Оставьте ссылку на эту страницу в соцсетях:

Поиск по базе документов:

 

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации -

Первый заместитель

Министра здравоохранения

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

26 февраля 2002 г.

 

Дата введения:

1 мая 2002 г.

 

3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА

 

ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИННЫМ ШТАММАМ

СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ЛЮДЕЙ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУ 3.3.1.1112-02

 

1. Разработаны сотрудниками: Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Минздрава России (Т.И.Анисимова, Г.М.Сергеева, Л.В.Саяпина); Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" Минздрава России (И.В.Исупов, Р.А.Белобородов, С.А.Еремин); Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Минздрава России (Н.П.Буравцева, Е.И.Еременко, О.И.Цыганкова, О.И.Коготкова); Научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны РФ (В.В.Кожухов, В.И.Климов, Ю.И.Строчков).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. N 12 от 14 февраля 2002 г.).

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 26 февраля 2002 г., введены в действие с 1 мая 2002 г.

4. Введены взамен методических указаний "Основные критерии отбора сибиреязвенных вакцинных штаммов, предназначенных для изготовления сибиреязвенных вакцин для иммунизации людей", утвержденных Министерством здравоохранения СССР 22 февраля 1982 г.

 

1. Область применения

 

1.1. Методические указания "Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей" разработаны в помощь Государственным комиссиям при проведении приемочных испытаний новых вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба для иммунизации людей, а также для исследователей, занимающихся их разработкой.

 

2. Нормативные ссылки

 

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы:

2.1. Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

2.2. Методические указания "Основные критерии отбора вакцинных штаммов, предназначенных для изготовления сибиреязвенных вакцин для иммунизации людей", утвержденных Минздравом СССР 22.02.82.

2.3. РД 42-28-24-88 "Медицинские иммунобиологические препараты. Основные термины и определения".

2.4. РД 42-281-91 "Государственные приемочные испытания МИБП. Порядок проведения. Основные положения".

2.5. Положение о государственной регистрации, сертификации и государственном контроле за качеством медицинских иммунобиологических препаратов в Российской Федерации. Постановление ГКСЭН N 5 от 3.07.94.

2.6. Санитарные правила СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности".

2.7. Санитарные правила СП 3.3.2.561-96. 3.3.2. "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".

 

Введение

 

Сибирская язва относится к числу особо опасных инфекционных заболеваний. Для профилактики сибирской язвы в России применяют живую вакцину, поэтому требования к отбору, доклиническим испытаниям и оценке новых вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба должны быть строгими и информативными. Проведение испытаний безопасности и специфической активности живых сибиреязвенных вакцин на людях ограничено и может быть проведено только в случае установления в предварительных доклинических лабораторных исследованиях полной безопасности вакцинных штаммов.

Все испытания нового штамма, предлагаемого в качестве вакцинного, проводят в сравнении с эталонным вакцинным штаммом сибиреязвенного микроба СТИ-I.

На основании результатов Государственных лабораторных (доклинических) испытаний о соответствии штамма Вас. anthracis требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам данными методическими указаниями, одобренных национальным органом контроля (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) и Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), Министерство здравоохранения Российской Федерации разрешает проведение ограниченных клинических, затем Государственных испытаний живой вакцины, приготовленной на основе этого штамма на добровольцах. После утверждения Министерством здравоохранения испытуемого штамма в качестве вакцинного по результатам Государственных испытаний на добровольцах, одобренных Комитетом МИБП, дальнейшие этапы внедрения живой вакцины проводят в установленном порядке.

 

3. Общие положения

 

3.1. Для изготовления живой вакцины применяют штаммы сибиреязвенных бацилл, стабильно утратившие способность продуцировать капсулу в организме животных и на специальных питательных средах, апатогенные для человека, сельскохозяйственных животных и кроликов, проявляющие остаточную вирулентность для морских свинок и белых мышей.

3.2. При испытании новых сибиреязвенных вакцинных штаммов их оценка должна проводиться одновременно с эталонным вакцинным штаммом СТИ-I. Вакцинный штамм СТИ-I на основании многолетнего экспериментального изучения и широкого применения для вакцинации людей и сельскохозяйственных животных принят в качестве эталона. Лиофилизированные споровые культуры вакцинного штамма СТИ-I (маточную культуру и отраслевой стандартный образец вакцины СТИ) хранит и выдает Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Министерства здравоохранения РФ.

Основными критериями отбора вакцинных штаммов, предназначенных для вакцинации людей против сибирской язвы, являются безвредность, слабая реактогенность и иммуногенность. Культурально-морфологические, биохимические и другие признаки испытуемых штаммов сибиреязвенного микроба могут варьировать, но должны соответствовать видовым признакам штамма.

3.3. Все исследования с испытуемым штаммом, пока он не будет по настоящим критериям признан вакцинным (III группа), проводят в соответствии с санитарными правилами СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности" как с микрооганизмом, относящимся ко II группе патогенности. Данное положение не распространяется на варианты, полученные на основе вакцинного штамма СТИ-I.

 

4. Характеристика штамма по видовым признакам

 

Возбудителями сибирской язвы являются микроорганизмы рода Bacillus, вида anthracis. В. antracis - облигатный паразит, хемоорганотроф, метаболизм факультативно-аэробный, грамположительные, неподвижные палочки, образуют термоустойчивые эндоспоры.

4.1. Испытуемый сибиреязвенный штамм при посеве в бульон Хоттингера <*>, при рН 7,2-7,3 после суточной инкубации при температуре 35-37 град. С должен давать типичный для возбудителя сибирской язвы рост культуры у дна пробирки в виде "комка ваты", относительно трудно разбивающегося при встряхивании; в толще прозрачного бульона возможно наличие хлопьев растущей культуры. В мазках из суточных бульонных культур, окрашенных по Граму, морфологически типичные для возбудителя сибирской язвы грам-положительные палочки длиной 3-10 мкм и цепочки из этих палочек. В висячей капле - отсутствие подвижности бацилл.

4.2. При посевах на чашки Петри с питательным агаром Хоттингера <*> после суточной инкубации при температуре (36 +/- 1) град. С культура штамма должна вырастать в виде сухих, с "шагреневой" поверхностью колоний, с неровными краями, характерных для R или RO-формы, не должно быть гладких S-форм колоний.

--------------------------------

<*> Бульон и агар Хоттингера готовят по МУК 4.1/4.2.588-96, с. 45-46.

 

В мазках из агаровых культур должны обнаруживаться грам-положительные бациллы, обычно группирующиеся более короткими цепочками, чем в мазках из бульонных культур.

4.3. При посеве испытуемого сибиреязвенного штамма на агар Хоттингера в чашках Петри с добавлением 5%-ной дефибринированной крови кролика или барана не должно наблюдаться гемолиза. При посеве 1 капли (0,05 мл) взвеси, содержащей 100-200 тысяч спор, неантибиотикорезистентного штамма в пробирки с питательным бульоном, разлитым по 5-7 мл и содержащим 1000 ед/мл пенициллина, не должно быть роста культуры испытуемого сибиреязвенного штамма через 20-24 ч инкубации при температуре (36 +/- 1) град. С.

4.4. При посеве 3-часовой бульонной культуры неантибиотико-резистентных сибиреязвенных штаммов на агар Хоттингера в чашках Петри с добавлением к среде 0,5 и 0,05 ед/мл пенициллина через 2,5-3 ч. инкубирования при температуре (36 +/- 1) град. С должен проявляться рост культуры, наблюдаемый при фазово-контрастной микроскопии в виде шаров, соединенных в цепочки - "феномен ожерелья". Необходим контрольный посев изучаемой 3-часовой бульонной культуры на тот же агар без добавления пенициллина; рост должен быть типичным для возбудителя сибирской язвы.

4.5. На плотной питательной среде Гладстона-Фильда (состав среды приведен в п. 1 прилож. 1) или на питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса или рыбокостной муки, принятой для изготовления живой споровой вакцины (РП N 831-98), через 4 сут. инкубации при температуре 33-35 град. С в мазках из выросшей культуры должно быть не менее 90% типичных сибиреязвенных спор по отношению к общему числу бацилл. Мазки окрашивают по методу Циля-Нильсена или Ребигера <*>. Методика определения концентрации спор приведена в п. 2 прилож. 1.

--------------------------------

<*> Методика окрашивания мазков по Цилю-Нильсену и Ребигеру приведена в Инструкции и методических указаниях по клинической и лабораторной диагностике, лечению и профилактике сибирской язвы у людей (Саратов, 1970. С. 56-57).

 

4.6. В испытуемой культуре вакцинного штамма должно выявляться методом микрокультур не менее 90% живых спор, высевом - не менее половины. Методика определения приведена в п. 2 прилож. 1.

4.7. Оценка генетической и фенотипической полноценности сибиреязвенных штаммов, как вакцинных по детерминантам и факторам иммуногенности и вирулентности.

4.7.1. Определение присутствия плазмиды рХ01 в вакцинном штамме.

Вакцинный штамм должен содержать плазмиду рХО1 или клонированные гены, ответственные за синтез ПА. Плазмида рХО1 (110 МД) кодирует синтез сибиреязвенного токсина, состоящего из ПА - протективного антигена, ЛФ - летального фактора, ОФ - отечного фактора. ПА является основным иммуногенным фактором. Методика определения приведена в п. 3 прилож. 1.

4.7.2. Определение отсутствия у штамма капсулы при культивировании на питательных средах.

