УТВЕРЖДАЮ
Зам. Председателя
Комитета здравоохранения
И.А.ЛЕШКЕВИЧ
9 декабря 2000 г.
СОГЛАСОВАНО
Главный медицинский генетик
Комитета здравоохранения
Г.Г.ГУЗЕЕВ
9 декабря 2000 г.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ДЕТЕКЦИИ КЛЕТОК ПЛОДА В
КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН В ЦЕЛЯХ ПРЕНАТАЛЬНОЙ
ДИАГНОСТИКИ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ
ИНФОРМАЦИОННОЕ ПИСЬМО
(N 21)
Председатель УМС
Комитета здравоохранения
Л.Г.КОСТОМАРОВА
8 декабря 2000 г.
Учреждение-разработчик:
Медико-генетический научный центр РАМН.
Составители: д.б.н.
Т.В.Золотухина, к.м.н. Н.В.Шилова, к.б.н. И.А.Замулаева.
Предназначение: для использования в
учреждениях, специализирующихся на пренатальной диагностике и профилактике
врожденных и наследственных заболеваний.
Новый неинвазивный подход в пренатальной
диагностике хромосомных анеуплоидий базируется на возможности исследования
клеток плода, выделенных из крови беременных женщин. Феномен трансплацентарной
трансфузии различных клеток плода в периферическую кровь беременных женщин
позволяет подойти к проблеме пренатальной диагностики хромосомных нарушений у
плода без проведения инвазивных процедур.
В связи с очень низкой концентрацией
клеток плода в крови матери необходимо использование биотехнологических этапов
их обогащения, сортировки (или сепарации) и высокоспецифичного анализа. На
основании результатов проведенного исследования составлена настоящая инструкция
по обогащению и детекции клеток плода с помощью методов сортировки и
последующего FISH-анализа сортированных клеток с использованием хромосомо-специфичных
ДНК-зондов на хромосомы наиболее частых трисомий у человека. Объектом
сортировки последующего анализа были эритробласты плода, не сохраняющиеся в
организме матери от плодов предыдущих беременностей.
С согласия пациенток, 10-25 мл периферической
венозной крови из локтевой вены забирали в стерильный флакон (Nunc), содержащий
в качестве антикоагулянта 1-2 мл раствора гепарина (Richter) в растворе
фосфатно-солевого буфера (0,01М PBS, рН 7,2) в соотношении 1:20. В случаях,
когда проводилась пренатальная цитогенетическая диагностика, венозную кровь у
женщин брали спустя 5-7 дней после инвазивной процедуры. Обычно полученные
образцы крови до последующей обработки хранили при комнатной температуре в
пределах 24 часов.
Методы обогащения
материнской крови
плодными клетками
Для обогащения материнской крови клетками
плода проводили центрифугирование образцов в градиенте плотности фиколла с
целью выделения фракции мононуклеарных клеток. При этом нативную венозную кровь
разводили 0,01М раствором PBS (рН 7,2) в соотношении 1:1, наслаивали на Ficoll
Paque (Pharmacia Biotech) или фиколверографин (Панэко) с плотностью 1,077
г/куб. см в соотношении 2:1 и центрифугировали в градиенте плотности при 400 g
30 минут на центрифуге К-70. Фракцию мононуклеарных клеток отбирали
пастеровской пипеткой, отмывали дважды в 0,01М растворе PBS, центрифугируя при
1500 об./мин. 15 минут на
центрифуге ОПн-3. Концентрацию ядерных клеток в 1 мл крови определяли в камере
Горяева.
Детекция
эритробластов плода
В зависимости от последующих методов
изоляции плодных эритробластов процедуры детекции отличались друг от друга.
