которого откладывают значение высоты волны (среднее трех определений), а на оси абсцисс - соответствующие значения концентрации мертиолята в мкг/мл.

Калибровочная кривая пригодна неограниченное время для данного капилляра при постоянных условиях определения (температура, время каплеобразования).

Примечание.

1. Азот газообразный ГОСТ 9293-74, сорт 1.

2. Ртуть металлическая ГОСТ 4658-73, марка Р2.

3. Мертиолят, используемый для приготовления стандартного раствора, должен соответствовать требованиям, перечисленным ниже.

 

Методы оценки качества мертиолята

 

    Мертиолят (тиомерсал)

    о - этилртутьтиосалицилат натрия

    C9H9HgNaO2S                                      Мол. м. 404.8

Описание. Легкий кремоватый кристаллический порошок со слабым характерным запахом.

Растворимость. 1 часть препарата без остатка растворяется при 20 град. С в 1 части воды, а также в 30 частях этилового спирта (95 град.). Окраска раствора должна быть бесцветной или светло-желтой.

Препарат почти нерастворим в бензоле и эфире.

Кислотность и щелочность. рН 6,0-8,0 (1% раствор на свежепрокипяченой воде, потенциометрически).

Подлинность. 0,05 г препарата растворяют в 5,0 мл воды. К раствору добавляют 1,0 мл 10% раствора азотнокислого серебра. Выделяется белый осадок.

0,05 г препарата растворяют в 5,0 мл воды. К раствору добавляют 1,0 мл 10% раствора сульфата меди. Выделяется осадок зеленого цвета.

0,5 г препарата растворяют в 10 мл воды и добавляют 2,0 мл 2 н. раствора соляной кислоты. Выделившийся белый осадок собирают на воронке Бюхнера и промывают водой до отсутствия хлорид-ионов. Осадок, высушенный над пятиокисью фосфора при давлении не более 5,0 мм рт. ст. до постоянной массы, имеет температуру плавления приблизительно 110 град. С.

Ртутные соли. 0,1 г препарата растворяют в 5,0 мл воды. К раствору добавляют 1,0 мл 5% свежеприготовленного раствора сульфата натрия. Выпадающий белый осадок не должен изменять цвета при выдерживании в темном месте в течение 30 минут.

Растворимые в эфире вещества. Около 0,5 г препарата (точная навеска) встряхивают с 20,0 мл эфира в течение 10 минут, фильтруют через стеклянный фильтр N 3. Эфир выпаривают досуха. Остаток, высушенный в течение 24 часов над пятиокисью фосфора при давлении не более 5,0 мм рт. ст., должен весить не более 4,0 мг.

Влажность. 0,5 г препарата высушивают в течение 24 часов над пятиокисью фосфора при давлении не более 5,0 мм рт. ст. Потеря в массе после высушивания не должна превышать 0,5%.

Количественное определение. Около 0,3 г препарата (точная навеска) растворяют в 10,0 мл воды, добавляют 1,5 г растертого перманганата калия и хорошо перемешивают. Через 5 минут в колбу осторожно добавляют при постоянном перемешивании по каплям 5,0 мл концентрированной серной кислоты.

Через 5-10 минут выделившийся осадок растворяют при постепенном добавлении 4,0-8,0 мл 3% раствора перекиси водорода. К обесцвеченному раствору прибавляют по каплям 5% раствор перманганата калия до неисчезающего розового окрашивания (разложение перекиси водорода). Раствор вновь обесцвечивают добавлением по каплям 4% раствора щевелевой кислоты. Полученный раствор после добавления 5,0 мл 10% раствора железоаммонийных квасцов медленно титруют 0,1 н. раствором роданида аммония до изменения окраски. 1,0 мл 0,1 н. раствора NH4CNS соответствует 0,02024 г мертиолята. Высушенный над пятиокисью фосфора препарат должен содержать не менее 98% и не более 101% мертиолята.

Хранение. ЯД! Хранят в банке с притертой пробкой, в защищенном от света месте.

Препарат подвергают переконтролю 1 раз в 3 месяца. Если мертиолят не соответствует одному из перечисленных требований, его бракуют.

 

4. Определение рН

 

Определение рН производят потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода. Измерение проводят в соответствии с инструкцией к прибору.

При определении рН в иммуноглобулинах и сыворотках препарат разводят 0,9% раствором хлорида натрия до содержания белка 1% (раствор хлорида натрия предварительно доводят до рН 7,0-7,2).

Сорбированный препарат не разводят, и определение рН проводят в суспензии.

Для определения рН в сухих питательных средах готовят 2% раствор препарата.

 

5. Определение остаточной влажности

 

Бюксы высотой 3,5 см, диаметром 2,5 см доводят до постоянной массы при температуре 100-105 град. 0,15-0,20 г препарата (точная навеска) помещают в бюкс и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение 3 часов при температуре 60 +/- 1 град. и остаточном давлении, не превышающем 5 мм рт. ст. Бюксы с закрытыми крышками выдерживают в эксикаторе над хлористым кальцием в течение 30-40 мин до полного охлаждения и производят взвешивание. Расчет остаточной влажности в процентах производят по разности масс до и после высушивания.

При определении остаточной влажности в питательных средах высушивания препарата проводят в сушильном шкафу при 100 +/- 2 град. в течение 2 часов. Остальные условия метода (величина навески и размер бюксов) описаны выше.

 

6. Определение точности розлива

в лиофилизированных препаратах

 

6.1. Весовой метод

 

Принцип метода заключается в определении массы вещества в каждой емкости и расчете коэффициента вариации.

Флаконы или ампулы (10 штук) без этикеток, обрабатывают смесью спирта с эфиром (1:1), помещают в коробку с пронумерованными ячейками и ставят в эксикатор на 3 часа; затем верхнюю часть каждой ампулы надпиливают и удаляют, во флаконах удаляют пробки. Вскрытые ампулы или флаконы с веществом взвешивают на аналитических весах, после чего содержимое емкостей удаляют, ампулы или флаконы моют дистиллированной водой и помещают в соответствующие ячейки коробки. Емкости выдерживают при 100-105 град. С в сушильном шкафу до постоянной массы и охлаждают в эксикаторе 30-40 мин. По разности масс ампулы или флакона с содержимым и без него находят массу вещества.

Для определения точности розлива рассчитывают коэффициент вариации V:

 

                               S х 100

                           V = -------

                                  Х

 

                             ---------------

                            /          _ 2

                           /  SUM (Х - Х)

                     S = \/   ------------

                                  n - 1

 

    где S - стандартное отклонение

    _

    Х - среднее арифметическое значение массы вещества в емкости

    Х - масса вещества в каждой емкости

    n - число емкостей

 

6.2. Колориметрический метод

 

Принцип метода заключается в определении содержания белка в каждой емкости и расчете коэффициента вариации.

Метод может быть применен при дозе препарата в ампуле 2-4 мг, содержащего не менее 25% белка.

Методика определения. Ампулы вскрывают, содержимое растворяют в 5 мг физиологического раствора рН 7,2. К 0,5 мл препарата (дозировка 2 мг) добавляют 0,5 мл физиологического раствора или к 0,2 мл препарата (дозировка 4 мг) добавляют 0,8 мл физиологического раствора и далее проводят анализ в соответствии со статьей "Определение белка по методу Лоури". Содержание белка в каждой из 10 взятых ампул определяют по калибровочной кривой. Коэффициент вариации вычисляют по формуле, как описано в методике 6.1.

    где Х  -  среднее  арифметическое  значение содержания белка в

              ампуле

        Х - количество белка в каждой ампуле.

 

7. Определение белкового азота с реактивом Несслера

 

Метод основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония (NН4+), образующимися после минерализации белковых продуктов.

 

7.1. Анализ препаратов с содержанием

белкового азота 0,01-0,40 мг/мл

 

Методика определения.

В центрифужную пробирку вносят калиброванной пипеткой необходимый объем (А) препарата и добавляют раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до конечной концентрации 10%, если нет других указаний. Пробы оставляют на 18-20 час при 4-8 град. Осадок отделяют центрифугированием при 2000 об/мин, если нет других указаний, при 5 град. в течение 30 минут, однократно промывают 1 мл 10% раствора ТХУ и вновь центрифугируют. К осадку добавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирки закрывают стеклянными колпачками. Пробы минерализуют на песочной бане. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. В качестве катализатора используют пергидроль, который периодически добавляют в предварительно охлажденные пробирки по 1-2 капли. Минерализацию продолжают до обесцвечивания содержимого всех пробирок, не менее 10 часов. Объем минерализата доводят водой до 10 мл и раствор тщательно перемешивают. Для колориметрирования отбирают необходимый объем (В) этого раствора, содержащий 10-20 мкг азота, доводят его водой до 9,5 мл, перемешивают, добавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Оптическую плотность раствора определяют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (лямбда = 400 +/- 5 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора, приготовленного аналогичным образом из контрольной пробы.