В посевах культур испытуемого штамма на чашки Петри со средой Шефера (сыворотка крови лошади, свернутая при температуре 80 град. С в течение 48 ч.) или на 1%-ном бикарбонатном агаре (агар Хоттингера с 1%-ной питьевой содой) после инкубации в течение 2 сут. при температуре 37 град. С в анаэростате должен наблюдаться рост шероховатых матовых колоний, сходных с R-колониями на обычных питательных средах; в мазках из колоний должны обнаруживаться только бациллы, лишенные капсулы. Должны полностью отсутствовать гладкие, блестящие колонии, содержащие капсульные формы бацилл.

В жидкой среде ГКИ (60% раствора Хенкса с 40% сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56 град. С 30 мин., рН 7,2-7,3) должен быть рост только бескапсульных палочек. Для выявления капсулообразования посевы, закрытые резиновыми пробками, инкубируют 16-18 ч при температуре 37 град. С. Мазки из культур фиксируют метиловым спиртом с 10%-ным формалином и окрашивают раствором метиленового синего по Леффлеру. Для контроля качества сред и условий культивирования таким же образом следует провести посевы капсулообразующего штамма 71/12 2-й вакцины Ценковского.

4.7.3. Определение отсутствия у испытуемого штамма плазмиды рХО2, кодирующей синтез капсулы, с использованием метода электрофореза ДНК в агарозовом геле.

Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба не должен иметь в своем геноме плазмиды рХО2, кодирующей синтез капсулы. Определение отсутствия у штамма плазмиды рХО2 проводят по методике, изложенной в п. 4.7.1., одновременно с определением плазмиды рХО1.

На фотографии агарозного геля у испытуемого штамма и контрольного вакцинного штамма СТИ-I должна отсутствовать полоска, соответствующая по размеру ДНК плазмиде рХО2 (60 МД). В качестве контроля используют штамм В. anthracis KM 34 рХО2+, pXO1- или аналогичный, несущий только плазмиду капсулообразования и не содержащий в своем геноме плазмиду pXO1 (110 МД), ответственную за синтез сибиреязвенного токсина.

4.7.4. Определение наличия pag-гена, кодирующего токсинообразование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба должен содержать pag-ген плазмидной или иной локализации.

Определение наличия pag-гена приведено в п. 4 прилож. 1.

4.8. Характеристика основных свойств эталонного вакцинного штамма сибиреязвенного микроба СТИ-I.

 

Таблица 1

 

NN
пп

Признаки         

Характеристика       

1.

Морфология                 

палочки, споры                

2.

Подвижность                

отсутствует                   

3.

Окраска по Граму           

грамположительная             

4.

Рост на МПБ                

"комок ваты" в прозрачном     
бульоне                       

5.

Рост на плотных питательных
средах                     

R и RO-формы с типичными      
"локонами", в виде "головы    
медузы" или "львиной гривы"   

6.

Гемолиз на агаре Хоттингера
с 5% дефибринированной крови

отсутствует                   

7.

Рост на агаре Хоттингера с 
пенициллином               

"феномен ожерелья"            

8.

Наличие капсулы            

отсутствует                   

9.

Наличие плазмиды pXO1      

имеется                       

10.

Наличие pag-гена           

имеется                       

11.

Наличие плазмиды рХО2      

отсутствует                   

12.

Наличие cap-гена           

отсутствует                   

 

5. Оценка безвредности штамма как вакцинного

 

5.1. Вакцинные штаммы сибиреязвенного микроба относятся к III группе патогенности. Они безвредны для людей, сельскохозяйственных животных, кроликов, но обладают определенной степенью остаточной вирулентности для морских свинок и мышей; в больших дозах могут убивать этих животных. Поэтому испытание безвредности аттенуированных штаммов сибиреязвенного микроба, перспективных в качестве вакцинных, проводят на мышах, морских свинках, кроликах, овцах и козах, а также по отсутствию у них полноценного гена, кодирующего патогенность (синтез капсулы). Методики подготовки животных и проведение исследований приведены в прилож. 2.

5.2. Величина LD50 для белых беспородных или инбредных мышей C57BL испытуемой культуры не должна статистически значимо отличаться от LD50 эталонного вакцинного штамма СТИ-I. Количество погибших мышей с септицемией после введения испытуемого штамма должно быть близким к числу погибших от введения контрольного штамма. В мазках-отпечатках из органов мышей должны обнаруживаться только бескапсульные формы.

    5.3.  Показатель  летальности  морских  свинок. До 50% морских

                            7

свинок,   привитых    5 x 10    живых   спор   вакцинного   штамма

сибиреязвенного  микроба, могут погибать с генерализацией микробов

                                       6

по  всем органам, тканям и крови. От 10  живых спор могут погибать

единичные   животные.  У  погибших  животных  в  области  инъекции

наблюдают   воспалительный  отек,  часто  он  распространяется  на

область  паха  и  брюшной  стенки.  Возможны изъязвления в области

               4     2

инъекции. От 10  и 10  спор должны выжить все морские свинки.

    5.4.  Клинические  проявления  реакции  на  введение  споровой

                                              7

культуры  испытуемого  штамма  в дозах  5 x 10  спор заключаются в

развитии  у  большинства  привитых  свинок воспалительного отека в

области  инъекции  с  большим  или меньшим распространением его на

область  паха  и  брюшной  стенки.  Возможны изъязвления в области

инъекции.  Эти отеки указывают на наличие остаточной вирулентности

у   испытуемой   культуры   и   косвенно   свидетельствуют   о  ее

иммуногенности.    Ведение   сибиреязвенного   вакцинного   штамма

сопровождается   незначительным   повышением   температуры   тела.

Допустимо  повышение  на  1,5-2 град. С  в  зависимости  от  дозы.

Температура  тела повышается главным образом у животных, которые в

дальнейшем  погибают  от  сибиреязвенного  штамма.  За 1-2 сут. до

гибели наблюдается снижение температуры на 1-2 град. С ниже нормы.

В   первые   трое-пять     суток    после   введения    вакцинного

                                        2         7

сибиреязвенного штамма во всех дозах (10  - 5 x 10  спор) возможно

снижение массы тела морских свинок до 1/5 от исходной величины. На

7-10-е сутки начинается восстановление массы тела.

    5.5.    Вакцинный   штамм   сибиреязвенного   микроба   должен

размножаться  в организме морских свинок в течение первых 15 сут.,

обусловливая  тем  самым  иммунологическую  перестройку организма.

Бациллы  испытуемой  культуры  могут  быть  выделены регулярно и в

значительном   количестве  из  лимфатических  узлов  и  внутренних

                                 7

органов животных, привитых 5 x 10  спор, забитых, начиная с 1 сут.

после  введения  и до 3-5-го дня. В более поздние сроки высевы при

этой   иммунизирующей   дозе   бывают   скудными   и   не   всегда

положительными  из  отечной  жидкости  в  области инъекции микробы

испытуемого   штамма   могут  выделяться  в  течение  всего  срока

наблюдения  (до  30  сут.). Посевы крови из сердца могут дать рост

                          7                                     6

культуры  при  дозе 5 x 10  до 30% и более случаев. При дозах 10 ,

  4       2

10   и  10  спор  рост  культуры сибиреязвенного вакцинного штамма

наблюдается редко и в виде изолированных колоний.

5.6. Определение безвредности штаммов для кроликов.

5.6.1. Клинические наблюдения. Местная реакция может наблюдаться у кроликов в течение первых 10 сут. в виде гиперемии кожи и незначительного уплотнения: (1х1) см или (1,5х2) см. Лишь у одной трети животных могут наблюдаться незначительные отеки и пастозность кожи места инъекции, рассасывающиеся без образования язв или абсцессов. Температура тела у кроликов повышается незначительно. Масса тела животных, как правило, не снижается.

5.6.2. Определение приживаемости и распространяемости штаммов по органам и тканям. Культура вакцинного штамма сибиреязвенного микроба выделяется от большинства кроликов в течение первых двух-трех недель и более из места введения, реже - из лимфатических узлов. Из внутренних органов она может быть выделена в первые 5 сут. в незначительном количестве и нерегулярно. Допускается выделение единичных колоний из легкого или крови от 1-2 кроликов из 10 взятых в опыт в течение первых трех суток. В мазках-отпечатках органов должны обнаруживаться только бескапсульные бациллы.

5.7. Определение безвредности штамма для овец и коз.

5.7.1. Определение реактогенности по клиническим наблюдениям. В первые сутки после вакцинации может наблюдаться повышение температуры тела большинства животных в течение первых суток, как правило не превышающее 1 град. С. К концу недели температура тела у овец достигает исходной величины. Лишь у единичных овец температура может повыситься на 2 град. С и сохраняться выше нормы до 10-14 сут. Все овцы и козы должны выжить без клинических проявлений инфекционного процесса при наблюдении за ними в течение 20 дней. Общая и местная реакция у овец и коз на введение испытуемого штамма не должна существенно отличаться от реакции после введения контрольного вакцинного штамма.

5.7.2. Определение приживаемости и распространяемости штаммов по органам и тканям. Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба может выделяться от овец и коз в течение 20-30 сут. из места введения и регионарного лимфатического узла. Из внутренних органов бациллы вакцинного штамма выделяются редко в течение первых 5-7 сут. Допускается выделение вакцинного штамма из крови и легких овец не более, чем от одного из 10 животных до 3 сут. в виде единичных колоний.

5.8. Оценка безвредности нового вакцинного штамма по данным патоморфологических исследований.