При
использовании
флуоресцентно-активированной
клеточной сортировки
(ФАКС) осадок
выделенных мононуклеарных клеток ресуспензировали в 0,01М
растворе PBS с
0,5% бычьим сывороточным
альбумином (БСА) и подвергали
прямому флуоресцентному окрашиванию
с помощью моноклональных антител к
поверхностным антигенам
нормобластов: к гликофорину А,
меченных
фикоэ-ритрином
(РЕ) (GPA + PE, клон D2.10, Coulter), из расчета 10 мкл на 1
7
x 10 ядерных клеток и к трансферрину, меченных
изотиацианатом флуоресцеина
7
(FITC) (CD71
+ FITC, Becton
Dickinson), из расчета 20 мкл на 1 x 10
ядерных клеток.
При отрицательной сортировке
использовали моноклональные
антитела к поверхностным
антигенам лимфоцитов (CD45
+ FITC, Becton
7
Dickinson) из расчета 20 мкл на 1 x 10 ядерных клеток. Клетки инкубировали
1 час
в темноте при
комнатной температуре, центрифугировали при 3000
Об./мин. 5 минут,
осадок клеток ресуспендировали в 0,01М растворе PBS,
центрифугировали при
3000 об./мин. 5 минут и полученный клеточный осадок
фиксировали в
1 мл 1%
раствора формальдегида в
PBS. Образцы до
непосредственной клеточной
сортировки хранили при +4 град.
С. Для
прокрашивания ДНК за 20 минут до анализа к клеткам
добавляли Hoechst 33342
(Sigma) в
конечной концентрации 10 мкг/мл.
При магнитно-активированной клеточной
сортировке (МАКС) использовали моноклональные антитела, связанные с магнитными
носителями. Сортировку клеток проводили в магнитном поле. Иммуномагнитные
шарики предварительно отмывали в растворе PBS с 0,2% БСА в соотношении 1:20 с
последующим разделением магнитных шариков и буферного раствора на
кобальто-самариевом магнитном носителе (Immunotech) в течение 5 минут.
Суспензию клеток с иммуномагнитными шариками инкубировали при комнатной
температуре 10 мин., осторожно перемешивая после 5 мин. инкубации.
Флуоресцентно-активированная
клеточная
сортировка (ФАКС)
Образцы анализировали на проточном
цитофлуориметре-сортировщике FACS Vantage (Becton Dickinson) не позднее, чем через
24 часа после окрашивания. Проточный цитофлюориметр был оборудован лазером
(Enterprise 621, Coherent Inc.) с эмиссией 2-х волн: 364 нм (для возбуждения
флюоресценции Hoechst 33342) и 488 нм (для возбуждения флюоресценции FITC и
РЕ).
Анализ клеток проводили по 5 параметрам:
интенсивность бокового и прямого светорассеяния, флюоресценции FITC, РЕ и
Hoechst 33342. Для измерения флюоресценции FITC использовали узкополосные
фильтры 530/30 нм, РЕ - 575/26 нм, Hoechst 33342 - 424/40 нм. Мощность лазера
составляла 20 mW для пучка с длиной волны 364 нм и 100-120 mW для пучка с
длиной волны 488 нм.
Юстировку
прибора проводили с
помощью 2-мкм калибровочных шариков
(Becton Dickinson),
флюоресцирующих в диапазоне
FITC и РЕ,
а также
тимоцитов теленка
(Becton Dickinson), окрашенных Hoechst 33342. Качество
сортировки проверяли
с помощью 6 мкм шариков,
окрашенных различными
3
флуорохромами. Анализ
и сортировку проводили со скоростью 1,5-2,0 x 10
кл/сек. с использованием программы
Lysys II (Becton
Dickinson). ФАКС
проводилась старшим
научным сотрудником лаборатории
пострадиационного
восстановления Медицинского
радиологического научного Центра
РАМН к.б.н.
Замулаевой И.А.
(руководитель лаборатории - д.м.н., профессор Саенко А.С.).
Отсортированные клетки наносили на ограниченные участки
предметных стекол,
обработанных 2%
раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне. В первой
серии образцов
(с 1 по 14)
на препараты с клетками наносили по 200 мкл
0,05М раствора
КС1
и инкубировали при
37 град. С в течение 20 минут.
