МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
ДЕПАРТАМЕНТ ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА,
ЭФФЕКТИВНОСТИ, БЕЗОПАСНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И
МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ
ПИСЬМО
29 октября 2001 г.
N 291-22/144
Департамент
государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных
средств и медицинской техники направляет к сведению и руководству изменение N 2
к статье Государственной фармакопеи XI издания "Методы микробиологического
контроля лекарственных средств" (ГФХI, вып. 2,
с. 187) и просит предусмотреть с 1 января 2002 года разделы
"Микробиологическая чистота" и "Стерильность" в стандартах
качества лекарственных средств, направляемых на регистрацию (перерегистрацию),
в соответствии с указанным
изменением.
Заместитель руководителя Департамента
Д.В.РЕЙХАРТ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя Департамента
государственного контроля качества,
эффективности, безопасности
лекарственных средств и
медицинской техники
Д.В.РЕЙХАРТ
ИЗМЕНЕНИЕ N 2
К СТАТЬЕ ГОСФАРМАКОПЕИ XI ИЗДАНИЯ "МЕТОДЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ"
(ГФ ХI, вып.
2, с. 187)
Срок введения Изменения с 01.01.2002 г.
РАЗДЕЛ 1
ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ЧИСТОТЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, СУБСТАНЦИЙ
И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Таблица 1
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
┌──────────┬───────────────────────────┬─────────────────────────┐
│
Категория│ Применение │ Рекомендуемые нормы для │
│ │ │Госфармакопеи XII издания│
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 1
│ 2 │ 3 │
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│
1. │- Для парентерального │ Стерильность │
│ │ введения │ │
│ │- Глазные лекарственные │ │
│ │ средства │ │
│ │- Для нанесения на открытые│ │
│ │ раны и ожоги │ │
│ │- Другие лекарственные │ │
│ │ средства, к которым │ │
│ │ предъявляется требование │ │
│ │ "стерильность" │ │
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│
2. │- Для применения
местно, │- Общее число аэробных │
│ │ трансдермально │ бактерий и грибов │
│ │- Для применения │ (суммарно) - не более │
│ │
интравагинально │ 2 │
│ │- Для введения в полости │
10 в 1 г или в 1 мл │
│ │ уха, носа │- Отсутствие
бактерий │
│ │- Для введения в │ семейства │
│ │ дыхательные пути (за │
Enterobacteriaceae в 1 │
│ │ исключением тех │ г или в 1 мл │
│ │ лекарственных средств, │- Отсутствие Pseudomonas
│
│ │ которые должны │ aeruginosa в 1 г
или в │
│ │ быть стерильными) │
1 мл │
│ │ │-
Отсутствие │
│ │ │ Staphylococcus aureus в│
│ │ │
1 г или в 1 мл │
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│
3. │Для приема внутрь
или │- Общее число аэробных │
│ │введения ректально │ 3 │
│ │А. Лекарственные средства │
бактерий не более 10 в│
│ │из субстанций │ 1 г или в 1 мл │
│ │синтетического │- Общее число грибов - не│
│ │происхождения │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в 1│
│ │ │ мл │
│ │ │- Отсутствие Escherichia │
│ │ │ coli в 1 г или в 1
мл │
│ ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│ │Б. Лекарственные средства │- Общее число аэробных │
│ │из субстанций природного │ 4 │
│ │происхождения │ бактерий не более 10 в│
│ │(растительного,
животного │ 1 г или в 1 мл │
│ │или минерального),
за │- Общее, число грибов
- │
│ │исключением лекарственных │ 2 │
│ │средств, включенных в │
не более 10 в 1 г или│