5.8.1. Испытуемый штамм не может быть признан вакцинным, если он в одних и тех же дозах и при прочих равных условиях вызывает у привитых животных с большей частотой или более интенсивные и распространенные изменения, чем штамм СТИ-I.

5.8.2. Патоморфологическая оценка безвредности испытуемых штаммов в опытах на морских свинках.

                                                            6

    5.8.2.1.  Место  введения.  После  введения  дозы  в  10  спор

макроскопически  через  1  сут.  и в последующие сроки наблюдается

более  или  менее выраженная гиперимия кожи, подкожной клетчатки и

подлежащих    мышц   с   резким   расширением   венозных   сосудов

("инъекция").  С 3 суток может присоединиться у отдельных животных

значительно       выраженное      серозно-геморрагическое      или

желатинозно-геморрагическое    пропитывание     тканей   эксудатом

(воспалительный   отек)   и   очаговые,  иногда  довольно  крупные

кровоизлияния.  Воспалительный  отек тканей может распространяться

на  стороне  введения  на  область  паха, боковую стенку брюшка и,

отчасти, грудную клетку.

Такие изменения наиболее выражены через 3-5 сут. после введения культуры, а затем быстро стихают. В более поздние сроки у единичных животных могут наблюдаться небольшие фокусы нагноения, которые через 21-30 сут. принимают характер осумкованных абсцессов. У отдельных животных могут встречаться кожные свищи с опорожнением гнойных полостей и развитием обширного участка рубцевания тканей.

    Вышеперечисленные   изменения   в  тканях  на  месте  введения

                       6

допустимы при дозе в 10  спор, но не при меньших дозах и не должны

превышать наблюдаемые при действии эталонного штамма СТИ-I.

Недопустимым и следует считать систематически наблюдаемое слишком резко выраженное развитие воспалительного отека, распространяющегося на противоположную сторону туловища, включая верхнюю часть грудной клетки, а также обширные и глубокие некротические и гнойные изменения на месте введения. Такие изменения характерны для морских свинок, погибших в ходе опытов. Крупные и плотные скопления микробов с распространенным некрозом или нагноением в тканях нужно считать недопустимыми у умерщвленных животных.

    5.8.2.2.  Регионарные  лимфатические  узлы.  В  остром периоде

                                                                 6

процесса  (1-7-е сут.) у большинства животных, особенно в дозе 10

спор,   могут  отмечаться  макроскопически  умеренное  увеличение,

уплотнение   и   полнокровие   регионарных   лимфатических  узлов,

выраженные соответственно величине дозы и интенсивности процесса в

тканях  на  месте введения. У единичных животных может наблюдаться

значительный     серозно-геморрагический    периаденит;    паховые

лимфатические  узлы  могут  быть  вовлечены в зону воспалительного

отека  на месте введения. В поздние сроки (14-30-е сут.) допустимы

рубцовые   изменения   в  клетчатке  вокруг  лимфатических  узлов.

Патогистологически   наблюдается  картина  умеренно,  в  отдельных

случаях    значительно    выраженного    острого   серозного   или

серозно-геморрагического лимфаденита без очагов некроза, нагноения

и  микробных  скоплений.  В  более  поздние  сроки  (14-30-е сут.)

преобладают   гиперпластические   изменения  лимфоидной  ткани,  у

отдельных   животных  могут  встречаться  подострые  и  остаточные

явления  воспаления в виде небольших участков грануляционной ткани

без  значительных  фокусов  некроза  и нагноения в центре, а также

слабовыраженных      склеротических      процессов.      Описанные

патогистологические изменения допустимы во всех испытуемых дозах.

Недопустимы макроскопически и гистологически регистрируемые типичные геморрагические лимфадениты с некрозами, очагами гнойного расплавления и скоплениями микробов.

5.8.2.3. Отдаленные лимфатические узлы. В остром периоде процесса, особенно при значительных изменениях на месте введения, в контралатеральных, а также в подмышечных лимфатических узлах со стороны первичного аффекта могут наблюдаться умеренное увеличение и полнокровие. Гистологически отмечается переходящий серозный лимфаденит. В более позднем периоде процесса и в остальных отдаленных узлах характерны, гиперпластические изменения лимфоидной ткани. Во всех дозах недопустимы значительно выраженные серозно-геморрагические лимфадениты и периадениты, а также некрозы, нагноения и микробные скопления в узлах.

    5.8.2.4.  Легкие.  В  остром периоде процесса у части животных

допустимо  умеренно выраженное неравномерное полнокровие легких, а

во  все  сроки  наблюдения  - наличие западающих участков легочной

ткани  несколько  пониженной  воздушности.  При  всех дозах в ряде

случаев  могут  встречаться  немногочисленные мелкоточечные, редко

более крупные свежие кровоизлияния под плеврой. Гистологически при

этом  имеется  неравномерная  воздушность легочной ткани и участки

интерстициальной   инфильтративной   реакции  за  счет  накопления

мононуклеарных   элементов   с   редкими   полиморфонуклеарами   и

микроскопическими  кровоизлияниями.  У  отдельных  животных  после

            6

введения  10  спор, но не меньших доз, допустимо наличие единичных

мелких  (не  крупнее  милиарных)  очагов уплотнения темно-красного

цвета.    Гистологически   эти   изменения   характеризуются   как

катаральная, катарально-десквамативная мелкоочаговая пневмония без

значительной выраженности геморрагического компонента.

Недопустимо наличие крупных сливных очагов эксудативной пневмонии, обширных геморрагических изменений, а также очагов некроза, абсцедирования, скопления микробов, гранулем, выраженных склеротических процессов.

5.8.2.5. В печени допустима умеренно выраженная неравномерная зернистая дистрофия с некробиозом отдельных печеночных клеток, иногда единичными мелкими очажками некробиоза и слабо выраженной клеточной инфильтрацией по ходу сосудов, а также умеренное венозное полнокровие. Недопустимы макро- и микроскопические признаки резко выраженной токсической (зернистой в сочетании с жировой) дистрофии, очаги некроза, множественные крупные очаги некробиоза, скопления микробов, крупные геморрагии и гнойные изменения.

    5.8.2.6.  Селезенка.  В  остром  периоде  вакцинальной реакции

допустимо умеренное увеличение органа (не более чем в 1,5-2 раза),

                                       6

незначительное полнокровие. При дозе 10  спор у отдельных животных

при  разрезе может наблюдаться небольшой соскоб пульпы селезенки с

поверхности  разреза. Гистологически допустимы умеренно выраженные

явления   острого   инфекционного   спленита,  небольшая  редукция

мальпигиевых  телец,  а  в  более  поздние  сроки  их гиперплазия.

Сочетание  дряблой  консистенции,  уменьшения  размера  на  1/3  и

малокровия  органа  является  неблагоприятным  признаком,  который

характерен  для  погибших  морских свинок. Гистологически при этом

наблюдается  резко  выраженный  спленит с некрозом и некробиозом в

пульпе  и  резко  выраженной  редукцией  мальпигиевых телец. Такие

                                                        6

изменения  допустимы лишь у единичных животных в дозе 10  спор, но

не при меньших дозах.

Недопустимы резкое увеличение селезенки с обильным соскобом пульпы с поверхности разреза, очаги некроза, крупные очаги некробиоза, гранулемы с некротическим центром, фокусы нагноения, скопления микробов, крупные очаги геморрагий в ткани и под капсулой.

    5.8.2.7.  Сердце.  Наличие макроскопических изменений сердца и

его  оболочек  (кровоизлияния под оболочки и пр.) недопустимо. При

                                           6

гистологическом  исследовании  при  дозе 10  спор и в меньшей мере

при   остальных   дозах  у  животных  может  наблюдаться  умеренно

выраженная   зернистая   дистрофия   миокарда,   а   также  мелкие

гистиоцитарные  инфильтраты  в интерстиции, эндокарде. Недопустимы

значительные   дистрофические   изменения   миокарда   и   крупные

множественные    воспалительные    инфильтраты   (интерстициальный

миокардит).

5.8.2.8. Почки. Во всех дозах допустимо застойное полнокровие почек, небольшие единичные гистиоцитарные инфильтраты в интерстиции, умеренная неравномерная зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев. Недопустимы резко выраженные дистрофические и некробиотические изменения канальцев (некротический нефроз), некрозы клубочков и выход эритроцитов в просвет капсулы (очаговый геморрагический нефрит).

5.8.2.9. Надпочечники. Макроскопически у части животных в остром периоде процесса при всех дозах может наблюдаться застойное полнокровие и незначительное увеличение размеров. Гистологически часто отмечается обеднение липоидами коры надпочечников, снижение феохромии клеток мозгового вещества. Эти изменения допустимы. Недопустимы резко выраженные дистрофические изменения, очаги некроза, скопления микробов.

5.8.2.10. Костный мозг. Допустимы застойное полнокровие венозных синусов и явления гиперплазии миэлоидной ткани, плазмоцитарная реакция. Недопустимы очаги некроза и гнойного расплавления, скопления микробов.

5.8.3. Морфологическая оценка безвредности испытуемых штаммов в опытах на кроликах.