Гипотонический раствор
аккуратно сливали и
наносили 200 мкл раствора,
содержащего 30%
фиксатора (метанол-уксусная кислота
3:1) и 70% 0,075М
раствора КС1 на 5 минут при
комнатной температуре. Затем раствор аккуратно
сливали и на
стекло наносили 1 мл свежеприготовленного фиксатора с высоты
50-60 см.
После удаления фиксатора
стекла высушивали при 60 град. С в
течение 5 минут
и дегидратировали в 70%, 80% и 96% этаноле. Во второй серии
образцов (с 15 по 28) препараты с клетками
инкубировали с 0,005% раствором
пепсина в
0,01М растворе НС1 в течение 30 минут при 37 град. С. Стекла
промывали в растворе PBS
при комнатной температуре в
течение 5 минут с
последующей фиксацией в 1% растворе формальдегида в
растворе PBS в течение
5 минут.
Затем в течение
5 минут стекла
промывали в растворе PBS и
дегидратировали
в 70%, 80% и 96% этаноле по 2 минуты в каждом.
Магнитно-активированная
клеточная сортировка (МАКС)
Непосредственно после инкубации
выделенных клеток с анти-CD45 иммуномагнитными шариками пробирку с клеточной
суспензией помещали на кобальто-самариевый магнитный держатель на 10 минут. Не
удаляя пробирку из магнитного поля, аккуратно переносили супернатант в чистую пробирку,
которую повторно ставили на магнитный держатель на 10 минут. Супернатант
собирали в чистую пробирку и наносили на ограниченные участки предварительно
прогретых до 37 град. С предметных стекол, покрытых 2% раствором
3-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне. На препараты с клетками наносили
200 мкл 0,05М раствора КС1 и инкубировали при 37 град.
С в течение 20 минут. Гипотонический раствор аккуратно сливали и наносили 200
мкл раствора, содержащего 30% фиксатора (метанол-уксусная кислота 3:1) и 70%
0,075М раствора КС1 на 5 минут при комнатной
температуре. Затем раствор аккуратно сливали и на стекло наносили 1 мл
свежеприготовленного фиксатора с высоты 50-60 см. После удаления фиксатора
стекла высушивали при 60 град. С в
течение 5 минут с последующей дегидратацией в 70%, 80% и 96% этаноле.
Флуоресцентная in
situ гибридизация (FISH)
Флюоресцентную in
situ гибридизацию (FISH) проводили на препаратах с итерфазными ядрами клеток
плода, полученных из цельной периферической крови беременных женщин при
использовании различных методов клеточной сортировки и культивирования по
методу Pinkel с соавторами (Pinkel et al., 1986), в модификации, разработанной
в лаборатории цитогенетики человека под руководством проф., д.б.н. Юрова Ю.Б.
(НЦ психического здоровья РАМН). Во всех случаях при регулярных трисомиях у плодов были использованы
биотинилированные центромерные альфа-сателлитные ДНК-пробы МCG13.21-01 (13;
21cen), MCG18-01 (18cen), MCGX-01 (Xcen), сконструированные в лаборатории
цитогенетики человека НЦ психического здоровья РАМН под руководством проф.
Юрова Ю.Б. Описание этих последовательностей представлено в работах проф. Юрова
Ю.Б. с соавторами [Юров 1987, Юров и др. 1989, Yurov et al., 1997]. В двух случаях, когда кариотипы плодов были 46, XY, -14,
+t(14/21)mat и 46, XX, -21, +t(21/21), мы использовали биотинилированный
РАС-клон, несущий хромосомо-21-специфичную однокопийную вставку на район
21q22.3, полученный в лаборатории проф. Юрова Ю.Б.