│ │Категорию 4 │ в 1 мл │
│ │ │- Отсутствие Escherichia │
│ │ │ coli в 1 г или в 1
мл │
│ │ │- Отсутствие Salmonella в│
│ │ │ 10 г или в 10 мл │
│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │
│ │ │ aeruginosa в 1 г
или в │
│ │ │ 1 мл │
│ │ │-
Отсутствие │
│ │ │ Staphylococcus aureus в│
│ │ │ 1 г или в 1 мл │
│ │ │- Энтеробактерий - не
│
│ │ │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в │
│ │ │ 1 мл │
│ ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│ │В. Детские лекарственные │- Общее число аэробных │
│ │средства │ бактерий не более 500 в│
│ │ │
1 г или в 1 мл │
│ │ │- Общее число
грибов - не│
│ │ │ более 50 в 1 г или в 1 │
│ │ │ мл │
│ │ │- Отсутствие
бактерий │
│ │ │ семейства │
│ │ │ Enterobacteriaceae
в 1 │
│ │ │ г или в 1 мл │
│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │
│ │ │ aeruginosa в 1 г
или в │
│ │ │ 1 мл │
│ │ │-
Отсутствие │
│ │ │ Staphylococcus aureus в│
│ │ │ 1 г или в 1 мл │
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│
4. │Лекарственные
средства, │ │
│ │состоящие
из одного вида │ │
│ │сырья
(фасованная │ │
│ │продукция) или нескольких │ │
│ │(сборы), а также │ │
│ │растительное сырье │ │
│ │"ангро" │ │
│ │А. Лекарственные │- Общее число аэробных │
│ │растительные средства или │ 7 │
│ │лекарственное сырье │
бактерий не более 10 │
│ │"ангро",
применяемые в │ в 1 г или в 1
мл │
│ │виде
настоев и отваров, │- Общее
число грибов - не│
│ │приготовленные с │ 5 │
│ │использованием │ более 10
в 1 г или в │
│ │термической обработки │
1 мл │
│ │ │- Escherichia coli - не │
│ │ │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в │
│ │ │ 1 мл │
│ ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│ │Б. Лекарственные │- Общее число аэробных │
│ │растительные средства │ 5 │
│ │или растительное сырье │
бактерий не более 10 │
│ │"ангро",
применяемые без │
в 1 г или в 1 мл │
│ │термической обработки │- Общее число грибов - не│
│ │ │ 4 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в
│
│ │ │ 1 мл │
│ │ │- Отсутствие Escherichia │
│ │ │ coli - в 1 г или в
1 мл│
│ │ │- Отсутствие Salmonella в│
│ │ │ 10 г или в 10 мл │
│ │ │- Энтеробактерий - не
│
│ │ │ 3 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в
│
│
│ │ 1 мл │
└──────────┴───────────────────────────┴─────────────────────────┘
Таблица 2
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА
СУБСТАНЦИЙ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ
ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
┌──────────┬───────────────────────────┬─────────────────────────┐
│
Категория│ Применение │ Рекомендуемые нормы для │
│ │ │Госфармакопеи XII издания│
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 1
│ 2 │ 3 │
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│1.2. │Субстанции для │ │
│ │производства: │ │
│ │- Стерильных │- Общее число
аэробных │
│ │ лекарственных, средств │
бактерий и грибов │
│ │ │ (суммарно) │
│ │- Нестерильных │ 2 │
│ │ лекарственных средств, │
не более 10 в 1 г или │
│ │ относящихся к Категории 2│ в 1 мл │
│ │ │- Отсутствие
бактерий │
│ │ │ семейства │
│ │ │ Enterobacteriaceae
в │
│ │ │ 1 г или в 1 мл │
│ │ │ │
│ │- Нестерильных │- Отсутствие Pseudomonas │
│ │ лекарственных средств, │
aeruginosa в 1 г или в
│
│ │ относящихся к Категории │
1 мл │
│ │ 3 В │- Отсутствие │
│ │ │ Staphylococcus │
│ │ │ aureus в 1 г или в
1 мл│
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│2.2. │Субстанции синтетического │- Общее число аэробных │