5.8.3.1. Место введения. В остром периоде болезни через 1 сут. в подкожной клетчатке бедра развивается ограниченный воспалительный инфильтрат и локальное полнокровие вен. Макро- и микроскопически отмечается умеренное серозное пропитывание подкожной клетчатки, фасций и мышц, которые в последующие сроки приобретают серозно-геморрагический характер, и процесс может распространяться на паховую клетчатку этой же стороны тела. После 14 сут. у отдельных животных могут наблюдаться ограниченные небольшие абсцессы (до 1,5-2 см в диаметре), иногда осумкованные, изъязвления на коже, свищи, рубцовые процессы. Эти изменения являются допустимыми. Недопустимы бурно развивающийся обильный серозный или серозно-геморрагический воспалительный отек с обширным распространением на паховую область другой половины тела и брюшко, а также крупные очаги некроза и нагноения в клетчатке и подлежащих мышцах, массивные кровоизлияния. Гистологически недопустимо наличие обширных некрозов и плотных микробных скоплений среди них.

5.8.3.2. Регионарные лимфатические узлы. В паховых и подвздошных узлах со стороны места введения испытуемых культур могут наблюдаться увеличение и полнокровие. Особенно увеличиваются размеры подвздошных узлов (до 1 см в диаметре). У отдельных животных может наблюдаться небольшой серозный перитонит. Умеренное увеличение и уплотнение узлов может сохраняться в поздние сроки. Гистологически допустим умеренно выраженный серозный лимфаденит с небольшими геморрагическими проявлениями, в поздние сроки - гиперпластические процессы. Макро- и микроскопически недопустимы очаги некроза, нагноения, обширные скопления микробов в лимфатических узлах.

5.8.3.3. Отдаленные лимфатические узлы. После 7 сут., иногда в более ранние сроки отмечается некоторое увеличение и небольшое полнокровие отдаленных узлов. Гистологически преобладают гиперпластические процессы в лимфоидной ткани. У отдельных животных допустимы слабо выраженные явления очагового серозного лимфаденита с небольшими геморрагическими проявлениями в подвздошном лимфатическом узле на стороне места введения. Недопустим системный серозно-геморрагический лимфаденит (полиаденит) с поражением ряда групп отдаленных узлов. Гистологически недопустимы значительно выраженные серозно-геморрагический лимфаденит и периаденит.

5.8.3.4. Легкие. Постоянно наблюдается умеренное неравномерное полнокровие легких. В отдельных случаях могут отмечаться мелкопятнистые кровоизлияния под плеврой. Гистологически может быть умеренное полнокровие, неравномерная незначительная эмфизема, некоторое усиление фоновой интерстициальной реакции. Недопустимы макро- и микроскопические очаги экссудативной пневмонии, некрозы, гранулемы.

5.8.3.5. Печень. Макро- и микроскопически в остром периоде процесса постоянно отмечается полнокровие органа и признаки умеренно выраженной зернистой дистрофии. Гистологически допустимы признаки умеренной зернистой дистрофии, изредка - единичные мелкие очаги некробиоза. Недопустимы резко выраженные диффузные альтеративные изменения типа токсической дистрофии печени, очаги некроза и некробиоза, микробные скопления.

5.8.3.6. Селезенка. Допустимы умеренное полнокровие и небольшое увеличение органа. Гистологически в ранние сроки могут наблюдаться признаки слабовыраженного спленита с полнокровием и гиперплазией клеток красной пульпы, небольшой редукцией мальпигиевых телец. В более поздние сроки преобладают умеренно выраженные гиперпластические процессы клеток белой пульпы. Недопустимы резко выраженные явления инфекционного спленита с некробиозом и некрозом клеток пульпы, значительной редукцией мальпигиевых телец, микробными скоплениями, в поздние сроки - гранулемы.

5.8.3.7. Почки. Допустимы умеренное неравномерное полнокровие и зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев. Недопустимы резко выраженные дистрофические и некробиотические изменения эпителия извитых канальцев и капиллярных петель клубочков почек.

5.8.3.8. Надпочечники. Макроскопически не изменены. Гистологически допустимы неравномерное полнокровие, некоторое обеднение липоидами клеток коры и снижение феохромии клеток мозгового вещества. Недопустимы резко выраженные дистрофические изменения, очаги некроза, микробные скопления.

5.8.3.9. Сердце. Допустимы неравномерное полнокровие вен миокарда и небольшая или умеренно выраженная зернистая дистрофия волокон миокарда в остром периоде процесса, мелкие гистиоцитарные инфильтраты по ходу сосудов и в интерстиции. Недопустимы значительно выраженные дистрофические и воспалительные изменения.

5.8.4. Оценка безвредности испытуемых штаммов по морфологическим признакам на овцах и козах.

5.8.4.1. Место введения. Макроскопически отмечается ограниченный подвижный инфильтрат в подкожной клетчатке с небольшой припухлостью кожи несколько уплотняющийся к 3-5-м суткам после введения культур. Фокусы воспалительной реакции довольно быстро рассасываются, но могут сохраняться до 7 сут. в виде небольшой припухлости. Гистологически наблюдаются ограниченные участки серозного пропитывания дермы и подкожной клетчатки, полнокровие сосудов, в более поздние сроки - небольшие рубцовые изменения, очаговые инфильтраты по ходу сосудов. Недопустимы крупные плотные воспалительные инфильтраты без склонности к резорбции, очаги некроза и нагноения, крупные геморрагии, скопления микробов.

5.8.4.2. Регионарные лимфатические узлы. Допустимо умеренное увеличение, набухание, полнокровие узлов в течение 7 сут. Гистологически отмечаются явления серозного лимфаденита без значительных геморрагий и очагов некроза. Недопустимы изменения, характерные для типичных лимфаденитов с выраженным периаденитом, значительные геморрагические изменения, некрозы, скопления микробов.

5.8.4.3. Отдаленные лимфатические узлы и внутренние органы.

Допустимы изменения кровенаполнения, связанные с умерщвлением животных, некоторое увеличение лимфатических узлов. Другие макроскопические изменения, имеющие отношение к введению испытуемых штаммов недопустимы. Гистологически допустимые процессы гиперплазии лимфоретикулярных элементов во внутренних органах.

Недопустимо наличие выраженных дистрофических и воспалительных изменений.

 

6. Определение влияния штамма на иммунную систему

 

Цель проведения испытания заключается в выявлении возможных иммунологических нарушений в организме после введения культуры исследуемого штамма. Нарушения иммунной системы могут приводить к развитию вторичного иммунодефицита, быть причиной изменений иммуногенной реактивности организма на другие неродственные антигены, лежать в основе неполноценного специфического ответа на сам штамм. Методы определения действия вакцинного штамма на иммунную систему приведены в прилож. 3.

                                                                 6

    6.1.  Испытуемый  штамм сибиреязвенного микроба в дозе 1 x 10

спор  в  объеме  1  мл  при  подкожном введении кроликам не должен

оказывать   повреждающее  действие  на  иммунную  систему:  должен

вызывать  умеренное повышение количества лимфоцитов, находящихся в

S + G2 + М  фазах клеточного цикла,  статистически не отличающиеся

от показателя наблюдаемого для вакцинного штамма СТИ-I.

    6.2. Введение в макроорганизм митогена или антигена индуцирует

пролиферацию  лимфоцитов, т.е. деление этих клеток. Предполагается

прямая   зависимость  между  степенью  выраженности  специфической

трансформации  лимфоцитов  в условиях in vitro (показатель РБТЛ) и

специфического  клеточного  иммунного  ответа  организма на данный

антиген.  Индекс  стимуляции реакции бласттрансформации лимфоцитов

(ИС  РБТЛ)  для испытуемого штамма должен быть в 1,5-2 раза выше с

                                                  6

лимфоцитами  кроликов,  иммунизированных  1  x  10   спор, чем для

интактных  лимфоцитов под воздействием неспецифических митогенов и

ЛПС   сибиреязвенного   микроба.   Уровень   стимуляции  РБТЛ  для

испытуемого  штамма  не  должен быть статистически значимо ниже ИС

РБТЛ для вакцинного штамма СТИ-I.

    6.3.   Цитотоксический   индекс  (ЦТИ)  у  кроликов,  привитых

                  6

подкожно  1  x  10   спор  испытуемого штамма, не должен быть ниже

показателя ЦТИ, чем у привитых эталонным вакцинным штаммом СТИ-I.

                                                            6

    6.4.  Макрофаги  кроликов,  привитых  подкожно  1  x  10  спор

испытуемого  штамма,  не  должны  иметь  более низкие показатели -

процента  фагоцитирующих  клеток  (ПФ) и фагоцитарного числа (ФЧ),

определяемого   количеством   фагоцитированных  микробов  на  один

фагоцит, а также абсолютного фагоцитарного показателя (АФП), чем у

привитых этой же дозой эталонного вакцинного штамма СТИ-I.

    6.5. Испытуемый вакцинный штамм сибиреязвенного микроба в дозе

        6

1  x  10   спор не должен подавлять развитие клеточного иммунитета

(по    реакции    гиперчувствительности   замедленного   типа)   и

гуморального  (по уровню титров антител) иммунного статуса у белых

мышей  на гетерологичный антиген. Допускается минимальное снижение

иммунного  ответа,  но  не  больше  чем  при  введении в этой дозе

эталонного вакцинного штамма СТИ-I. Методика определения приведена

в п. 6 прилож. 3.

 

7. Стабильность биологических свойств вакцинного штамма

 

Стабильность испытуемого штамма, в первую очередь по безвредности и утрате патогенности, свойственной сибирской язве, оценивают по результатам многократных пассажей на питательных средах, способствующих капсулообразованию сибиреязвенных бацилл, а также в опытах на морских свинках и белых мышах. Методика определения стабильности биологических свойств вакцинного штамма сибиреязвенного микроба приведена в прилож. 4.