Содержание белкового азота в препарате (Х) в мг/мл вычисляют по формуле:

 

                        а х 10           а

                 Х = ------------ = -----------,

                     А х В х 1000   А х В х 100

 

где а - количество азота в мкг, рассчитанное по калибровочной кривой;

А - количество анализируемого препарата в мл;

В - количество раствора минерализата в мл, взятое для колориметрирования.

 

Калибровочная кривая. 0,2357 г химически чистого сульфата аммония, доведенного до постоянной массы в эксикаторе над безводным хлористым кальцием, растворяют в воде и общий объем доводят до 0,5 л. Основной раствор (0,1 мг азота в 1 мл) хранят в течение 6 месяцев при 4-8 град. Перед определением раствор разводят в 2 раза. К 0,1-0,5 мл этого раствора с интервалом в 0,1 мл добавляют воду до 9,5 мл и 0,5 мл реактива Несслера. Пробы колориметрируют, как описано выше, против контрольного раствора, содержащего 9,5 мл воды и 0,5 мл реактива Несслера. Калибровочную кривую воспроизводят при каждом анализе.

Примечание.

1. При составлении частных фармакопейных статей следует руководствоваться данными таблицы, в которой указаны оптимальные условия для выполнения методики в зависимости от концентрации белкового азота в анализируемом препарате.

 

содержание бел- кового азота в препарате	объем анали- зируемого   препарата	добавление ТХУ		объем минерализата на колориметрирова- ние
		объем	исходная кон- центрация
мг/мл	А мл	мл	%	В мл
0,010-0,016  0,016-0,030  0,030-0,050  0,050-0,080  0,080-0,200  0,200-0,400	5      3      3      2      1      1	0,72 0,43 0,43 2,00 1,00 1,00	80      80      80      20      20      20	2,0         2,0         1,0         1,0         1,0         0,5

 

2. Приготовление реактива Несслера. В мерную колбу емкостью 100 мл наливают воду до метки, в дальнейшем пользуются только этой водой. 10,0 г двуйодистой ртути (HgI2) растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством воды и переливают в склянку из темного стекла. Ступку споласкивают небольшим количеством воды и сливают в ту же емкость. Прибавляют 5,0 г иодида калия (KI). В оставшейся воде растворяют 20,0 г гидроокиси натрия и по охлаждении добавляют к ранее приготовленному раствору. В течение нескольких дней осаждается избыток ртутных солей. Прозрачную жидкость осторожно сливают с осадка в темную склянку. Реактив хранят в темном месте.

3. Приготовление 80% раствора ТХУ. 150 г ТХУ растворяют в 100 мл воды. 1,0 мл этого раствора титруют 1 н. раствором гидроокиси натрия с фенолфталеином. 1,0 мл 1 н. раствора NaOH соответствует 0,1634 г ТХУ. Рассчитывает процентную концентрацию ТХУ в анализируемом растворе и разводят его до концентрации 80%. Остальные растворы ТХУ готовят разведением 80% раствора.

 

7.2. Анализ препаратов с содержанием

белкового азота 0,5-2,5 мкг/мл

 

Методика определения.

В три центрифужные пробирки вносят по 5,0 мл препарата. К каждой пробе добавляют по 0,72 мл 80% раствора ТХУ, если нет других указаний. Белок осаждают и промывают, как указано в методике 7.1. К осадку медленно добавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты с помощью микропипетки на 0,2 мл с оттянутым концом. Далее проводят анализ, как в методике 7.1. Минерализацию продолжают до полного обесцвечивания содержимого пробирок (не менее 6 часов при двукратном добавлении катализатора). К минерализатам добавляют по 9,4 мл 0,37 н раствора гидроокиси натрия и тщательно перемешивают с помощью пастеровских пипеток, обработанных хромовой смесью. Затем, не вынимая пипеток, последовательно в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл реактива Несслера, перемешивают и немедленно колориметрируют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (лямбда = 400 +/- 5 нм) в кюветах с толщиной слоя 20 мм против контрольного раствора, приготовленного аналогичным образом из контрольной пробы.

Содержание белкового азота в мкг/мл (Х) вычисляют по формуле:

 

                        а х 0,862

                    Х = --------- = а х 0,1724

                           5,0

 

где а - количество азота в мкг, рассчитанное по калибровочной кривой;

0,862 - поправка к определенным концентрациям.

 

Калибровочная кривая. Перед определением основной раствор сульфата аммония (0,1 мг азота в 1 мл), полученный, как описано в методике 7.1., разводят в 5 раз водой. К 0,1-0,8 мл раствора с интервалом в 0,1 мл добавляют воду до 9,5 мл и 0,5 мл реактива Несслера. Пробы колориметрируют, как описано выше, против контрольного раствора, содержащего 9,5 мл воды и 0,5 мл реактива Несслера.

Примечание.

1. Приготовление 0,37 н. раствора гидроокиси натрия. 370 г гранулированной щелочи растворяют в воде и после охлаждения до комнатной температуры доводят общий объем раствора до 1 л. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр N 2 и хранят в склянке, закрытой пробкой с хлоркальциевой трубкой. Перед определением 20 мл этого раствора вносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки водой.

 

7.3. Анализ препаратов, содержащих белок с низкой

молекулярной массой

 

Методика определения (для препаратов с содержанием белкового азота 0,016-0,400 мг/мл).

В центрифужную пробирку вносят калиброванной пипеткой необходимый объем (А) препарата, доводят объем до 3 мл 0,9% раствором NaCl, добавляют 0,3 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК), 0,3 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают. Пробы оставляют на 18-20 час при 4-8 град. Осадок отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин при 5 град., промывают его смесью, состоящей из 1 мл воды, 0,1 мл концентрированной серной кислоты, 0,1 мл 20% ФВК и вновь центрифугируют в тех же условиях. К осадку добавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирки закрывают стеклянными колпачками и минерализуют на песочной бане. Одновременно в таких же условиях минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. В качестве катализатора используют пергидроль, периодически добавляя его по 1-2 капли в предварительно охлажденные пробирки. Сжигание продолжают до образования осадка желтого цвета (не менее 15 часов), добавляют 1-2 капли пергидроля и минерализуют еще 5-6 часов. Если цвет осадка не изменяется, то сжигание прекращают. Объем минерализата доводят водой до 10 мл, раствор тщательно перемешивают и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 мин при 5 град. Центрифугат сливают в пробирки, для колориметрирования отбирают необходимый объем (В) и проводят анализ, как описано в методике 7.1.

 

8. Определение аминного азота формольным титрованием

 

Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при рН=7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Методика определения. В стакан емкостью 50 мл наливают необходимый объем (А) анализируемого раствора препарата, содержащего 1,5-5 мг аминного азота, и доводят общий объем водой до 20 мл. Электроды потенциометра погружают в исследуемый раствор, рН которого доводят до 7,0 с помощью 0,1 н. раствора NaOH или 0,1 н. раствора HCl. Во время определения электроды должны все время оставаться погруженными в раствор. К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина (рН которого перед каждым определением доводят до 7,0 10% раствором NaOH), перемешивают и, не вынимая электродов, титруют содержимое 0,1 н. раствором едкого натрия до рН 9,1. При титровании следует использовать бюретку на 5 мл.

Содержание аминного азота в исследуемом препарате в % (Х) вычисляют по формуле:

 

                          V х К х 1,4 х 100

                      Х = -----------------,

                                  С

 

где V - количество 0,1 н. раствора NaOH в мл, пошедшее на титрование испытуемой пробы;

К - поправка к титру 0,1 н.раствора NaOH;

1,4 - количество аминного азота в мг, эквивалентное 1 мл 0,1 н. раствора NaOH;

С - анализируемая навеска сухого препарата в мг, содержащаяся в титруемом объеме А.

 

9. Определение общего азота с реактивом Несслера

 

Принцип метода аналогичен описанному в разделе 7.

Методика определения. В пробирку вносят калиброванной пипеткой 1 мл раствора препарата с содержанием общего азота 100-200 мкг и добавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирки закрывают стеклянными колпачками. Пробы минерализуют на песочной бане. Параллельно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Далее анализ проводят в соответствии с разделом 7.1.

Содержание общего азота (Х) в жидком препарате в мг/мл вычисляют по формуле раздела 7.1.; в сухом препарате в % - по формуле:

 

                        а х 10 х 100     а

                    Х = ------------ = -----,

                        В х С х 1000   В х С

 

где а - количество азота в мкг, рассчитанное по калибровочной кривой;

С - анализируемая навеска препарата в мг, содержащаяся в 1 мл раствора образца;

В - количество раствора минерализата в мл, взятое для колориметрирования

 

10. Определение белка с биуретовым реактивом

 

Метод основан на способности белка давать цветную реакцию с биуретовым реактивом. Метод рекомендован для определения белка в иммуноглобулинах и сыворотках.

Методика определения. 1 мл препарата разводят 0,9% раствором хлорида натрия в мерной колбе емкостью 50 мл. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 мл биуретового реактива. Одновременно к 5 мл рабочего стандартного раствора иммуноглобулина прибавляют 5 мл биуретового реактива. Параллельно готовят контрольную смесь, состоящую из 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 5 мл биуретового реактива. Все пробы оставляют на 30 минут и затем на фотоэлектроколориметре в кюветах с толщиной слоя 10 мм определяют с зеленым светофильтром (лямбда = 540 +/- 10 нм) оптическую плотность испытуемого и стандартного раствора по отношению к контрольной пробе.