│ │происхождения для │ 3 │
│ │производства нестерильных │
бактерий не более 10 в│
│ │лекарственных средств │
1 г или в 1 мл │
│ │ │- Общее число
грибов - не│
│ │ │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в 1│
│ │ │ мл │
│ │ │- Отсутствие Escherichia
│
│ │ │ coli - в 1 г или в
1 мл│
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│3.2. │Субстанции природного │- Общее число аэробных │
│ │происхождения │ 4 │
│ │(растительного,
животного │ бактерий не более 10 в│
│ │или минерального) │ 1 г или в 1 мл │
│ │ │- Общее число
грибов - не│
│ │ │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в
│
│ │ │ 1 мл │
│ │ │- Отсутствие Escherichia │
│ │ │ coli - в 1 г или в
1 мл│
│ │ │- Отсутствие Salmonella в│
│ │ │ 10 г или в 10 мл │
│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │
│ │ │ aeruginosa в 1 г
или в │
│ │ │ 1 мл │
│ │ │-
Отсутствие │
│ │ │ Staphylococcus aureus │
│ │ │ в 1 г или в 1 мл │
│ │ │- Энтеробактерий - не
│
│ │ │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в
│
│ │ │ 1 мл │
├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤
│4.2. │Вспомогательные материалы │- Общее число аэробных │
│ │(мука
пшеничная, крахмал, │ 3 │
│ │тальк и т.д.) │ бактерий не более 10 в
│
│ │ │ 1 г или в 1 мл │
│ │ │- Общее число
грибов - не│
│ │ │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в
│
│ │ │ 1 мл │
│ │ │- Отсутствие │
│ │ │ Escherichia coli - в │
│ │ │ 1 г или в 1 мл │
│ │ │- Отсутствие Salmonella в│
│ │ │ 10 г или в 10 мл │
│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │
│ │ │ aeruginosa в 1 г
или в │
│ │ │ 1 мл │
│ │ │-
Отсутствие │
│ │ │ Staphylococcus aureus в│
│ │ │ 1 г или в 1 мл │
│ │ │- Энтеробактерий - не │
│ │ │ 2 │
│ │ │ более 10
в 1 г или в
│
│ │ │ 1 мл │
└──────────┴───────────────────────────┴─────────────────────────┘
Примечания к таблицам 1 и 2:
- В фармакопейных статьях предприятия
(ФСП) могут быть указаны в виде исключения и другие нормативы
- При обнаружении других патогенных
бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств,
субстанций и вспомогательного материала не соответствует требованиям по
показателю "Микробиологическая чистота"
РАЗДЕЛ 2
ИСПЫТАНИЕ НА Enterobacteriaceae
Дополнение к разделу: "Выявление и
идентификация семейства Enterobacteriaceae"
общей ФС "Испытание на микробиологическую чистоту" ГФXI издания, выпуск 2, стр. 197-198.
2.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ Escherichia
coli и Salmonella
10 г или 10 мл испытуемого образца
помещают в 100 мл среды N 11, гомогенизируют и инкубируют при температуре 32.5
+/- 2.5 град. C в течение, как правило, двух часов, но не более пяти. В случае, если лекарственное средство - суппозитории или растворы в
маслах, в среду N 11 добавляют стерильный Твин-80 в количестве не более 5% и
стеклянные бусы для эмульгирования.
Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, используя для этого
среду N 3. В три пробирки с 10 мл среды N 3 вносят 1 мл гомогената
в первую, 1 мл разведения 1:10 во вторую и 1 мл разведения 1:100 в третью, то
есть соответственно 0.1 г, 0.01 г, 0.001 г образца. Посевы инкубируют при
температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают
пересев петлей на плотную среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри при той же температуре в
течение 18-24 ч. В случае появления характерных для Enterobacteriaceae
колоний грамотрицательных палочек определяют количество энтеробактерий
в 1 г или в 1 мл образца по Таблице 3.