Кроме того, была использована
биотинилированная ДНК-проба pY3.4, содержащая фрагмент длиной 3,4kb. из Нае III
повторов гетерохроматинового района Y-хромосомы человека, сконструированная Dr.
Lau Y.F. (University of California, San Francisco, CA).
При проведении FISH с альфа-сателлитными
ДНК-зондами по 1 мкл альфа-сателлитных ДНК-проб разводили в 9 мкл
гибридизационной смеси (55% формамид, 2xSSC) до конечной концентрации 2 нг/мкл.
Полученную смесь наносили на препараты с отсортированными клетками,
предварительно обработанными различными способами в зависимости от метода
детекции (пп. 2.3., 2.4., 2.5., 2.6.), накрывали покровными стеклами размером
22x22 мм и прогревали при 78 град. С в течение 7 минут для одновременной денатурации ДНК зонда и
хромосом. Гибридизацию проводили во влажной темной камере при 37 град. С в течение 16-18 часов. После
удаления покровных стекол препараты отмывали в 50% формамиде, 2xSSC при 42
град. С в течение 15 минут,
затем в 0,1xSSC при 45 град. в течение 30 минут, однократно ополаскивали в
4xSSC/0,1% Triton Х-100. На препараты наносили по 20 мкл
авидина, меченного FITC (FITC-avidin "Vector") в концентрации 5
мкг/мл в 0,5% растворе бычьего сывороточного альбумина в 4xSSC, накрывали
покровными стеклами 22x22 мм и инкубировали во влажной камере 30 минут при 37
град. С. Затем удаляли покровные стекла и отмывали препараты в трех сменах
раствора 4xSSC, 0,1% Triton Х-100 при 42 град. С по 5 минут. Для
усиления гибридизационного сигнала проводилась иммунологическая амплификация с
биотинилированными антителами к авидину (Antiavidin "Vector"). Для
этого на препараты наносили 20 мкл антиавидина в концентрация 5 мкг/мл в 0,5%
растворе БСА в 4xSSC, накрывали покровными стеклами размером 22x22 мм и
инкубировали 30 минут при 37 град. С во влажной
камере. Затем покровные стекла удаляли и препараты отмывали в трех сменах раствора
4xSSC/0,1% Triton X-100 при 42 град. С по 5 минут. Затем на препараты наносили
по 20 мкл FINC-avidin в концентрации 5 мкг/мл, накрывали покровными стеклами
размером 22x22 мм и инкубировали 30 минут при 37 град. С
во влажной камере. После удаления покровных стекол препараты отмывали в трех
сменах раствора 4xSSC, 0,1% Triton X-100 при 42 град. С по 5 минут.
Для контрастирующего окрашивания ядер на
препараты наносили 20 мкл смеси, состоящей из раствора йодистого пропидия в
концентрации 200 нг/мл в фотозащитном растворе, содержащем противовыцветающий
реагент - 2% 1,4-диазобицикло-[2.2.2]октан (DABCO) в 50% глицерине на 20мМ
Tris-HCl (pH 8,0) и накрывали покровными стеклами 22x22 мм.
При проведении FISH с pY3.4 ДНК-зондом по
1 мкл ДНК-зонда разводили в 6 мкл гибридизационной смеси до конечной
концентрации 2 нг/мкл. Полученную смесь наносили на препараты с изолированными
и предварительно обработанными клетками, в зависимости от способов детекции, и
накрывали покровными стеклами размером 22x22 мм. Одновременную денатурацию
препаратов и ДНК-зонда проводили в течение 7 минут при 78 град. С с последующей гибридизацией во
влажной камере при 37 град. С в течение 16-18 часов. После удаления покровных
стекол препараты отмывали в 50% формамиде, 2xSSC при 37 град. С в течение 30 минут, затем в 2xSSC
при 37 град. С 30 минут. Для детекции гибридизационного сигнала на препараты
наносили FITC-avidin "Vector" в концентрации 5 мкг/мл, накрывали
покровными стеклами размером 22x22 мм и инкубировали во влажной камере при 37
град. С в течение 30 минут.