Содержание белка определяют по пропорции путем сравнения оптической плотности испытуемого и стандартного растворов.

Приготовление рабочего стандартного раствора.

Рабочий стандартный раствор иммуноглобулина готовят в стерильных условиях путем разведения стандартного препарата иммуноглобулина в мерной колбе в 50 раз 0,9% стерильным раствором хлорида натрия. Содержание белка в стандартном препарате иммуноглобулина устанавливают колориметрическим способом с биуретовым реактивом по эталону белка Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. Рабочий стандартный раствор консервируют добавлением мертиолята 1:10000. Раствор пригоден к употреблению в течение месяца при температуре хранения 4-8 град.

Определение содержания белка в производственной стандартной серии препарата иммуноглобулина по эталону ГИСК.

Для определения содержания белка в стандартной серии иммуноглобулина используют 5 ампул раствора иммуноглобулина, предназначенного для стандарта, и 2 ампулы эталона белка, полученных из ГИСК. Из каждой ампулы берут пипеткой по 1 мл пробы и разводят 0,9% раствором хлористого натрия в мерной колбе емкостью 50 мл. Из каждого разведения стандартного раствора и эталона белка отбирают параллельные пробы (четыре) объемом 5 мл и прибавляют по 5 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают. Контролем служит смесь, состоящая из 5 мл физиологического раствора и 5 мл биуретового реактива. Все пробы колориметрируют через 30 минут, как указано выше.

Замеры оптической плотности проводят трижды и рассчитывают средний показатель. Отклонение показателей оптической плотности параллельных проб должно быть в пределах +/- 2,5% от среднего значения показателей. Если отклонение не соответствует 2,5%, то производят повторное определение из тех же разведений в количестве 5 параллельных проб. При значительных отклонениях цифровых значений в параллельных пробах следует весь анализ производить заново, используя для этого новые ампулы эталона белка и стандартной серии иммуноглобулина.

Примечание.

Приготовление биуретового реактива.

Растворяют 90 г натрия-калия тартрата в 400 мл 0,2 н. раствора едкого натрия, прибавляют 10 г CuSO4 х 5H2O, после растворения добавляют 10 г йодида калия и доводят объем раствора 0,2 н. раствором едкого натрия до 2 л.

 

11. Определение пептидов с биуретовым реактивом

 

Принцип метода аналогичен описанному в разделе 10. Метод рекомендован для определения пептидов в сухих белковых гидролизатах и питательных средах.

Методика определения.

1 г препарата растворяют в 0,9% растворе хлорида натрия в мерной колбе емкостью 50 мл. К 5 мл полученного раствора прибавляют 0,5 мл 10% раствора едкого натрия и 0,5 мл биуретового реактива. Параллельно готовят контрольную смесь, состоящую из 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,5 мл 10% раствора едкого натрия и 0,5 мл биуретового реактива. Пробы колориметрируют сразу после добавления реактивов на фотоэлектроколориметре в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Определяют с зеленым светофильтром (лямбда = 540 +/- 10 нм) оптическую плотность испытуемого раствора по отношению к контрольной пробе.

Содержание пептидов определяют по калибровочной кривой. Методика может быть применена для образцов, в которых показатель оптической плотности не превышает 0,2 при определении на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против воды.

Приготовление стандартного раствора пептона.

1 г пептона-реактива (ТУ 42.14 N 160-79) растворяют в 0,9% раствора хлорида натрия в мерной колбе емкостью 100 мл. Стандартный раствор консервируют добавлением мертиолята 1:10000. Раствор пригоден в течение месяца при температуре хранения 4-8 град.

Калибровочная кривая.

Из стандартного раствора готовят ряд разведений с содержанием пептона от 0,1% до 0,5% в 0,9% растворе хлорида натрия с интервалом 0,1%. К 5 мл каждого разведения прибавляют 0,5 мл 10% раствора едкого натрия и 0,5 мл биуретового реактива. Параллельно готовят контрольную пробу, состоящую из 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,5 мл 10% раствора едкого натрия и 0,5 мл биуретового реактива. Пробы колориметрируют сразу после добавления реактивов на фотоэлектроколориметре в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Определяют с зеленым светофильтром (Л = 540 +/- 10 нм) оптическую плотность испытуемого раствора по отношению к контрольной пробе.

Примечание.

Приготовление биуретового реактива. Растворяют 1 г CuSO4 х 5 Н2О в 5 мл воды, прибавляют 4,5 г натрия-калия тартрата, предварительно растворенного в 40 мл воды, объем раствора доводят водой до 50 мл. Раствор годен к употреблению в течение 8-10 часов.

 

12. Определение белка по методу Лоури

 

Метод основан на свойстве циклических аминокислот и пептидных связей давать цветную реакцию с реактивом Фолина. Метод рекомендован для определения белка в химических вакцинах.

Методика определения. К 1 мл исследуемого раствора (80-240 мкг белка) добавляют 5 мл реактива С, если нет других указаний. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Затем добавляют 0,5 мл реактива Фолина и пробы оставляют на 30 мин для развития окраски. Оптическую плотность определяют на фотоэлектроколориметре при длине волны 597 +/- 10 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм против контрольного раствора (1 мл растворителя, 5 мл реактива С, 0,5 мл реактива Фолина). Концентрацию белка в препарате рассчитывают по калибровочной кривой.

Калибровочная кривая. Стандартный раствор альбумина готовят по точной навеске бычьего альбумина, содержание белка в котором предварительно определяют по белковому азоту с реактивом Несслера. 20 мг альбумина растворяют в воде и объем доводят до 50 мл (400 мкг/мл).

К 0,1-0,7 мл этого раствора (40-280 мкг белка) с интервалом 0,1 мл добавляют воду соответственно до 1 мл и далее анализ проводят, как указано выше.

Примечание.

1. Приготовление реактива Фолина.

В круглодонную колбу емкостью 1 литр наливают 350 мл дистиллированной воды, добавляют 50 г вольфрамата натрия (Na2WoO4 х 2Н2О) и 12,5 г молибдата натрия (Na2MoO4 х 2Н2О), перемешивают до полного растворения. К полученному раствору приливают 25 мл 85% ортофосфорной кислоты, 50 мл концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят с обратным холодильником 10 часов. Затем в остывшую смесь добавляют 75 г сернокислого лития, 25 мл воды и 3 капли бромной воды. Кипятят (без холодильника) в течение 15 мин для удаления избытка брома. Охлаждают до 18-20 град. и объем доводят водой до 500 мл. Перемешивают и фильтруют через стеклянный фильтр N 1. Из фильтрата отбирают 1 мл, разводят в 50 раз водой и титруют 0,1 н. раствором NaOH с индикатором фенолфталеином. Перед употреблением реактив Фолина разводят дистиллированной водой до концентрации кислоты 1 н.

2. Приготовление реактива А. 2 г карбоната натрия (Na2CO3) растворяют в 0,1 н. растворе едкого натрия и объем доводят до 100 мл.

3. Приготовление реактива В. 0,5 г сульфата меди (CuSO4 х 5H2O) растворяют в 1% растворе тартрата калия-натрия (KNaC4H4O6) и доводят объем до 100 мл.

4. Приготовление реактива С. Перед анализом смешивают 50 мл реактива А с 1 мл реактива В.

 

13. Определение сахаров

 

Методы основаны на способности углеводов давать цветную реакцию с антроновым и тимоловым реактивами. Методы рекомендованы для химических вакцин.

 

13.1. Метод с антроновым реактивом

 

К 1 мл раствора препарата, содержащего 10-50 мкг сахаров, предварительно охлажденного в бане со льдом, по стенке пробирки осторожно приливают 2 мл свежеприготовленного раствора антрона (0,20% раствор антрона в концентрированной х.ч. серной кислоте уд. массы 1.84). Смесь хорошо перемешивают и нагревают в кипящей водяной бане в течение 16 мин, после чего снова охлаждают.

Оптическую плотность определяют на спектрофотометре при длине волны 625 нм против контрольной пробы, содержащей 2 мл антронового реактива и 1 мл растворителя, взятого для приготовления исследуемого препарата.

По калибровочной кривой находят содержание сахаров в препарате.

Калибровочная кривая. 10 мг чистой для анализа глюкозы растворяют в 100 мл воды (0,01% раствор). К 0,1-0,5 мл этого раствора (10-50 мкг глюкозы) с интервалом 0,1 мл добавляют воду соответственно до 1 мл. Пробы спектрофотометрируют, как описано выше, против контрольного раствора, содержащего 1 мл воды и 2 мл антронового реактива.

Калибровочную кривую строят при каждом определении.