Таблица 3
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
|
Количество
испытуемого образца
|
Вероятное
количество
бактерий в 1 г (мл)
|
|
0.1 г (мл)
|
0.01 г (мл)
|
0.001 г (мл)
|
|
|
1 мл
гомогената
|
1 мл гомогената
в разведении
1:10
|
1 мл гомогената
в разведении
1:100
|
|
|
+
|
+
|
+
|
Более 1000
|
|
+
|
+
|
-
|
От 100 до
1000
|
|
+
|
-
|
-
|
От 10 до 100
|
|
-
|
-
|
-
|
Менее 10
|
Обозначения: + - наличие роста бактерий
- - отсутствие роста бактерий
Количество клеток E.coli
в 1 г (мл) исследуемого лекарственного средства определяют, пользуясь также
данной таблицей.
2.2. ИСПЫТАНИЕ НА
НАЛИЧИЕ Escherichia coli и Salmonella
10 г (мл) образца лекарственного средства
вносят в 100 мл питательной среды N 11 (лактозный
бульон). В случае, если лекарственное средство -
жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубируют при
температуре (32.5+2.5) град. С в течение 2-5 ч. 10 мл среды N 11 переносят в
100 мл среды N 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5)
град. С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде N 3 (среда прозрачная,
цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии
сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста
испытания продолжают.
2.2.1. ИСПЫТАНИЕ НА E.coli
Со среды N 3 делают пересев петлей на
среду N 4 (агар Эндо) и
инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. C в течение 18-24 ч. На среде N
4 E.coli образуют, как правило, характерные малиновые
колонии с металлическим блеском или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные
на принадлежность к E.coli колонии микроскопируют. При обнаружении в мазках
грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках среду N 1 и
инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч. Из
пробирок с чистой культурой делают пересевы на среды N 14 (агар
Симмонса) и N 15 (бульон Хоттингера),
а также используют для теста на цитохромоксидазу.
Через 18-24 ч инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают
бактериальный рост или его отсутствие на средах N 14 и N 15. Утилизацию цитрата
устанавливают по изменению цвета среды N 14 из зеленого в синий.
Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды N
15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.
Если в образце обнаружены
грамотрицательные неспорообразующие палочки, не
обладающие ферментом цитохромоксидаза, не
утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное
средство контаминировано Escherichia coli.
2.2.2. ИСПЫТАНИЕ НА ВИДЫ Salmonella
1 мл обогащенной
культуры на среде N 3 вносят в пробирку с 10 мл среды N 12 (селенитовая среда)
и инкубируют при (32,5 +/- 2,5) град. С в течение 16-18 ч. Делают пересев
петлей на среду N 5 (висмут - сульфит агар) и
инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 24-48 часов. На среде N 5 Salmonella образует, как
правило, типичные черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом
участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на
принадлежность к Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках грамотрицательных
палочек отсевают на среду N 13 (трехсахарный агар с солями железа), нанося большое количество культуры
петлей сначала на скошенную часть агара, а потом
уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу,
используя чистую культуру со среды N 1. Через 18-24 часа
инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают изменение цвета среды из красного
в желтый только в столбике питательной среды. Почернение среды
свидетельствует об образовании сероводорода - типичном признаке видов Salmonella.
Если в образце обнаружены
грамотрицательные неспорообразующие палочки, не
обладающие ферментом цитохромоксидаза, не
ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что
лекарственное средство контаминировано Salmonella.
2.3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ
СРЕДЫ <*> И РЕАКТИВЫ
1. Среда N 11 (лактозный бульон)
- для предварительного
обогащения энтеробактерий
Состав:
Пептон ферментативный сухой - 8 г
Лактоза - 5 г
Вода дистиллированная - 1000 мл
______________________________________________________________
рН после стерилизации 6,9 +/- 0,1
2. Среда N 12 (селенитовая среда сухая) -
для накопления и выделения сальмонелл.
Готовят согласно прописи на этикетке.
3. Среда
N 13 (трехсахарный агар с
солями железа) - для
выявления
сероводорода
Состав:
Мясной экстракт - 3 г
Дрожжевой экстракт - 3 г
Пептон - 20 г
Лактоза - 10 г
Сахароза - 10 г
Глюкоза - 1 г
Железа сульфат - 0,2 г
Натрия хлорид - 5 г
Натрия тиосульфат - 0,3 г
Феноловый красный - 0,024 г
Агар - 15 г
Вода дистиллированная - 1000 мл
______________________________________________________________
Рн после стерилизации 7.3 +/- 0.2. Разливают в пробирки по 5-7 мл.
Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик
2-2,5 см.
4. Среда N 14 (цитратный
агар Симмонса)
Состав:
Натрия хлорид - 5 г
Магния сульфат - 0,2 г
Аммония дигидрофосфат - 1 г
Калия гидрофосфат - 1 г
Натрия цитрат - 3 г
Бромтимоловый
синий - 0,08 г
Агар - 20 г
Вода дистиллированная - 1000 мл
______________________________________________________________
рН после стерилизации 7,2 +/- 0.1
Приготовление: агар
расплавляют при нагревании в свежеприготовленной дистиллированной воде. Все
соли сначала растворяют в небольшом объеме воды, затем раствор добавляют к
расплавленному агару и доводят водой до 1000 мл.
Устанавливают рН, добавляют индикатор в виде 0,2% водного раствора в объеме 40
мл, хорошо перемешивают и разливают в пробирки по 5-7 мл. Стерилизуют при 121
град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см.
5. Среда N 15 (бульон Хоттингера)
- для определения индола.
Примечание: <*> - для испытания на
микробиологическую чистоту можно использовать аналогичные сухие питательные
среды отечественных и зарубежных производителей после их валидации.
Тест на индол
В пробирку со средой N 15, в которой
выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача или Эрлиха и слегка
встряхивают. При наличии индола наблюдают появление красного кольца на
поверхности среды в пробирке.
Реактив Ковача:
Спирт амиловый или изоамиловый - 75 мл
Пара - диметиламинобензальдегид - 5 г
Кислота хлористоводородная, конц. - 20 мл
Навеску альдегида растворяют в спирте при
легком нагревании (в водяной бане при 50-55 град. С), остужают и медленно
добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте. Реактив должен
быть желтого цвета.
Реактив Эрлиха:
Спирт этиловый 96% - 95 мл
Пара - диметиламинобензальдегид - 1 г
Кислота хлористоводородная, конц. - 20 мл
Навеску альдегида растворяют в спирте и
медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте.
РАЗДЕЛ 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ
НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Лекарственные средства, обладающие
антимикробным действием, могут подавлять рост отдельных видов бактерий и
грибов. Если исследуемое лекарственное средство оказывает ингибирующее действие
на микроорганизмы, которые выявляют в нестерильных лекарственных средствах,
необходимо адекватно инактивировать его во избежание неправильной оценки
результатов испытания на микробиологическую чистоту. Определение антимикробного
действия нестерильных лекарственных средств проводят с
использованием тест - микроорганизмов, полученных из Государственных коллекций.
3.1. ПОДГОТОВКА ТЕСТ - ШТАММОВ ДЛЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕСТЕРИЛЬНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ
СРЕДСТВ
1. Тест - микроорганизмы
1 2
Bacillus cereus ATCC 10702 (NCTC
8035)
Escherichia coli
ATCC 25922
4
Pseudomonas aeruginosa ГИСК
453
3
Staphylococcus aureus ATCC 6538-P(FDA 209-P)
Candida albicans ATCC 885-653
5
Aspergillus niger BKM F-1119
______________________________________________________________
1
ATCC
- Американская коллекция типовых культур
2
NCTC
- Национальная коллекция типовых культур, Великобритания
3
FDA -
Управление по контролю
качества пищевых продуктов и
лекарственных
средств, США
4
ГИСК - Всероссийский
музей патогенных бактерий (ГИСК им. Л.А.
Тарасевича), Россия
5
BKM
- Всероссийская коллекция микроорганизмов РАН, Россия
Тест - штаммы В. cereus,
E. coli, P. aeruginosa, S. aureus получают из Государственной Коллекции патогенных
микроорганизмов ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Штамм C.albicans получают из Российского Микологического Центра
(г. Санкт - Петербург), штамм A.niger - из ВКМ -
Всероссийской Коллекции микроорганизмов РАН (г. Москва). Культуры тест -
микроорганизмов могут быть получены также из ВКПМ - Всероссийской Коллекции
промышленных микроорганизмов. Используемые тест - штаммы должны быть типичными
по культурально - морфологическим и биохимическим
свойствам.