7.1. Двадцатикратные пересевы вакцинного штамма на питательной среде ГКИ, а также 10-кратные пассажи через организм белых мышей и морских свинок не должны приводить к появлению даже единичных капсульных бацилл. Штамм должен соответствовать п. 4.7. настоящих МУ.

7.2. Десятикратные пассажи вакцинного штамма через организм белых и черных мышей и морских свинок не должны приводить к реверсии его вирулентности. Степень остаточной вирулентности пропассированного испытуемого штамма, как и эталонного вакцинного должна соответствовать п. 5.2. для мышей, п. 5.3.-5.5. - для морских свинок и п. 5.6. - для кроликов.

 

8. Иммуногенность испытуемого штамма в опытах на

лабораторных животных и овцах

 

Методы определения иммуногенности сибиреязвенных вакцинных штаммов оценивают в опытах на морских свинках, кроликах и овцах приведены в прилож. 5.

    8.1.  Индекс иммунитета испытуемого штамма для морских свинок,

                              7

иммунизированных  дозой 5 x 10  спор, должен быть не менее индекса

для  эталонного  вакцинного  штамма сибиреязвенного микроба СТИ-I,

который  для этого штамма должен быть не менее 10000 при заражении

иммунизированных свинок сибиреязвенным микробом 71/12.

                                                            7

    8.2.  Выживаемость  кроликов,  иммунизированных  5  x 10  спор

испытуемой  культуры,  должна  быть не ниже выживаемости животных,

привитых    этой    же    дозой   эталонного   вакцинного   штамма

сибиреязвенного  микроба  СТИ-I.  Не менее 5 из 10 вакцинированных

кроликов   должны  выжить  после  заражения  50  LD50  вирулентной

споровой  культуры  В.  antrhracis  при  гибели  от  специфической

инфекции в первые 2-3 сут. всех контрольных животных.

8.3. Величина ЕД50  испытуемого штамма сибиреязвенного микроба для кроликов при заражении 10 Dcl (безусловно смертельными дозами) должна быть не больше такой же величины эталонного вакцинного штамма СТИ-I в одном опыте.

                                            7

    8.4.  Овцы,  вакцинированные  1-1,5 x 10  спор  должны  выжить

после  заражения  10 Dcl вирулентного штамма возбудителя сибирской

язвы.  В  течение  первой недели у них может наблюдаться повышение

температуры тела, но не более, чем на 1 град. С.

 

9. Испытание стабильности штамма в

производственных условиях

 

9.1. Испытуемые штаммы, удовлетворяющие по всем перечисленным свойствам (безвредность, реактогенность для лабораторных животных, иммуногенность и т.д.) требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба, следует испытать на стабильность свойств в производственных условиях.

9.2. Вакцинные штаммы сибиреязвенного микроба не должны изменять свои культурально-морфологические, биохимические и иммуногенные свойства при производственном (масштабированном) культивировании; должны давать в производственных условиях изготовления необходимое накопление споровой массы с жизнеспособностью не менее 90%, стабильность суспензии.

9.3. Контроль 3 первых серий сибиреязвенной живой сухой вакцины, приготовленной из этих штаммов, проводят в соответствии с фармакопейной статьей на коммерческую вакцину сибиреязвенную живую сухую, новая вакцина должна удовлетворять требованиям, предъявляемым к коммерческой вакцине.

 

10. Испытание на людях сибиреязвенной

живой сухой вакцины

 

10.1. Для возбуждения ходатайства об испытании вакцины на добровольцах необходимо: обсудить на Ученом совете НИИ отчет о государственных доклинических испытаниях штамма, результаты авторских лабораторных испытаний и контроля трех экспериментальных серий сибиреязвенной живой вакцины, приготовленной из нового штамма, проект программы ограниченных испытаний; представить в комитет МИБП отчеты об авторских и государственных доклинических испытаниях штамма, а в ГИСК им. Л.И.Тарасевича - три первых экспериментальных серий препарата из нового штамма.

10.2. Разрешение на ограниченные государственные испытания на добровольцах вакцины из нового вакцинного штамма сибиреязвенного микроба дает Министерство здравоохранения Российской Федерации после получения решения комитета МИБП о рекомендации этих испытаний.

10.3. Введение сибиреязвенных живых вакцин из испытуемого и контрольного штаммов для людей проводят согласно инструкции по применению коммерческой сибиреязвенной живой вакцины. Контролем должны служить такие же группы людей, привитых плацебо, (среда высушивания сибиреязвенной вакцины, разведенная физиологическим раствором до такой же степени, как контрольная и испытуемая вакцины).

10.4. Группы вакцинированных комплектуются методом случайной выборки, являются равноценными по возрасту, полу, трудовой деятельности и т.д. Испытание подкожного метода вакцинации проводят после окончания срока наблюдений за привитыми накожным методом. У привитых учитывается безвредность и реактогенность по клиническим наблюдениям, биохимическим и серологическим реакциям и по аллергической перестройке.

10.5. Признание испытуемого штамма сибиреязвенного микроба в качестве вакцинного оформляется приказом Министра здравоохранения РФ на основании заключений Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и решения Комитета медицинских иммунобиологических препаратов.

10.6. Дальнейшие этапы внедрения вакцины сибиреязвенной живой осуществляют в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96, 3.3.2. "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".

 

 

 

 

 

Приложение N 1

(обязательное)

 

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ИЗУЧЕНИЯ СВОЙСТВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

 

1. Состав среды Гладстона-Фильда (80-100 мг% аминного азота):

                                                            на 1 л

    1.  Триптический перевар казеина                       50 мл

    2.  Водный экстракт дрожжей (пивные дрожжи)           200 мл

    3.  Серно-кислое железо Fe2(SO4)3 x 9H2O                0,01 г

    4.  Серно-кислая магнезия (MgSO4 x 7H2O)                0,05 г

    5.  Серно-кислый марганец (MnSO4 x 7H2O)                0,03 г

    6.  Хлористый кальций (CaCl2)                           0,1 г

    7.  Серно-кислый натрий (Na2SO4)                        0,3 г

    8.  Калий фосфорно-кислый однозамещенный (KH2PO4)       1,0 г

    9.  Калий фосфорно-кислый двузамещенный (K2HPO4)        5,0 г

    10. Агар-агар                                          30,0 г

 

Взамен дрожжевого экстракта можно использовать 0,5%-ный раствор дрожжей "Бакто". Цифры со 2 до 9 - последовательность растворения. Натрий фосфорно-кислый не следует использовать взамен солей калия. Среду с помощью фосфатного буфера доводят до рН 7,2.

2. Определение концентрации и живых спор в изучаемых культурах В. anthracis.

Концентрацию спор в вакцинной культуре определяют подсчетом в счетной камере Горяева с глубиной 0,1 мл. Исследуемую взвесь спор разводят последовательно десятикратно дистиллированной водой до исчезновения в последней пробирке отчетливо видимой мутности. Взвесью спор из этой пробирки заполняют камеру Горяева по ТУ 64-1-816-77 и через 5-10 мин. под микроскопом с фазовоконтрастным устройством (объектив х 40, окуляр х 7) подсчитывают споры в 10 больших квадратах сетки.

Концентрацию спор в 1 мл (N) исследуемой взвеси вакцинной культуры определяют по формуле:

 

                                4

                    N = 2,5 x 10  x n x p, где

 

p - кратность разведения исследуемого спорового материала;

n - среднее количество спор в одном большом квадрате.

 

Пример расчета:

    Исходная  взвесь  спор  разведена  в  1000 раз, n = 40 спорам;

                   4          3     10

отсюда N = 2,5 x 10  x 40 x 10  = 10   спор в 1 мл.

Для повышения точности исследования необходимо пользоваться средними результатами пяти подсчетов, произведенных указанным способом.

    Количество  живых  спор  определяют  с помощью микрокультуры и

высевом  на  агаровые пластины. На тонкий слой агара по Хоттингеру

(аминный азот 200-250 мг%) в чашки Петри наносят каплю исследуемой

взвеси  спор,  разведенной  0,9%-ным  раствором  хлорида натрия до

                8

концентрации  10  спор в 1 мл по счету в камере Горяева.  Наклоняя

чашку   в   разные   стороны,  равномерно  распределяют  каплю  по

поверхности  агара.  Засеянную  чашку  (агаром  вниз)  помещают  в

термостат  на 2,5  ч  при температуре 35-37 град. С. Микрокультуры

просматривают  в  фазово-контрастном  микроскопе с иммерсией через

покровное  стекло, помещенное на выбранный участок агара. В каждом

поле  зрения  отдельно  подсчитывают и непроросшие споры. Оболочки

спор  менее  контрастны.  При  подсчете спор и палочек оболочки не

учитывают.  Общее  сосчитанное  количество  клеток  должно быть не

менее  500. Количество живых спор в микрокультуре устанавливают по

отношению  палочек  к  общему числу сосчитанных проросших клеток и

спор (в процентах).

    Количество  живых  спор  в  вирулентных культурах (тест-штамм)

                               2

определяют  только  высевом  10  спор на агаровые пластинки. Общее

количество  спор  определяют  по  стандарту  мутности ГИСК, 10 ед.

                        8

которого эквивалентны 10  спор.