 

13.2. Метод с тимоловым реактивом

 

К 1 мл раствора препарата, содержащего 40-80 мкг сахаров, предварительно охлажденного в бане со льдом, по стенке пробирки осторожно приливают 3 мл свежеприготовленного раствора тимола (0,25% раствор тимола в концентрированной х.ч. серной кислоте уд. массы 1,84). Смесь хорошо перемешивают и нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин, после чего охлаждают.

Оптическую плотность определяют на спектрофотометре при длине волны 509 нм против контрольной пробы, содержащей 3 мл реактива тимола и 1 мл растворителя, взятого для приготовления исследуемого препарата.

По калибровочной кривой находят содержание сахаров в препарате.

Калибровочная кривая. Из 0,01% раствора глюкозы готовят разведения с интервалом 10 мкг от 10 до 100 мкг/мл глюкозы (см. п. 13.1.). Пробы спектрофотометрируют против контрольного раствора, содержащего 1 мл воды и 3 мл реактива тимола.

 

14. Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина

 

Метод основан на измерении разности экстинкций хлорных гидролизаторов, характеризующей содержание фосфора нуклеиновых кислот.

Метод рекомендован для химических вакцин.

Методика определения. К 1 мл раствора препарата прибавляют 5 мл 0,5 н.раствора хлорной кислоты. Смесь нагревают в кипящей водяной бане 20 минут. После охлаждения пробы центрифугируют при 2000 об/мин при 5 град. 20 минут. Надосадочную жидкость анализируют на спектрофотометре при двух длинах волн 270 нм и 290 нм против контроля, которым служит 0,5 н. хлорная кислота. Содержание нуклеиновых кислот в мкг/мл (Х) вычисляют по формуле:

 

                      Е 270 - Е 290

                  Х = ------------- x 6,0 x 10,3

                           0,19

 

где Е 270 и Е 290 - величины оптической плотности при соответствующей длине волны;

0,19 - удельная экстинкция;

10,3 - коэффициент пересчета на нуклеиновые кислоты;

6,0 - разведение препарата.

 

15. Определение электрофоретической однородности

методом бумажного электрофореза

 

Чистоту препаратов определяют методом электрофореза на бумаге. Метод основан на том, что молекулы белка, содержащие как основные, так и кислые группы, перемещаются в электрическом поле с различной скоростью в зависимости от соотношения этих групп, рН и ионной силы буферного раствора.

Методика определения. Электрофоретическое разделение проводят в веронал-мединаловом буферном растворе рН 8,6 ионной силы 0,05, при градиенте потенциала от 3 до 8 вольт на 1 см длины бумажной полосы. Сила тока не должна превышать 0,3 ма на каждый сантиметр ширины бумажной полосы, т.е. не более 1,2 ма на полосу шириной 4 см.

После того, как бумажные полосы в приборе пропитаются буферным раствором, препарат наносят со стороны катода в виде узкой полосы в количестве 0,01 мл, одновременно для идентификации фракций наносят плацентарную или донорскую сыворотку в количестве 0,02 мл. Препарат наносят микропипеткой на отшлифованную грань предметного стекла, которую затем прикладывают к поверхности бумаги и придерживают несколько секунд, пока препарат не впитается в бумагу.

Электрофорез проводят при комнатной температуре (18-20 град.) в течение 18 часов. После окончания электрофореза бумажные полосы помещают в горизонтальном положении в сушильный шкаф на 20 минут при 100 град.

Окраска электрофореграмм проводится в течение 20 минут при погружении полосы в раствор красителя. Краситель, не связавшийся с белком, отмывают 3-4 раза по 20 минут 20% раствором уксусной кислоты.

В случае электрофоретической неоднородности препарата проводят количественное определение примесей с помощью фотоэлектроколориметра. Для этого с двух параллельных электрофореграмм вырезают полоски бумаг, содержащие фракции. Одинаковые фракции с двух параллельных электрофореграмм помещают в одну пробирку и элюируют примеси 6 мл 0,1 н. раствора едкого натрия, основную фракцию - 30 мл 0,1 н. раствора едкого натрия. Продолжительность элюции 30 минут. После центрифугирования (2000 об/мин в течение 10 мин) проводят измерение оптической плотности элюатов на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (лямбда = 597 +/- 10 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм против элюатов с контрольного (неокрашенного) участка электрофореграмм. При наличии примеси порядка 3% экстинкция элюата соответствует области не ниже 0,1 (ФЭК-56М). По полученным данным подсчитывается содержание фракций в препарате. При этом учитывается разведение фракции. Значение экстинкции основной фракции умножают на 5. Сумму экстинкций всех фракций принимают за 100% и вычисляют процент содержания примеси.

Примечание.

1. Приготовление веронал-мединалового буферного раствора рН 8,6. В 300 мл дистиллированной воды растворяют 10,32 г мединала, добавляют 1,84 г веронала и, помешивая, нагревают колбу с содержимым на водяной бане (60-80 град.) до растворения веронала. Раствор охлаждают до комнатной температуры. Затем объем раствора доводят до 1 л водой.

2. Приготовление красителя.

К 0,2 г амидо-черного 10Б добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты и 900 мл этилового спирта.

3. Приготовление раствора для отмывания электрофореграмм. 200 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 1 л водой.

4. Рекомендуется бумага для хроматографии марки М, разрезанная на полосы шириной 4 см и длиной 40-44 см.

 

16. Определение антигенного состава белковых препаратов

методом иммуноэлектрофореза

 

Метод основан на проведении электрофореза в агаровом геле с последующим анализом полученных фракций на той же пластинке методом двойной диффузии. Антисыворотку вносят в траншею, расположенную параллельно направлению электрофоретического разделения белковых фракций. При встрече антигена с антителом образуются линии преципитации. По количеству этих линий преципитации судят о чистоте препарата.

Метод определения.

На стеклянную пластинку (размер 9 х 12 см) наливают расплавленный агар в концентрации 1,25% (количество агара должно быть рассчитано заранее в зависимости от числа пластинок, чтобы получился слой толщиной 2-3 мм). После застывания агара вырезают лунки, используя для этого специальный штамп (схема со всеми размерами представлена на рис. 1).

Препараты вносят в лунки при помощи тонко оттянутого капилляра. В одну из лунок вносят нормальную сыворотку, в другую - краситель - пиронин (для контроля продвижения фракций). Пластинку помещают в аппарат для электрофореза на 3,5 часа (при градиенте потенциала 3-6 в/см, 110-150 в на 2 пластинки).

После проведения электрофореза в траншею вносят антисыворотку, преципитирующую сывороточные белки. Пластинку помещают во влажную камеру. Учет результатов проводят через 48 часов в сравнении с контрольной сывороткой.

Примечание.

1. Приготовление агарового геля (агар ГОСТ 17206-71). 25 г сухого агара помещают в стакан емкостью 800 мл и промывают водой, измельчают и переносят в колбу, наливают 400 мл воды, нагревают на кипящей водяной бане. Расплавленный агар фильтруют через 2-3 слоя марли, выливают в стакан и после застывания разрезают на маленькие кубики, которые промывают в течение 6 дней дистиллированной водой. Воду меняют 2 раза в день. Если водопроводная вода слабо минерализована, то процесс можно сократить: агаровые кубики сначала моют 2 дня в проточной водопроводной воде и затем 2 дня в дистиллированной, после чего агар становиться белым. После определения сухой массы промытого агара (высушиванием до постоянной массы при 105 град.) к нему добавляют дистиллированную воду из такого расчета, чтобы получить конечную концентрацию 2,5%; агар расплавляют и добавляют равный объем веронал-мединалового буферного раствора рН 8,2, ионной силы 0,05 (в 4,3 л воды растворяют 47,3 г мединала и 69 мл 1 н. соляной кислоты). Полученный раствор фильтруют горячим через марлю (2-3 слоя). Затем добавляют мертиолят 1:10000.

Агар разливают во флаконы по 40-50 мл (количество необходимое для разового пользования, т.к. повторное нагревание не желательно). Расплавленный агар должен быть прозрачным.

2. Обработка стеклянных пластинок.

Используют стекло без дефектов (лучше фотопластинки размером 9 х 12 см). Пластинки после снятия эмульсии помещают в хромовую смесь (5 г K2Cr2O7 растворяют в 100 мл концентрированной H2SO4). После чего пластинки тщательно промывают водопроводной водой, затем дистиллированной, высушивают в сушильном шкафу. Чтобы агар лучше пристал к стеклу, на поверхность стекла помещают несколько капель агара и растирают их тонким слоем пипеткой; пластинки высушивают при 80 град.

3. Приготовление пластинок со слоем агара.

Стекла помещают на горизонтальную поверхность. Для получения слоя одинаковой толщины можно использовать настольное стекло, установленное по уровню или же фиксированную фотографическую кювету, в которую предварительно наливают расплавленный агар. Размер кюветы зависит от числа приготавливаемых пластинок. На застывший агар помещают пластинки и наливают горячий агар, смешанный с буферным раствором в равных объемах (осторожно без образования пузырьков воздуха).

После застывания агара гель вокруг пластинок обрезают скальпелем и стекла с агаром вынимают из кюветы. На пластинке с гелем вырезают лунки для анализируемых проб, а после проведения электрофореза - траншеи для преципитирующей иммунной сыворотки.