Затем удаляли покровные стекла и отмывали препараты в трех сменах раствора
4xSSC по 5 минут при 37 град. С и однократно - в
растворе PBS. Для окраски препаратов наносили по 20 мкл смеси,
содержащей йодистый пропидий в концентрации 200 нг/мл в фотозащитном растворе и
накрывали покровными стеклами размером 22x22 мм.
В случаях, когда использовался
однокопийный ДНК-зонд на теломерный участок хромосомы 21 (21q22.3), проводили
раздельную денатурацию ДНК выделенных клеток и ДНК-пробы.
Денатурацию
препаратов с предварительно обработанными клетками проводили в 70% формамиде,
2хSSC при 70 град. С в течение 2 минут с последующей дегидратацией в серии
спиртов 70 град., 80 град. и 96 град. по 5 минут в каждом. 50 нг фаговой
ДНК-пробы смешивали с 2 мкг Cot 1 человеческой ДНК (Gibco BRL) в 10 мкл
гибридизационной смеси, содержащей 50% формамид, 2xSSC, 10% декстрансульфат. Денатурацию ДНК-зонда в гибридизационной смеси
осуществляли прогреванием в течение 5 минут при 100 град. С
на водяной бане. Гибридизационную смесь по 10 мкл наносили на препараты,
накрывали покровными стеклами размером 22x22 мм и инкубировали во влажной
камере при 37 град. С в
течение 16-18 часов. Постгибридизационная отмывка, детекция гибридизационного
сигнала и иммунологическая амплификация проводились
как описано в п. 2.9.1.
Микроскопирование проводили на
флуоресцентном микроскопе Opton Axioscop со светофильтром N 9 (длина волны 510
нм) для анализа флуоресценции FITC и на флуоресцентном микроскопе Jenalumar со
светофильтрами "U-204" и "В-226" (длина волны 410 нм) для
анализа флуоресценции Hoechst 33342. Фотографирование клеток осуществляли на
пленку Kodak Ectachrome ASA 200.
В результате проведенного исследования
получены результаты, свидетельствующие о возможности выделения, детекции и
анализа клеток плода, присутствующих в крови беременных женщин.
Во всех образцах крови женщин, беременных
плодами мужского, пола при использовании обоих методических
подходов сортировки (ФАКС и МАКС), при последующем FISH-анализе с
Y-хромосомо-специфичным ДНК-зондом были обнаружены эритробласты плода (Y +
клетки) в среднем в 1,9% среди сортированных клеток.
Эти результаты позволили использовать
данный метод для изоляции и анализа клеток плода при хромосомных анеуплоидиях,
диагностированных у плода при проведении классической пренатальной
цитогенетической диагностики.
Результаты FISH-анализа клеток плода,
сортированных методом ФАКС из крови женщин, беременных плодами с хромосомными
анеуплоидиями, убедительно свидетельствуют о том, что при использовании FISH-метода
с соответствующими хромосомо-специфичными ДНК-зондами можно выявить аберрантные
клетки плода в крови беременных женщин. Причем их концентрация в сортированных
образцах была равна в среднем 4%, что статистически значимо выше, чем при
беременности здоровым плодом (1,9%).
При сравнении качества сортированных
клеток и результатов их последующего FISH-анализа можно сделать вывод, что
более физиологичным, и поэтому более предпочтительным, является метод
магнитно-активированной сортировки, поскольку позволяет получить для анализа не
поврежденные, структуированные (менее травмированные) клетки. Такое качество
сортированных клеток способствует более эффективной гибридизации при
FISH-методе и, соответственно, более корректному анализу гибридизационных сигналов
с хромосомо-специфичными ДНК-зондами.
Новый неинвазивный метод пренатальной
диагностики хромосомных анеуплоидий может быть использован как дополнительный
или даже как альтернативный при невозможности проведения инвазивной
диагностики.