3. Определение присутствия плазмиды рХО1 проводят одновременно с определением отсутствия плазмиды рХО2 следующим образом. К 25 мл 16-часовой бульонной испытуемой культуры сибиреязвенного микроба добавляют 5 мл свежей среды - бульон Хоттингера рН 7,2, а также раствор пенициллина до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируют с аэраций при 180 оборотах в мин. в термостатируемой качалке в течение 1 ч при температуре (36 + 1) град. С. Клетки осаждают центрифугированием при 8000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл Е буфера следующего состава: трис-аминометан 0,04 М; тетранатриевая соль ЭДТА 0,002 М; сахароза 15%, рН 7,9. Культуру лизируют на водяной бане в течение 30 мин. при 60 град. С в 2 мл лизирующей смеси (додецилсульфат натрия 3%, трис-аминометан 0,05 М, натрия гидроксид 0,15 N , сахароза 15%). К лизату добавляют 0,5 мл раствора 2М трис-аминометана рН 7,0, содержащего проназу в концентрации 2 мг/мл после чего инкубируют на водяной бане при температуре 37 град. С в течение 20 мин. Экстракцию белков проводят добавлением к лизату 6 мл смеси фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Суспензию осторожно перемешивают, а затем центрифугируют 10 мин. при 10 тыс. об/мин. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, используют для электрофоретического анализа. Электрофорез ДНК проводят в горизонтальных пластинках 0,7%-ного агарозного геля при силе тока 70-90 мА. Гель окрашивают в течение 20 мин. бромистым этидием в концентрации 0,5 мкг/мл, отмывают в дистиллированной воде и фотографируют в ультрафиолетовом свете на фотопленку "Фото-65". На фотографии агарозного геля у испытуемого и эталонного вакцинного СТИ-I штаммов сибиреязвенного микробов должна быть полоска, соответствующая по размеру ДНК плазмиды рХО1 (110 МД).

4. Определение наличия pag гена проводится в соответствии с Инструкцией по применению тест-системы для обнаружения В.anthracis pXOI+ методом полимеразной цепной реакции (ФСП 42-.......).

 

 

 

 

 

Приложение N 2

(обязательное)

 

МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЗВРЕДНОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ

СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

 

1. Подготовка к проведению исследований лабораторных животных (мышей, свинок, кроликов, овец и коз).

Поступивших в лабораторию морских свинок выдерживают перед началом исследований в карантине не менее 10 сут. Проводят оценку поголовья животных путем взвешивания, термометрирования и ежедневного клинического наблюдения. Состояние здоровья поголовья морских свинок определяют также по данным патологоанатомического и гистологического исследований. Для этого по 10 животных вскрывают и исследуют в три этапа: в начале карантина, в день начала опыта и через 30 дней после постановки опыта. Повторное взвешивание и термометрирование свинок проводят накануне введения им испытуемого штамма. Животные могут быть использованы для определения безвредности аттенуированного штамма сибиреязвенного микроба в том случае, если большинство из них в виварии клинически здорово, за время карантина не снизили или прибавили в массе, ректальная (или оральная) температура максимально не превысила 38,5 град. С.

При общем благополучном состоянии поголовья могут быть отдельные случаи потери массы, заболевания и даже гибели животных. Эти случаи не должны превышать 1,5% от общего числа животных вивария.

2. Определение степени остаточной вирулентности и реактогенности для морских свинок.

Оценку безвредности штамма в опытах на морских свинках проводят по клиническим проявлениям на подкожное введение испытуемой культуры, летальности, распространенности и приживаемости микробов в органах и тканях по результатам бактериологических, а также патоморфологических исследований животных, забитых и вскрытых в разные сроки после однократного введения споровой культуры.

2.1. Распространяемость, приживаемость и реактогенность штамма определяют в одном опыте на одной и той же группе животных.

    Накануне  опыта  морских  свинок  (масса  350-400  г) с учетом

показателей  массы  распределяют на равноценные группы для каждого

штамма и каждой дозы. На каждый штамм берут по 160 морских свинок,

распределяют  их  по  массе на 4 равноценные группы: две - по 50 и

две  группы  -  по  30  животных. Испытуемый и эталонный вакцинный

штаммы  сибиреязвенного  микроба  в  споровой  форме (не менее 90%

жизнеспособных   спор  по  методу  микрокультуры)  вводят  морским

свинкам под кожу бедра в паховой области в объеме 1 мл, содержащем

          7                         6                4

по  5 x 10  (50 свинок на штамм), 10  (50 свинок), 10  (30 свинок)

    2

и 10  (30 свинок) спор.

2.2. Методика вскрытия, патологоанатомические и бактериологические исследования лабораторных животных при определении безвредности штаммов.

Для определения распространяемости и приживаемости микробов и патоморфологических изменений в органах и тканях, вызываемых в разные сроки, животных по 3 для каждой культуры и каждой дозы умерщвляют поочередно хлороформом на 1, 3, 5, 8, 15, 21 и 30-е сутки после введения испытуемых культур. Как можно быстрее, не позднее 20-30 мин. после смерти, проводят их вскрытие, перед вскрытием тушки смачивают мыльным раствором, проводят тщательное описание патологоанатомических изменений и их бактериологическое исследование, берут органы для патогистологического исследования. Кусочки органов, тканей и лимфатические узлы фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Для каждого животного берут отдельную банку емкостью 300-500 мл с притертой или резиновой пробкой, на 2/3 заполненной формалином. В банку помещают бумажную этикетку, на которой простым карандашом крупно с обеих сторон написаны номер животного, шифр культуры, дата взятия материала и день наблюдения. На другой этикетке пишут название лимфатических узлов. Результаты патологоанатомического исследования записывают в протокол вскрытия. Вскрытие животных производят на доске, размещенной в кювете из нержавеющего металла. На доску кладут лист пергаментной бумаги. После вскрытия бумагу осторожно свертывают и помещают в бачок для вскрытых животных. Корнцангом со смоченным спиртом горящим ватным тампоном обжигают вскрывочную доску и края кювета. В кювет наливают 5%-ный раствор перекиси водорода с 1% моющего средства.

При вскрытии кожных покровов описывают состояние подкожной клетчатки, отмечая степень инъекции ее сосудов, возможные очаги гиперемии, геморрагии или отека. Отмечают состояние кожи, клетчатки, подлежащих мышц в месте введения культуры, характер изменений в них, распространенность. Особое внимание обращают на развитие геморрагических, гнойных и некротических изменений. Указывают размеры (в мм) регионарных к месту введения культуры паховых лимфатических узлов, их цвет, плотность, спаянность с окружающей клетчаткой и состояние других лимфоузлов. После посевов кусочки с места введения погружают в 10%-ный раствор нейтрального формалина, а лимфатические узлы помещают на этикетку против соответствующих названий и после подсушивания тоже опускают в фиксатор.

После этого вскрывают брюшную и грудную полости. Отмечают полнокровие органов, состояние плевральных полостей, сальника, висцеральной брюшины, кишечника, проводят посевы и описывают состояние внутренних органов. Обращают внимание на развитие интерстициальной реакции в легких (макроскопически она определяется в виде мелких серовато-розовых очагов или тяжей, расположенных, главным образом, по ходу сосудов и бронхов), а также наличие узелков, очагов некроза в печени и селезенке, отмечая особо их количество, размеры (длина, ширина, толщина) и внешний вид. Кусочки органов берут обязательно с измененными участками. После исследования легких, сердца, селезенки и печени и взятия из них кусочков размером 1х1 см тонкий кишечник отодвигают в правую сторону (по отношению к свинке), берут почку; надрезают ее с надпочечником и подвздошные лимфатические узлы, отмечают их размеры, консистенцию, цвет и состояние окружающей клетчатки. В последнюю очередь берут костный мозг вместе с кусочком диафиза бедренной кости. Кость надо расщепить, т.к. она может препятствовать проникновению фиксатора. Собранный материал оставляют на 14 сут. в комнате для инфицированных животных, после чего его выносят для гистологической обработки.

После посева ткани каждого органа тщательно обрабатывают инструменты: пинцеты и ножницы вытирают ватным тампоном, смоченным 5%-ным раствором перекиси водорода, опускают в стакан со спиртом и перед очередным использованием обжигают.

Результаты патологоанатомического исследования записывают в протокол.

 

                        Протокол вскрытия

 

                      от ___________ 200 г.

 

N животного _____________ вид животного _____________ пол ________

Масса ___________________

Название культуры _________________________________; доза ________

срок наблюдения _______________________

Метод и место введения ___________________________________________

Дата заражения ___________ падежа __________ умерщвления _________

Упитанность ______________________________________________________

Состояние подкожных сосудов ______________________________________

Место введения ___________________________________________________

Лимфатические узлы

Правый пахов. ____________________________________________________

Левый пахов. _____________________________________________________

Правый подмыш. ___________________________________________________

Подвздошные ______________________________________________________

Паратрахеальные __________________________________________________

Бифуркационные <*> _______________________________________________

Легкие ___________________________________________________________

Селезенка ________________________________________________________

Печень ___________________________________________________________

Почки ____________________________________________________________

Надпочечники _____________________________________________________

Др. органы _______________________________________________________

Костный мозг _____________________________________________________

    Вскрывал _____________________________________________________

 

--------------------------------

<*> Берутся для гистологии при аэрогенном введении.