Лунки вырезают поперечно срезанным концом пастеровской пипетки, траншеи - специальным резцом, смонтированным из 2-х параллельно закрепленных на определенном расстоянии лезвий. Лунки и траншеи можно вырезать, положив пластинку на бумагу с ненанесенным рисунком или используют специальный штамп (коробочка со съемной металлической крышкой, на которой вырезаны траншеи и лунки).

4. Условия проведения электрофореза.

Пластинки с гелем помещают в аппарат для электрофореза. В электродные камеры наливают буферный раствор - мединал-вероналовый, рН 8,2, ионная сила 0,05 (приготовление буферного раствора описано в п. 1.). Пластинки помещают в аппарат и соединяют с помощью полосок хроматографической фильтровальной бумаги (12 х 3 см, бумага сложена в 5-6 слоев), смоченной буферным раствором. На оба конца пластинок помещают полоски хроматографической бумаги (5-6 слоев), которые соединяются с электродными камерами.

Прибор накрывают крышкой и проводят электрофорез при градиенте потенциала от 3 до 6 в на см длины при температуре 18-20 град. в течение 3,5 часов (при расчете учитывают длину пластинок и полос фильтровальной бумаги). Пластинку после добавления антисыворотки помещают во влажную камеру при комнатной температуре. Для того, чтобы не развивалась плесень в агаре, ставят в камеру бюкс с водой (5-10 мл), куда добавляют небольшое количество (несколько кристалликов) фенола. Результаты отмечают через 48 часов.

5. Отмывка пластинки

Пластинку с гелем погружают в кювету с 0,9% раствором хлорида натрия и отмывают в течение 2-3-х дней от белка, не принявшего участие в образовании преципитата. Раствор меняют 3-4 раза в день. В раствор 0,9% хлорида натрия добавляют мертиолят (1:10000).

6. Высушивание пластинки

Для равномерного высушивания пластинки с гелем накрывают фильтровальной бумагой, бумагу над лунками и траншеями прокалывают иголкой. Пластинки высушивают на воздухе. Чтобы ускорить процесс высушивания, можно использовать вентилятор. После высушивания пластинки бумагу смачивают водой и удаляют.

7. Окрашивание белков

Пластинки с высушенным гелем выдерживают в течение 2-х часов в растворе красителя следующего состава:

амидочерный 10Б - 1 г;

0,1 М раствор уксусной кислоты - 450 мл;

0,1 М раствор ацетата натрия - 450 мл;

Глицерин - 100 мл

Избыток красителя отмывают 2% раствором уксусной кислоты. Результаты регистрируют при помощи зарисовки или получения фотографического снимка. Глицерин, входящий в раствор, обеспечивает отделение агарной пленки от стекла и хранение ее в течение неограниченного времени.

Рис. 1. Схема размера пластинки

 

       ┌───────────────────────────────────────────┐

       │  ┌─────────────────────────────────────┐  │

       │  └─────────────────────────────────────┘  │

       │                    ┌─┐                    │

       │                    └─┘                    │   │

       │  ┌─────────────────────────────────────┬──┼───┴─

       │  └─────────────────────────────────────┴──┼───┬─ 2 мм

       │                    ┌─┐                    │   │

       │                    └─┘                    │

       │  ┌─────────────────────────────────────┐  │

       │  └─────────────────────────────────────┘  │   │

       │                    ┌─┬────────────────────┼───┴─

       │                    └─┴────────────────────┼───┬─ 2 мм

       │  ┌─────────────────────────────────────┐  │   │

       │  └─────────────────────────────────────┘  │

       │                    ┌─┐                    │

       │                    └─┘                    │

       │  ┌─────────────────────────────────────┐  │

       │  └─────────────────────────────────────┘  │

       │                    ┌─┐                    │

       │                    └┼┘5 мм                │

       │  ┌──────────────────┴──────────────────┐  │

       │  └─────────────────────────────────────┘  │

       │                    ┌─┐                    │

       │                    └─┘                    │

       │  ┌─────────────────────────────────────┐  │

       │  ├─────────────────────────────────────┤  │

       └──┼─────────────────────────────────────┼──┘

          │                                     │

          ├<-------------- 80 мм -------------->┤

 

17. Определение прозрачности и цветности

 

Метод основан на измерении оптической плотности раствора в видимой области спектра при разных длинах волн: при определении цветности длина волны - 400 +/- 5 нм (максимум поглощения гемоглобина); при определении прозрачности длина волны - 540 +/- 10 нм (максимум поглощения для мутных растворов). Метод рекомендован для препаратов иммуноглобулинов.

Методика определения. В кювету с толщиной слоя 3 мм наливают раствор и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при указанных длинах волн. Измерение каждой пробы при данной длине волны проводят трижды и вычисляют среднее значение показателя.

Препарат считают бесцветным, если при длине волны 400 +/- 5 нм его оптическая плотность не превышает 0,10; соломенно-желтым - если оптическая плотность раствора в пределах 0,1-0,15.

Препарат считают прозрачным, если при длине волны 540 +/- 10 нм его оптическая плотность не превышает 0,03; слабо-опалесцирующим - если оптическая плотность составляет 0,03-0,05.

 

18. Определение остаточного спирта

 

Метод основан на окислении спирта бихроматом калия.

Предварительно проводят суховоздушную перегонку спирта из препарата в чашках Конвея при 80 град.

Методика определения. В наружные отделения 4-х чашек Конвея вносят по 15 мл окислительной смеси. Во внутренние отделения 2-х чашек приливают по 0,5 мл препарата, разведенного в 100 раз физиологическим раствором (в мерной колбе), в две другие - по 0,5 мл физиологического раствора (контрольные пробы). Чашки закрывают пришлифованными стеклами, на которые ставят груз (100-200 г), помещают в термостат при температуре 80 град.; выдерживают в течение 2-х часов. После чего осторожно окислительную смесь из наружного отделения чашки переносят пипеткой в колбу с притертой пробкой. Наружное отделение трижды промывают водой по 15 мл. В колбу добавляют по 1 мл 10% раствора иодистого калия и через 1-2 минуты выделившийся иод титруют 0,01 н. раствором тиосульфата натрия. В качестве индикатора используют 0,5% раствор крахмала. Индикатор в количестве 3-5 капель добавляют перед концом титрования, когда раствор имеет соломенно-желтое окрашивание. После добавления раствора крахмала проба приобретает синее окрашивание. Титрование проводят до обесцвечивания.

Содержание спирта в % (Х) вычисляют по формуле:

 

    (а - б) х К х 0,000115 х 100 х 1,1 х 100

Х = ----------------------------------------- = (а - б) х К х 2,53

                    1 х 0,5

 

где а - количество 0,01 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование в контрольном опыте, мл;

б - количество 0,01 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование испытуемого препарата, мл;

0,000115 - количество спирта, соответствующее 1 мл 0,01 н. раствора тиосульфата натрия, г;

К - поправка к титру тиосульфата натрия;

1,1 - коэффициент пересчета

Примечание.

Приготовление окислительной смеси.

Окислительная смесь состоит из 2-х объемов 0,01 н. раствора бихромата калия и 1 объема концентрированной серной кислоты.

 

19. Определение окиси алюминия в сорбированных

препаратах и сорбенте

 

Метод основан на образовании комплекса двузамещенной натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с ионами алюминия и последующем обратном титровании избытка ЭДТА.

Методика определения. В колбу из огнеупорного стекла вносят 1 мл препарата, содержащего не более 5 мг/мл Al2O3, и 2 мл 10% раствора серной кислоты. Смесь нагревают и при слабом кипении доводят до полного растворения осадка. Раствор охлаждают и добавляют ацетатный буфер (-10 мл) до рН 4,5 и 10 мл 0,01 М раствора ЭДТА. Смесь доводят до кипения. После охлаждения добавляют 30 мл этилового спирта и 1 мл дитизона. Титруют 0,01 М раствором сернокислого спирта и 1 мл дитизона. Титруют 0,01 М раствором сернокислого цинка до перехода окраски от зеленой к красной. В тех же условиях проводят титрование контрольной пробы.

Содержание окиси алюминия в мг/мл (Х) вычисляют по формуле:

 

                    Х = К х (V - Vo) х 0,5098

 

где К - поправочный коэффициент к титру 0,01 М раствора сернокислого цинка;

V - количество 0,01 М раствора сернокислого цинка, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл;

Vo - количество 0,01 М раствора сернокислого цинка, пошедшее на титрование испытуемой пробы, мл;

0,5098 - количество окиси алюминия в мг, соответствующее 1 мл 0,01 М раствора ЭДТА.

Примечание.

1. Приготовление аммиачного буферного раствора рН 10.

20 г хлористого аммония растворяют в 200-300 мл воды, приливают 100 мл концентрированного аммиака и доводят объем водой до 1 л.

2. Приготовление ацетатного буферного раствора рН 4,5.

60 мл ледяной уксусной кислоты и 77 г ацетата аммония растворяют в 940 мл воды.

3. Приготовление раствора дитизона.