Тест -
штаммы бактерий хранят при температуре (5 +/- 1) град.
С в лиофилизированном
состоянии или под
слоем стерильного
вазелинового
масла на среде Романова следующего состава:
Панкреатический гидролизат
казеина 8.0 г
Натрия хлорид 5.0 г
Агар 10.0 г
Вода дистиллированная 1000.0 г
______________________________________________________________
рН после стерилизации 7.1 +/- 0.1
Тест - культуру C.albicans
хранят под слоем вазелинового масла на среде N 2 (агар
Сабуро), в которой количество агара
уменьшено до 1%. Тест - культуру A.niger хранят на
среде N 2 (агар Сабуро) (Госфармакопея, вып. 2, с. 200),
делая пересевы через каждые 3 месяца. Лиофилизированную
культуру тест - штамма из ампулы или культуру со среды хранения переносят в
пробирки с питательным бульоном: среда N 8 для бактерий, жидкая среда Сабуро - для C.albicans. Посевы
на среде N 8 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течении 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро
- при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч - для C.albicans. Посевы A.niger на
среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С до появления черных
или темно - коричневых экзогенных спор (конидий) в течении
5-7 сут.
Перед определением антимикробного
действия нестерильных лекарственных средств культуры тест - штаммов бактерий
отсевают на среду N 8 (питательный бульон) и инкубируют при температуре (32.5
+/- 2.5) град. С в течение
18-24 ч.
Культуры грибов выращивают заранее: C.albicans - на жидкой среде Сабуро
за 48 ч, а A.niger - на среде N 2 за 5-7 сут до начала определения.
3.2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РАСТВОРЫ
(Государственная
фармакопея XI издания,
выпуск 2, с. 193, 201, 208-209)
Среда N 8 - для выращивания бактерий.
Жидкая среда Сабуро
- для выращивания Candida
albicans.
Среда N 2 (агар Сабуро) - для выращивания Aspergillus
niger.
Среды NN 3-5 - для идентификации бактерий
семейства Enterobacteriaceae.
Среда N 9 - для идентификации Pseudomonas
aeruginosa.
Среда N 10 - для идентификации Staphylococcus
aureus.
Фосфатный буферный раствор с натрия
хлоридом и пептоном, рН 7.0
3.3. ПРОВЕДЕНИЕ
ИСПЫТАНИЯ
Готовят разведения лекарственного
средства 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, используя фосфатный буферный
раствор (для приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5% Твина-80).
Бульонные культуры бактерий и C.albicans разводят фосфатным буферным раствором не менее, чем 1:1000. Культуру A.niger
смывают со скошенного агара
фосфатным буферным раствором с 0.05% Твина-80. Определяют количество конидий в
1 мл смыва, используя камеру
Горяева или
чашечный агаровый метод, и
разводят до концентрации
3 4
10 - 10
КОЕ/мл.
Испытание проводят представленными в
3.3.1. и 3.3.2. методами определения антимикробного действия.
3.3.1. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ГОСФАРМАКОПЕИ
XI
Каждое разведение лекарственного средства
вносят по 1 мл в чашки Петри диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по
0.2 мл взвеси культуры B.cereus, a в оставшиеся - по
0.2 мл культуры C.albicans и A.niger.
В чашки с B.cereus вносят по 7-10 мл расплавленной
среды N 1 при температуре (47.5 +/- 2.5) град. С, в чашки с культурами C.albicans и A.niger - то же количество среды N 2.
Каждое разведение лекарственного средства
вносят по 1 мл в пробирки с 10 мл жидкой среды - N 3 и N 8. В пробирки со
средой N 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры E.coli,
в пробирки со средой N 8 - по 1 мл взвеси культур P.aeruginosa
и S.aureus, каждую отдельно. В контрольные чашки и
пробирки вместо разведений лекарственного средства вносят такое же количество
буферного раствора.