 

2.3. Во время вскрытия животных проводят и бактериологическое исследование. Посевы органов и тканей проводят на заранее проверенный на ростовые качества агар Хоттингера (рН 7,0-7,2, аминный азот 200-250 мг %), используют питательную среду, обеспечивающую рост колоний из 10 засеянных спор. На агаровые пластинки в чашках Петри засевают место введения культуры, правый подвздошный лимфоузел, костный мозг (одна чашка), лимфатические узлы правый (регионарный) и левый паховые, правый и левый подмышечные (вторая чашка), печень и селезенку (третья чашка); легкие и кровь (четвертая чашка); на агар с 3-5% крови засевают легкие и кровь, на агар Эндо - печень и селезенку. Посевы органов проводят методом многочисленных отпечатков, костный мозг берут и сеют петлей из бедренной кости, посев крови проводят мазком-отпечатком отсеченной верхушкой сердца. Среды с посевами органов на агар Хоттингера помещают в термостат при температуре 28 град. С, на агар с 3-5% крови и агар Эндо при 37 град. С на 2 сут. Просматривают посевы через 1 сут., окончательно через 2 сут. Погибших животных исследуют так же, как и умерщвленных. Кроме того, у погибших морских свинок делают дополнительные посевы из тонкого, толстого кишечника и мезентериальных лимфатических узлов на агар Эндо. Аналогичным образом исследуют поголовье животных.

2.4. Определение "остаточной" вирулентности штамма для мышей.

    "Остаточную"   вирулентность  новых  вакцинных  сибиреязвенных

штаммов  проверяют  на  белых  мышах  или  черных  инбредных мышах

(C57BL)  массой  18-20  г. Испытуемый и эталонный вакцинный штаммы

сибиреязвенного  микроба  вводят подкожно белым или черным мышам в

                       8    7    6    5    4

объеме 0,5 мл в дозе 10 , 10 , 10 , 10 , 10  живых спор. На каждую

дозу берут по 6 животных. За животными наблюдают в течение 10 сут.

после  введения  культур.  Значительное число мышей (до 80%) может

погибнуть  в  сроки  2-7 сут. Воспалительный отек у мышей на месте

введения  культуры  имеет  геморрагический  характер.  Образование

отеков  в ответ на инъекцию культуры свидетельствует об остаточной

вирулентности   штамма   и   является   косвенным  показателем  ее

иммуногенности.   Павших   мышей   вскрывают,   делают  посевы  из

внутренних   органов,   крови,  мазки-отпечатки.  Определяют  LD50

испытуемого и контрольного штаммов по методу Кербера.

3. Реактогенность испытуемого и эталонного сибиреязвенных вакцинных штаммов оценивают на морских свинках по клиническим наблюдениям за животными, которых в первые две недели не забивают. Сроки наблюдения: 2, 4, 6, 8, 10 и 12-е сутки после введения культур. У каждого животного (по 15 для каждой дозы) осматривают и пальпируют место введения, измеряют ректальную температуру термометром, определяют массу тела.

4. Оценку безвредности испытуемого штамма в опытах на кроликах проводят по клиническим проявлениям поствакцинальной реакции, по данным бактериологического и патоморфологического исследований кроликов, забитых и вскрытых в разные сроки после однократного подкожного введения испытуемой сибиреязвенной споровой культуры. В опыт берут на эталонный и испытуемый штаммы по 25 кроликов, предпочтительно породы "шиншиллы" с массой тела 2-2,5 кг.

                                    8

    Культуры  вводят в дозе 2,5 x 10  живых спор в объеме 1 мл под

кожу  внешней  поверхности бедра. По 2 кролика умерщвляют через 1,

3,  8,  15  и  21  сут. после вакцинации для бактериологического и

патогистологического  изучения.  Одновременно с посевами из тех же

органов  готовят мазки-отпечатки, фиксируют их метиловым спиртом с

10%  формалина  и  окрашивают  метиленовым  синим  по Леффлеру. 10

кроликов  на  каждый  штамм оставляют для клинических наблюдений и

последующей   проверки   иммуногенности  штаммов  для  этого  вида

животных.

4.1. Определение реактогенности по клиническим наблюдениям.

У 10 кроликов, оставленных для проверки иммунитета, проводят на 3, 4, 6, 8 и 10-е сутки после введения культуры следующие клинические наблюдения: осмотр места введения, взвешивание, измерение ректальной температуры.

5. Определение безвредности штаммов для овец и коз.

Безвредность культур испытуемого и эталонного вакцинного сибиреязвенных штаммов в опытах на овцах и козах оценивают по клиническим проявлениям поствакцинальной реакции, по данным бактериологического и патоморфологического исследования животных, забитых и вскрытых в разные сроки после введения культуры.

    В  опыт  берут  на каждый штамм по 14 здоровых овец и 2 козы в

возрасте  1-1,5  года,  не  подвергавшихся ранее вакцинации против

сибирской  язвы. На 10 овцах впоследствии оценивают иммуногенность

штамма.  Испытуемую  и  контрольную культуры вводят овцам под кожу

                                             6

внутренней поверхности  бедра  в  дозе 2 x 10  спор в объеме 1 мл.

После  введения культур проводят ежедневно термометрирование утром

и вечером и осмотр животных.

Для проведения патологоанатомического и бактериологического исследования умерщвляют по 1 козе на 5 и 7-е сутки, по 1 овце на 1, 3, 5 и 7-е сутки после введения культур на каждый штамм и срок.

 

 

 

 

 

Приложение N 3

(обязательное)

 

МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ИСПЫТУЕМОГО ШТАММА НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ

 

    1. Для изучения отсутствия повреждающего действия  штаммов  на

                                               6

иммунную систему иммунизируют  по 6 кроликов 10   спор в  объеме 1

мл   испытуемого  и  эталонного  вакцинного   штамма,  контрольных

животных 0,9%-ным раствором хлорида натрия. У привитых и интактных

животных   проводят   следующие   исследования  в  соответствии  с

РД 42-28-10-90.

Группы животных формируются методом случайной выборки равнозначных по полу и массе.

2. Выделение лимфоцитов из крови кроликов.

Кровь у кроликов берут из ушной вены в объеме 2 мл в пробирку со средой 199 или раствором Хенкса с (25 +/- 0,5) ед/мл гепарина в соотношении 1 часть крови и 3 части среды. После перемешивания разведенную кровь наливают в пробирку на водный раствор верографина плотностью в (1,08 +/- 0,002) г/мл в соотношении 2:1, центрифугируют (15 +/- 1) мин. при (450 +/- 25) g, затем пастеровской пипеткой собирают образовавшееся над слоем верографина беловатое кольцо лимфоцитов. Количество Т- и В-лимфоцитов определяют одним из приведенных ниже методов.

3. Определение пролиферативной активности лимфоцитов.

3.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов.

                                                      6

    3.1.1. Спонтанная.  Суспензию  лимфоцитов  (5 x 10  кл/мл)  от

иммунных  и контрольных животных на "среде культивирования" (среда

RPM1-1640,  содержащая  10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ

                                      5

буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 x 10 -М 2-меркаптоэтанола,   100

ед/мл   пенициллина   и  100  мкг/мл  стрептомицина)  разливают  в

96-луночную пластиковую панель по 200 мкл в лунку (по три лунки на

каждый образец)  и инкубируют  в  CO2 - инкубаторе  (5%  CO2)  при

температуре 37 град. С в течение 72 ч.  Затем добавляют 3Н-тимидин

в объеме  25-50  мкл  (1-2  мкКИ)  в среде  RPM1-1640  на лунку  и

инкубируют  в  тех же условиях еще 16-24 ч. По окончании инкубации

клетки  переносят  на  фильтры с помощью прибора  "Cell Harwestr",

фильтры  после  сушки  в  термостате  при температуре  37  град. С

помещают во флаконы,  содержащие по 3 мл сцинтилляционной жидкости

(на 1 л толуола 0,2 г РОРОР и 5 г РРО).

3.1.2. Реакция бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Т- и В-клеточных митогенов служит для оценки функциональной активности лимфоцитов. Специфическое распознавание митогена индуцирует в клетках пролиферацию, т.е. деление клеток. Некоторые митогены селективно стимулируют различные субпопуляции лимфоцитов. Например, КонА стимулирует тимоциты, зрелые и незрелые Т-клетки, ФГА стимулирует пролиферацию только зрелых Т-клеток. Такие митогены, как липополисахарид и бактериальный липопротеин, стимулируют пролиферацию В-клеток. Благодаря этой селективности митогены могут использоваться для характеристики функционального состояния различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток.

Постановку реакции осуществляют, как указано в п. 4.1., только в опытные лунки добавляют Т- и В-клеточные митогены (не менее 3 лунок на каждый митоген) в оптимальной стимулирующей дозе (КонА 1-15 мкг/мл, ФГА 10-15 мкг/мл, ЛПС 15-100 мкг/мл). Контролем служат лунки со взвесью лимфоцитов без добавления митогенов.

Результаты представляют в виде индексов стимуляции РБТЛ (ИС РБТЛ), которые подсчитывают по формуле:

 

                       имп/мин. в культуре без митогена

            ИС РБТЛ = --------------------------------

                       имп/мин. в культуре с митогеном

 

3.2. Определение пролиферативной активности лимфоцитов цитофлуориметрическим методом.

Принцип метода основан на вторичной флуоресценции, которая возникает в результате окрашивания ДНК лимфоцитов специфическим флуорохромом и измерением ее содержания в лимфоцитах в различных фазах клеточного деления.

3.2.1. Приготовление растворов флуорохромов.

Раствор А. Готовят 0,0025%-ный раствор этидиум бромида в 0,1 М растворе трис-буфера рН 7,4, содержащем 0,6% хлорида натрия. Величина рН 7,4 достигается добавлением 1 н раствора хлористого натрия.