25 мг реактива растворяют в 100 мл ацетона. Раствор хранят при температуре 4-8 град. Реактив годен к употреблению при зеленой окраске раствора.

4. Приготовление 0,01 М раствора сернокислого цинка.

Раствор готовят из фиксанала. Полученный из фиксанала 0,1 н. (0,05М) раствор сернокислого цинка разводят в 5 раз.

При отсутствии фиксанала 2,870 г ZnSO4 х 7H2O растворяют в воде и объем доводят до 1 л. Титр раствора устанавливают по титрованному раствору ЭДТА.

К 25 мл 0,01М раствора ЭДТА приливают 10 мл ацетатного буферного раствора, 50 мл этилового спирта и 1 мл дитизона. Смесь титруют испытуемым раствором сернокислого цинка до перехода окраски в красную. Рассчитывают поправочный коэффициент.

5. Приготовление 0,01 М раствора ЭДТА.

Раствор готовят из фиксанала. При отсутствии его 3,7225 г ЭДТА растворяют в воде и объем доводят до 1 л. Титр раствора устанавливают по фиксаналу сернокислого магния (цинка).

К 20 мл 0,01 М раствора сернокислой соли приливают 5 мл аммиачного буферного раствора и добавляют 0,2 г индикатора хромоген-черного (1 г индикатора растирают со 100 г хлористого натрия). Смесь доводят до 100 мл водой, нагревают до кипения, охлаждают и титруют испытуемым раствором ЭДТА до перехода окраски от красной в синюю.

 

20. Определение хлорида натрия в присутствии белка

 

Метод основан на аргентометрическом определении ионов хлора. Белок, содержащийся в растворе, предварительно окисляют перманганатом калия в кислой среде.

    Методика определения.  К необходимому объему (А)  исследуемого

раствора  с  содержанием  0,5-2,5 мг  NaCl,  помещенному  в  колбу

объемом 50 мл, добавляют 5 мл 0,01 н. раствора нитрата серебра и 1

мл  концентрированной  азотной  кислоты,  нагревают  осторожно  на

асбестовой сетке до кипения  и  прибавляют  по  каплям  насыщенный

раствор    перманганата   калия   до   неисчезающего   фиолетового

окрашивания.  Кипячение  продолжают  5   минут,   после   чего   к

окрашенному   раствору   прибавляют   немного  (на  кончике  ножа)

безводной глюкозы до бледно-розового окрашивания,  не  исчезающего

в течение 5  минут.  По  охлаждении  жидкости  прибавляют  0,5  мл

                                                            +

раствора железоаммонийных квасцов и титруют избыток ионов Ag  0,01

н.  раствором  роданида  аммония  до  розового  окрашивания.   При

титровании  следует пользоваться бюреткой на 5,0 мл.  Одновременно

ставится контрольный опыт.

Содержание хлорида натрия в исследуемом образце в % (Х) вычисляется по формуле:

 

                    (V1 - V2) х К х 0,585 х 100

                Х = ----------------------------,

                                  С

 

где V1 - количество 0,01 н. раствора роданида аммония, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл;

V2 - количество 0,01 н. раствора роданида аммония, пошедшее на титрование испытуемой пробы, мл;

К - поправка к титру 0,01 н. раствора роданида аммония,

0,585 - количество хлорида натрия, соответствующее 1 мл 0,01 н. раствора роданида аммония, мг;

С - анализируемая навеска препарата в объеме А; мг.

Примечание.

1. Приготовление индикатора - насыщенного раствора железоаммонийных квасцов (40%).

Водный насыщенный на холоду раствор железоаммонийных квасцов фильтруют через складчатый фильтр и к мутному раствору прибавляют по каплям концентрированную азотную кислоту до просветления раствора (большого избытка азотной кислоты следует избегать!).

2. Приготовление насыщенного раствора калия марганцевокислого. К 9 г калия марганцевокислого добавляют 100 мл горячей воды (60-80 град.), перемешивают и оставляют на 1 час, после чего раствор осторожно сливают в склянку из темного стекла с притертой пробкой, хранят в прохладном месте.

 

21. Определение сульфат-ионов

 

Метод основан на реакции между растворами сульфатов и растворами бария с образованием осадка или появлением опалесценции (в зависимости от концентрации сульфат-ионов).

 

21.1. Анализ препаратов с содержанием

сульфат-ионов 50,0-500,0 мкг/мл

 

Методика определения. К 1 мл препарата (при анализе сорбированных анатоксинов используют центрифугат препарата) прибавляют 3,5 мл воды, 0,5 мл 5% раствора хлорида бария и перемешивают. Через 15 минут измеряют оптическую плотность суспензии на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (максимум пропускания светофильтра в области 540 +/- 10 нм) в кюветах с толщиной слоя 5 мм против контрольного раствора (1 мл препарата и 4 мл воды, если нет других указаний). Расчет содержания сульфат-ионов производят по калибровочной кривой.

Калибровочная кривая. 1,8140 г сернокислого калия, высушенного до постоянной массы при 100 град., растворяют в воде и объем доводят до 1 л. Полученный основной раствор (1 мг/мл сульфат-ионов) разводят в 10 раз.

К 0,5-5,0 мл этого раствора (50-500 мкг) с интервалом 0,5 мл прибавляют реактивы и проводят анализ, как указано выше. По показаниям прибора строят график зависимости оптической плотности от концентрации сульфат-ионов. Калибровочную кривую периодически проверяют.

 

21.2. Анализ препаратов с содержанием

сульфат-ионов менее 50,0 мкг/мл

 

Методика определения. К 10 мл препарата прибавляют 1 мл 5% раствора хлорида бария. Одновременно добавляют реактив в 10 мл пробы, которой служит эталонный раствор сульфат-ионов, содержащий 20 мкг/мл (основной раствор, разведенный в 50 раз). Сравнивают оптическую плотность испытуемой пробы и эталонного раствора при зеленом светофильтре (максимум пропускания светофильтра в области 540 +/- 10 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм на фотоэлектроколориметре против контрольных растворов: 10 мл препарата и 1 мл воды - для испытуемой пробы, 10 мл воды - для эталонного раствора.

Расчет содержания сульфат-ионов производят по пропорции.

 

22. Определение ионов аммония

в сорбированных препаратах и сорбенте

 

Метод основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония.

Методика определения. К 1 мл центрифугата препарата прибавляют 8,8 мл воды, 0,2 мл реактива Несслера и перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (максимум пропускания светофильтра в области 400 +/- 5 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора (1 мл препарата и 9 мл воды, если нет других указаний). Расчет содержания ионов аммония производят по калибровочной кривой.

Калибровочная кривая. 0,6280 г хлорида аммония, высушенного до постоянной массы над хлористым кальцием, растворяют в воде и объем доводят до 1 л. Основной раствор разводят в 100 раз (2 мкг/мл ионов аммония).

К 2,5-7,5 мл этого раствора (5,0-15,0 мкг) с интервалом 1,0 мл прибавляют реактивы и проводят анализ, как указано выше. По показаниям прибора строят график зависимости оптической плотности от концентрации ионов аммония. Калибровочную кривую периодически проверяют.

 

23. Определение фотометрического показателя

дисперсности в сорбированных препаратах и в сорбенте

 

Метод основан на зависимости оптической плотности суспензии от величины частиц и заключается в определении оптической плотности при разных длинах волн с последующим вычислением показателя дисперсности. Установлена корреляция между средней величиной частиц и величиной, обратной показателю дисперсности.

Методика определения. Непосредственно после перемешивания суспензии измеряют оптическую плотность препарата на фотоэлектроколориметре при избранных двух длинах волн в пределах видимого спектра (лямбда = 400 +/- 5 нм и лямбда = 630 +/- 10 нм). Выбранные длины волн должны быть постоянными. Измерение производят при использовании кювет с любой толщиной слоя таким образом, чтобы показания прибора находились в пределах 0,2-0,6 шкалы оптической плотности. При смене длины волны возможно использование кювет с разной толщиной слоя. В этом случае показание прибора, полученное при применении меньшей кюветы, должно быть увеличено во столько раз, во сколько различается толщина слоя кювет.

Фотометрический показатель дисперсности (У) определяют по формуле:

 

                                 Д1

                         У = lg ---- : К

                                 Д2

 

где Д1 и Д2 - величины оптической плотности при соответствующих длинах волн лямбда1 и лямбда2;

К - константа, рассчитанная для каждого типа прибора по формуле:

 

                                лямбда2

                         К = lg -------,

                                лямбда1

 

где лямбда1 и лямбда2 - длины волн в нм (соответствующие максимумам пропускания используемых светофильтров).

 

III. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРОГЕННОСТИ

 

Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола весом 1,5-2,5 кг, содержащихся на полноценном рационе. Кроликов отбирают за 5 дней до опыта. Каждого кролика содержат в отдельной клетке в помещении с постоянной температурой (допустимые отклонения +/- 3 град.С). При уборке клеток и взвешивании животных их оберегают от возбуждения (избегать шума, стука, резких движений).