Посевы на средах N 1, 3, 8 инкубируют при
температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в
течение 2 сут (среды N 3, 8) и 5 сут
(среда N 1). Посевы на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/-2.5) град.
C в течение 5 сут. В случае, если при внесении
лекарственного средства в жидкие питательные среды (N 3, N 8) образуется
помутнение, препятствующее учету результатов, делают пересев со среды N 3 на
среду N 4 (агар Эндо), а со
среды N 8 - на среды N 9 и N 10. При росте типичных колоний E.coli
(среда N 4), P.aeruginosa (среда N 9) и S.aureus (среда N 10) отмечают наличие роста тест -
микроорганизма.
3.3.2. МЕТОД РЕПЛИКАЦИЙ (для водонерастворимых лекарственных средств). В стерильные
чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого лекарственного
средства. В контрольные чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют
для получения разведения. В чашки Петри (как в эксперименте, так и в контроле)
добавляют по 15-20 мл расплавленной и охлажденной до (47.5 +/- 2,5) град. С среды N 1, в другие - такое же количество среды N 2 и
быстро перемешивают. После застывания агара чашки
подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды.
На поверхность агара
бактериологической петлей или репликатором наносят бляшками инокулят
каждого тест - штамма бактерий и грибов на среды N 1 и N 2 соответственно.
Чашки со средой N 1 инкубируют при
температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч. Чашки со средой N 2
инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в
течение - 3-5 сут.
Учет результатов. После окончания сроков
инкубации посевов (появление типичного роста тест - микроорганизмов в
контрольных чашках без лекарственного средства) отмечают наличие или отсутствие
роста тест - штаммов бактерий и грибов на средах, в которые вносили различные
разведения лекарственного средства.
Наличие такого же роста тест -
микроорганизма, как в контроле, обозначают знаком "+", отсутствие
роста - знаком "-", слабый или замедленный
рост - знаком "+/-".
Отсутствие роста тест - микроорганизма на
среде с препаратом свидетельствует о том, что исследуемый препарат в данном
разведении обладает антимикробным действием в отношении определенного тест -
микроорганизма.
3.3.3. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ АНТИМИКРОБНОГО
ДЕЙСТВИЯ
Для устранения антимикробного действия
лекарственного средства используют различные методы: - 1) увеличивают
разведение лекарственного средства, 2) добавляют необходимое количество
соответствующего специфического инактиватора,
нейтрализующего антимикробное действие лекарственного средства, но не
угнетающего рост микроорганизмов - контаминантов
(например, бета - лактамазу - для пенициллинов и
цефалоспоринов, пара - аминобензойную
кислоту - для сульфаниламидов), 3) применяют неспецифический инактиватор следующего состава, используемого в качестве
растворителя:
Твин-80 - 30 г
Лецитин яичный - 3 г
L-гистидина гидрохлорид - 1 г
Пептон (мясной или казеиновый) - 1 г
Натрия хлорид - 4.3 г
Калия фосфат однозамещенный - 3.6 г
Натрия фосфат двузамещенный - 7.2 г
Воды дистиллированной - 1000.0 мл
Стерилизуют в паровом стерилизаторе
насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С
в течение 15 мин. Если антимикробное действие
полностью не устраняется, увеличивают концентрацию Твина-80 или лецитина.
Директор ИГКЛС НЦЭГКЛС
Минздрава России
профессор, академик МАИ
Н.С.ЕВТУШЕНКО
10 апреля 2001 г.
Председатель Государственного
Фармакопейного комитета,
профессор, чл.- корр. РАМН
А.П.АРЗАМАСЦЕВ
4 июля 2001 г.
Главный Ученый секретарь
Государственного Фармакопейного
комитета, доктор фарм. наук
В.Л.БАГИРОВА
4 июля 2001 г.