Взвешивание кроликов производят через день до дачи корма, всего не менее 3 раз. В течение срока, предшествующего опыту, кролики не должны терять в весе. Животные, теряющие в весе, к опыту не пригодны. В течение 3 суток перед испытанием у каждого подопытного кролика измеряют температуру. Измерения производят ежедневно утром, до дачи корма, при помощи медицинского термометра или электротермометра, точность которого не должна уступать точности медицинского термометра. Температурные щупальцы электротермометра или ртутные термометры вводят ректально за внутренний сфинктр на глубину около 5 см на время, необходимое для достижения максимальной температуры, но не менее чем на 5 минут. Измерение температуры следует проводить не ранее чем через 1 час после фиксирования кроликов. Исходная температура подопытных кроликов должна быть в пределах 38,5 град. - 39,5 град. С. Животные с более высокой или более низкой температурой для опыта непригодны.

За 24 часа до опыта кроликов переводят в помещение, в котором производят испытание на апирогенность. Определение должно проводиться в отдельной комнате с постоянной температурой 18-22 град. С, изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером, накануне опыта у животных отбирают остаток корма. До опыта и во время опыта животные корма не получают (воду до опыта дают без ограничения). Испытуемый препарат проверяют на 3 кроликах. Перед инъекцией испытуемого раствора температура кроликов измеряется не менее 2 раз с промежутками в 30 минут. Разница между результатами обоих измерений не должна превышать 0,2 град. С. Средняя величина обоих измерений считается нормальной температурой и берется в основу определения повышения температуры.

Стерильный испытуемый препарат медленно вводят кроликам в ушную вену стерильным шприцом и иглой. Для каждого кролика берут отдельную иглу. Препарат вводят подогретым до 37 град. С не более чем через 30 минут после измерения исходной температуры. После введения препарата температуру измеряют 3 раза с промежутками 1 час.

Объем вводимого препарата и критерии оценки результатов испытания должны быть указаны в фармакопейных статьях на каждый испытуемый препарат.

Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для определения пирогенности повторно (но не более 3-х раз) с интервалами 2-3 дня, если ранее введенный им препарат был апирогенным. Если введенный в первый раз препарат оказался пирогенным, кролики не могут быть использованы повторно.

 

IV. МЕТОДИКА КОНТРОЛЯ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН НА ОТСУТСТВИЕ

ПОСТОРОННИХ АГЕНТОВ

 

Методические принципы исследования составлены на основании требований Всемирной Организации Здравоохранения, национальных требований ряда стран, а также существующей отечественной нормативно-технической документации.

 

Схема контроля вирусных вакцин

на отсутствие посторонних агентов

 

1. Контроль живых вирусных вакцин

1.1. Контроль производственной клеточной культуры

1.1.а. Контроль в клеточных культурах

1. В гомологичной клеточной культуре другой партии

2. В культуре клеток человека

3. В культуре клеток, наиболее чувствительной к вирусам животного - продуцента производственной культуры.

1.1.б. Контроль на отсутствие микоплазм

1.2. Контроль объединенного вирусного сбора

1.2.а. Контроль в клеточных культурах

1. В гомологичной клеточной культуре другой партии.

2. В культуре клеток человека

3. В культуре клеток, наиболее чувствительной к вирусам животного - продуцента производственной культуры.

1.2.б. Контроль на животных.

1. На взрослых мышах.

2. На новорожденных мышах.

3. На морских свинках.

1.2.в. Контроль на куриных эмбрионах.

1. Введение материала в аллантоисную полость.

2. Введение материала в желточный мешок.

3. Введение материала на хориоаллантоисную оболочку.

1.2.г. Контроль на отсутствие микоплазм (контролю, помимо

объединенного вирусного сбора, подлежит готовый препарат)

1.2.д. Контроль на микобактерии туберкулеза.

2. Контроль инактивированных вирусных вакцин

В случаях производства инактивированных вирусных вакцин контролю подлежат:

1. Объединенный вирусный сбор, полученный при приготовлении вакцинного штамма.

2. Объединенный вирусный сбор, полученный при приготовлении посевного вируса.

3. Каждая партия производственной клеточной культуры.

Контроль осуществляется согласно методам, описанным для живых вирусных вакцин.

 

Методы контроля

 

1. Контроль производственной клеточной культуры

Не менее 500 мл клеточной суспензии в концентрации, используемой при засеве производственных клеточных культур, предназначается для приготовления контрольных клеточных культур. Указанную часть клеточной суспензии разливают в матрасы, удобные для выполнения контрольных исследований.

Контрольные культуры инкубируют при тех же условиях, что и производственные, в течение 14 суток с момента внесения вируса в производственные культуры или до момента последнего слива вируссодержащей жидкости из производственных культур, если такой слив осуществляется позже, и просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений. Учет результатов контроля может быть произведен в том случае, если за период наблюдения по неспецифическим причинам и вследствие различных случайностей будут отбракованы не более 20% контрольных клеточных культур.

По истечении срока наблюдения половину контрольных клеточных культур проверяют на наличие феномена гемадсорбции с эритроцитами морской свинки. При этом сливают культуральную жидкость, клеточный монослой отмывают раствором Хенкса или 0,85% раствором хлористого натрия, имеющим температуру 20 град. - 25 град. С, и в матрасы с культурой вносят 0,25% взвесь эритроцитов морской свинки в 0,85% растворе хлористого натрия в объеме, достаточном для того, чтобы покрыть весь клеточный монослой. После инкубации в течение 30 минут при температуре 0-4 град. С и последующей инкубации в течение 30 мин. при температуре 20 град. - 25 град. С взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хенкса или 0,85% раствором хлорида натрия, имеющим температуру 20 град. - 25 град. С, и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции.

Кроме того, по истечении срока наблюдения из всех матрасов с контрольными культурами отбирают пробы культуральной жидкости (если на протяжении срока инкубации контрольных культур производят сливы вируссодержащей жидкости из производственных культур, то в те же сроки берут пробы культуральной жидкости из матрасов с контрольными культурами и сохраняют их в замороженном состоянии). Все пробы культуральной жидкости объединяют (сливая равные объемы) и вводят из расчета 1 часть контролируемой смеси проб (не менее 10 мл на каждую клеточную культуру) на 4 части питательной среды в три различные клеточные культуры - в гомологичную культуру другой партии, в культуру клеток человека и в клеточную культуру, вид которой зависит от субстрата производства вакцины. От каждой клеточной культуры оставляют по одному контрольному незараженному матрасу. Все культуры инкубируют при 36 град. - 37 град. С в течение 14 сут. с однократной сменой среды через 4-6 сут. после инокуляции и просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По окончании срока наблюдения культуры проверяют на наличие феномена гемадсорбции с эритроцитами морской свинки, как указано выше. Пробы считают прошедшими контроль, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорбции в контрольных матрасах опыт следует повторить в клеточной культуре другой партии.

б) Контроль на отсутствие микоплазм.

Культуральную жидкость из контрольных матрасов, взятую по истечении срока наблюдения, проверяют на отсутствие микоплазм по методике, описанной в разделе контроля вируссодержащего материала.

 

2. Контроль вируссодержащего материала

Контролю подлежит объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакционного штамма, посевного вируса и вакцины. Если контроль осуществляется не позднее, чем через 24 часа после отбора проб вируссодержащей жидкости, то последние до проведения контроля хранятся при 4 град. С. При проведении контроля в более поздние сроки пробы замораживают и хранят при температуре, не превышающей -20 град. С. Оттаивание материала разрешается производить не более 1 раза.

а) Контроль в клеточных культурах

Для проведения контроля испытуемый материал (не менее 25 мл на каждую клеточную культуру) смешивают с иммунной сывороткой, взятой в количестве, достаточном для полной нейтрализации содержащегося в пробе вируса. Для получения иммунных сывороток используют животных, ткани которых не применяют для приготовления клеточных культур. Антиген для иммунизации животных готовят в клеточных культурах, не используемых при проведении контролей. Промежуток времени между извлечением испытуемого образца из холодильника (в случае хранения его при 4 град. С) или его размораживанием и добавлением иммунной сыворотки не должен превышать 30 мин.

Смесь инкубируют при заданной температуре в течение необходимого для нейтрализации данного вируса времени, после чего вносят в матрасы с тремя указанными выше видами культур клеток. В каждую клеточную культуру должно быть внесено не менее 25 мл испытуемого материала, и разведение его поддерживающей средой не должно превышать 1:4. Для каждого вида культуры клеток оставляют один контрольный незараженный матрас.

Культуры инкубируют при температуре 36 град. - 37 град. С в течение 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении 14 сут. опытные и контрольные клеточные культуры замораживают, оттаивают и производят пассаж на одноименной культуре, внеся в нее не менее 25 мл неосветленной культуральной жидкости. Разведение вносимого материала поддерживающей средой не должно превышать 1:4. В случае, если контроль производится в перевиваемой клеточной линии, по истечении указанного срока инкубации делается субпассаж.

Культуры (опытную и контрольную) инкубируют при 36 град. - 37 град. С в течение 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении срока наблюдения культуры проверяют в реакции гемадсорбции, как указано выше. Материал считается прошедшим контроль, если и в опытных, и в контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорбции в контрольных культурах опыт повторяют на другой партии клеточной культуры.

б) Контроль на животных

Используются здоровые животные, не бравшиеся в опыт ранее. В случае, если содержащийся в контролируемом материале вирус патогенен для используемых при контроле животных, его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой или гамма-глобулином.

1. Контроль на взрослых мышах

Используют не менее 20 мышей массой 15-20 г. Каждому животному вводят по 0,03 мл испытуемого материала интроцеребрально и по 0,5 мл - интраперитонеально. Животных наблюдают 28 дней. Все мыши, которые погибают после первых 24 часов после введения материала, или у которых наблюдают признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной инфекции. Из соответствующих органов готовят 10% суспензию на 0,85 % растворе хлорида натрия и вводят ее не менее чем 5 мышам интрацеребрально и интраперитонеально. Животных наблюдают 21 день. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдению остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусного заболевания.

2. Контроль на новорожденных мышах

Используют не менее 20 новорожденных мышей не старше 24 час. Каждому животному вводят по 0,01 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,1 мл - интраперитонеально. Животных наблюдают 14 дней. Все мыши, которые погибают после первых 24 часов после введения материала, или у которых наблюдают признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной инфекции. Из соответствующих органов готовят 10% суспензию на 0,85% растворе хлорида натрия и вводят ее не менее чем 5 новорожденным мышам интрацеребрально и интраперитонеально. Животных наблюдают 14 дней. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусного заболевания.

3. Контроль на морских свинках

Используют не менее 5 морских свинок массой 300-350 г. Каждому животному вводят по 0,1 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 5,0 мл - интраперитонеально. Животных наблюдают 42 дня. Все животные, которые погибают после первых 24 часов после введения материала, или у которых наблюдаются признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной или туберкулезной инфекции. Органы их (селезенка, легкое, печень, сальник) и лимфоузлы (паховые, подмышечные, забрюшинные, трахеобронхиальные, портальные) должны быть исследованы микроскопически, а 10% суспензия (на 0,85% растворе хлорида натрия) этих органов и лимфоузлов исследуется культурально путем посева на яичную среду. В конце периода наблюдения все выжившие животные вскрываются и исследуются макроскопически на наличие признаков вирусной или туберкулезной инфекции. Материал считается прошедшим контроль, если не менее 80% инокулированных животных остаются здоровыми к концу периода наблюдения, и не у одного из них не наблюдается признаков вирусной или туберкулезной инфекции.

в) Контроль на куриных эмбрионах

В случае, если содержащийся в контролируемом материале вирус патогенен для куриных эмбрионов, его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой или гамма-глобулином. Материал вводят трем партиям куриных эмбрионов.

10 куриным эмбрионам 9-10 дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при 37 град. С в течение 5-6 суток. По истечении указанного срока аллантоисную жидкость проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки и петуха. При этом в лунках агглютнационных досок готовят 5-6 последовательных двукратных разведений (на 0,85% растворе хлорида натрия) аллантоисной жидкости из каждого инокулированного эмбриона. Затем в лунки добавляют равные объемы 0,5% суспензии (на 0,85% растворе хлорида натрия) эритроцитов. После 30-40 мин. инкубации при 20 град. - 25 град. С учитывают результаты. Материал считается прошедшим контроль, если в течение указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и реакция гемагглютинации во всех случаях отрицательна. 10 куриным эмбрионам 7-8 дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в желточный мешок. Эмбрионы инкубируют при 37 град. С в течение 10 сут. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов.

10 куриным эмбрионам 10 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку с боковой поверхности яйца через искусственную воздушную полость или со стороны естественного воздушного мешка. Эмбрионы инкубируют при 37 град. С в течение 5-6 суток. По истечении указанного срока извлекают и просматривают оболочки. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и на хорионаллантоисных оболочках отсутствуют макроскопические изменения.

г) Контроль на отсутствие микоплазм

Контролю подлежат: объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакционного штамма, посевного вируса и вакцины, а также готовые формы указанных препаратов.

Применяют питательную среду следующего состава:

 

                                                              г/л

    триптический гидролизат бычьего сердца                  - 20,0

    мясной экстракт                                         - 13,0

    экстракт дрожжей                                        - 1,5

    натрия хлорид                                           - 5,0

    агар                                                    - 3,0

                                     рН = 7,8 (после стерилизации)

 

Приготовление 1 л среды:

К гидролизату бычьего сердца в количестве 200 мл (с содержанием сухих веществ 8-10%) добавляют 400 мл мясного экстракта 1:2 с содержанием сухих веществ 3,0-3,5% и экстракт дрожжей из расчета 1,5 г сухих веществ на 1 л среды, а также 5,0 г хлористого натрия и 3,0 г агара. С помощью 10% раствора NaOH устанавливают значение рН, равное 8,0. Среду кипятят 2-3 мин. до расплавления агара, фильтруют при необходимости, разливают и стерилизуют при 0,5 ати в течение 30 минут.

Перед употреблением среду разогревают в водяной бане до полного расплавления агара, охлаждают до 40-45 град. С, добавляют 15% сыворотки лошади или теленка (без консерванта) и 100 ед/мл пенициллина и разливают по 10 мл в пробирки. У каждой серии среды проверяют чувствительность к микоплазмам, используя стандартный штамм микоплазм. Подлежащий контролю материал вносят по 0,5 мл в каждую из 10 пробирок со средой. Посев производят столбиком от дна пробирки. Пробирки инкубируют в течение 14 сут. при 87 град. С. Просмотр пробирок проводят на 3, 5, 7 и 14 сутки. При наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирки материал бракуют.

д) Контроль на микобактерии туберкулеза.

Исследуемый материал засевают по 0,5 мл в 10 пробирок со средой Левинштейна. Посевы инкубируют при 38 град. С в течение 30 сут. При наличии роста микобактерий туберкулеза хотя бы в одной пробирке материал бракуют.

Примечания:

1. Данные методические указания распространяются на вирусные вакцины, продуцентами клеток для приготовления которых являются животные, получаемые из неконтролируемых хозяйств. При получении животных из закрытых, контролируемых хозяйств схема контроля меняется в соответствии с требованиями ВОЗ.

2. В частных фармакопейных статьях на отдельные препараты, учитывая специфические особенности их производства, возможно введение дополнительных методов контроля.

3. За исключением случаев, указанных в тексте методики, проведение повторного контроля запрещается.

 

V. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ

 

Испытания на токсичность с применением нижеописанных методов должны проходить серии препаратов, предназначенных для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрикожного введения. Испытания токсичности препаратов, вводимых человеку иными способами, может быть проведено, как методами, описанными в настоящем разделе, так и методами, сформулированными в частной фармакопейной статье.

Испытания проводят на двух видах животных: белых мышах массой 17-20 г и морских свинках массой 250-350 г (частной фармакопейной статьей может быть предусмотрено использование животных меньшей массы).

В исследованиях должны быть использованы здоровые животные, содержащиеся на регламентированном пищевом рационе, которые ранее не использовались для проведения каких-либо испытаний. Исходную массу животных определяют и регистрируют в день начала испытания.

Белые мыши. Препарат вводят внутрибрюшинно 5 животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 1 мл. Сухой препарат растворяют прилагаемым растворителем в соответствии с указанием на этикетке. Если препарат вводят человеку внутривенно, то его токсичность для белых мышей также определяют при внутривенном введении. Препарат должен вводиться в дозе, не превышающей 0,5 мл, со скоростью 0,1 мл/сек.

Морские свинки. Препарат вводят подкожно 2 животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 10 мл. Сухой препарат растворяют прилагаемым растворителем в соответствии с указанием на этикетке. Если препарат вводят человеку внутривенно, то его токсичность для морских свинок определяют при внутрибрюшинном введении, в этом случае доза препарата должна быть равна одной максимальной разовой дозе для человека, но не превышать 5 мл.

Наблюдение за животными осуществляют ежедневно в течение 7 дней с регистрацией всех изменений в состоянии здоровья каждого животного. В день окончания наблюдения каждое животное взвешивают.

Испытание считают удовлетворительным, если:

- все животные остаются живыми в течение периода наблюдения;

- ни у одного из животных не выявлены признаки заболевания;

- масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходным.

Помимо этого, ни у одной морской свинки, получившей препарат подкожно, в месте введения не должен развиваться некроз или абсцесс (возможность развития других симптомов местной реакции и их допустимые размеры определяют в частной фармакопейной статье).

Если в течение периода наблюдения регистрируются гибель, заболевание, уменьшение массы, развитие некроза или абсцесса хотя бы у одного животного, испытание должно быть повторено на удвоенном количестве животных того же вида. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям.

В случае, когда в частной фармакопейной статье предусмотрено испытание специфической безвредности готового препарата, которое включает требования, предъявляемые к испытанию на токсичность, то испытание на токсичность на соответствующем виде животных может не проводиться.

Введение дополнительных методов испытания на токсичность в частную фармакопейную статью не исключается.