Раствор Б. Готовят 0,005%-ный раствор митрамицина в 12,5%-ном растворе этилового спирта, содержащем 7,5 мМ хлористого магния 6-водного. Величина рН 5,5 достигается добавлением 0,01 н раствора хлорида натрия. Приготовленные растворы хранят при температуре (4 +/- 2) град. С не более месяца.

3.2.2. Фиксация лимфоцитов.

                                                      6

    Полученные  клеточные суспензии с концентрацией 10  лимфоцитов

в  1  мл  фиксируют  путем  добавления  (70 +/- 1) град. этилового

спирта (использование другого фиксатора недопустимо), охлажденного

до  (4  +/-  2)  град.  С,  из  расчета 4,5 мл на 0,5 мл клеточной

суспензии,  выделенной от вакцинированных испытуемым и контрольным

штаммами  животных.  Смеси  перемешивают  на вибрационной мешалке,

выдерживают  при  температуре  (4  +/- 2) град. С не менее 30 мин.

Фиксированные клетки можно хранить при температуре (4 +/- 2) град.

С до 10 сут.

3.2.3. Окраска ДНК лимфоцитов флуорохромами.

Фиксированные этиловым спиртом лимфоциты (5 мл) осаждают путем центрифугирования на центрифуге в течение (3 +/- 1) мин. при (1000 +/- 25) g, удаляют надосадочную жидкость. Затем к осадку добавляют 0,5 мл раствора флуорохрома А, перемешивают на вибрационной мешалке 30-40 с и выдерживают при температуре (22 +/- 2) град. С 10 мин. К смеси лимфоцитов и флуорохрома А добавляют 0,5 мл флуорохрома Б, также перемешивают и выдерживают при температуре (22 +/- 2) град. С 5 мин. Пробирки необходимо закрывать парафиновыми бумажками. После окраски суспензии лимфоцитов готовы к анализу на приборе и должны быть использованы в течение 2 ч.

3.2.4. Подготовка окрашенных клеток к исследованию.

Суспензии окрашенных лимфоцитов в пробирках помещают в ультразвуковую ванну и подвергают обработке 15 с для разрушения агломератов, образовавшихся при центрифугировании, затем фильтруют через фильтры с размером пор от 45 до 50 мкм.

Процентное соотношение лимфоцитов в фазах клеточного деления регистрируют с помощью проточного цитофлуориметра PHY WE JCPP 22 или другой марки.

Определение процентного соотношения пролиферирующих (фазы S и G2 + М) и непролиферирующих (фазы G0/G1) лимфоцитов проводят путем расчета гистограмм, высвечивающихся в процессе эксперимента на экране дисплея многоканального анализатора импульсов с помощью математической модели. Методика расчетов изложена в методических рекомендациях "Определение синтезирующих клеток ДНК и делящихся лимфоидных клеток методом проточной цитофлуориметрии". Саратов, 1989.

Общее количество клеток, зарегистрированное анализатором, определяется суммарным количеством клеток, набранных в каждом из каналов:

 

                             X5

                N общ.  =   SUM   Nxi x дельта x

                          Xi = X1

 

В свою очередь количество клеток в фазах клеточного цикла G0/G1, S и G2 + М определяется площадью, ограниченной соответствующей кривой.

Количество клеток в S-фазе определяется площадью трапеции и может быть вычислено путем умножения основания этой трапеции на высоту:

 

NS = N(X3) x (X4 - X2) = N(X3) x X2

 

Рис. 1. Определение количества клеток в S-фазе.

 

Рисунок 1 не приводится.

 

Условные обозначения: N - количество сигналов (клеток); X - количество ДНК в относительных единицах (каналах), выражается через интенсивность флуоресценции, а затем через амплитуду электрического импульсного сигнала на выходе ФЭУ; соответственно амплитуде сигнала ставят определенный канал анализатора импульсов, сигнал отсчитывается анализатором; Х1 - номер произвольного канала до начала распределения (выбирается одинаково для опытной и контрольной пробы); Х2 - номер канала максимума пика G0/G1, определяется на гистограмме при помощи светящейся метки (курсора) и корректируется, исходя из значения коэффициента вариации гауссовского распределения G0/G1; Х3 - номер канала по середине S-фазы, Х4 - номер канала максимума пика G2 + М.

 

                          X4 - X2        X2

                     X2 + ------- = X2 + --

                             2           2

 

Эти клетки содержат количество ДНК вдвое больше чем диплоидные, поэтому Х4 = 2Х2; Х5 - номер произвольного канала после распределения (выбирается одинаково в опыте и контроле).

Поскольку в различных точках S-фазы регистрируется неодинаковое число клеток, необходимо заменить число N (Х3) на усредненную величину по нескольким каналам (К) и выбрать К равным от 10 до 20, тогда

 

                        X2      X3 + K/2

                 N  = ----- x     SUM        NXi

                  S   K + 1    Xi = X3 - K/2

 

Поскольку распределения G0/G1 и S перекрываются, число клеток в фазе G0/G1 может быть определено путем вычитания половины площади, занятой фазой S, из общей площади до канала Х3:

 

                           X3

              N      = (  SUM   NXi x дельта X) - N

               G0/G1    Xi = X1                    S/2

 

Количество клеток в фазах G2 + М определяется так:

 

                     N        = N общ. - (N  + N     )

                      G2 + М               S    G0/G1

 

Процент клеток в фазах S, G2 + М и G0/G1 определяют путем деления соответствующих площадей на общую площадь гистограммы и умножения на 100%

 

                                 N

                                  G0/G1

                       N     % = ------ x 100%

                        G0/G1    N общ.

 

Все операции расчета сводятся к определению с помощью курсора номера каналов Х1, Х2, X3, Х3 - К/2, Х3 + K/2, Х и вычислению с помощью этого же курсора ограниченных ими площадей:

 

                                   N

                                    S

                           N % = ------ x 100%

                            S    N общ.

 

                        N

                         G2 + M

             N      % = ------- x 100% = 100% - N % - N

              G2 + M     N общ.                  S     G0/G1

 

   X5                      X3                      X3 + K/2

  SUM   Nxi x дельта X    SUM   Nxi x дельта X       SUM       Nxi

Xi = X1                 Xi = X1                  Xi = X3 - K/2

 

Для этого не требуется длительного суммирования значительного числа клеток в каждом из каналов. Достаточно последовательно поместить курсор в начальную и конечную точки гистограммы, ограничивающие требуемый участок, и нажатием специальной кнопки, указанной в инструкции к любому анализатору, определить площадь этого участка.

4. Определение количества Т- и В-лимфоцитов цитотоксическим тестом.

4.1. Цитотоксический тест - это иммунологическая реакция, позволяющая выявить антигены, расположенные на поверхности жизнеспособных лимфоцитов. Основной принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целостность клеточной мембраны. Образование "отверстия" в мембране лимфоцитов позволяет прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) проникать внутрь клетки и окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.

4.1.1. Определение количества Т-лимфоцитов.

    Коммерческую  поликлональную  сыворотку   против  Т-лимфоцитов

(институт  им.  Габричевского)  разводят  средой  199  до  рабочей

концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в

лунке  панели  смешать 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси

                            7

лимфоцитов  (концентрация 10  кл/мл) и  20 мкл комплемента кролика

в разведении  1:3.  В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл

                                       7

взвеси   лимфоцитов   (концентрация  10   кл/мл),  20  мкл  взвеси

комплемента  и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в

термостате  при температуре (37 +/- 2) град. С 25-30 мин. В каждую

пробирку  или  лунку  добавить  по  1200  мкл  0,5%-ного  раствора

трипанового  синего (500 мг красителя растворить в 100 мл горячего

80-90 град. С 0,9%-ного  раствора  хлорида  натрия;  перемешать 10

мин. на магнитной мешалке и  профильтровать  через  фильтровальную

бумагу). Через 30-60 с. поместить взвесь из лунки в счетную камеру

Определяют  число  погибших клеток, вычисляют их процент от общего

количества   клеток  в  препарате,   подсчитывают  цитотоксический

индекс (ЦТИ) по формуле:

 

             % убитых клеток в опыте - % убитых клеток в контроле

 ЦТИ = 100 x ----------------------------------------------------

                       100 - % убитых клеток в контроле

 

ЦТИ указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции.

4.1.2. Определение количества В-лимфоцитов.

Общее количество В-лимфоцитов определяют в цитотоксическом тесте с коммерческой поликлональной специфической сыворотки против В-лимфоцитов мыши. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти Т-сывороткой.

5. Определение фагоцитарной активности макрофагов.

Фагоцитарная активность определяется процентом фагоцитирующих клеток и количеством захваченных частиц на один фагоцит.

Внутрибрюшинно уколом по средней линии живота кролику вводят 50 мл среды 199 с гепарином (10 ед/мл). Брюшко массируют для смыва клеток, не вынимая иглы, и экссудат отсасывают шприцем.

    Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от

кроликов  опытной  и  контрольной  групп  и  помещают в среду 199,

содержащую  5  ME гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не

используют   экссудаты,  содержащие  эритроциты.  После  осаждения

центрифугированием   при   150   g,   в   течение  10  мин. клетки

ресуспендируют в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота

и  антибиотиками  (по  100  ед/мл  пенициллина  и  стрептомицина).

                                             6

Концентрацию  клеток  доводят  до  1-2  x  10   кл/мл  и суспензию

разливают  по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в

термостат с  содержанием  5% CO2. Через 60 мин. суспензию сливают,

смывают неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей

среды  199  и  оставляют  на  18-24  ч в термостате с 5-7% СО2 при

температуре  37 град. С.  Клетки для исследования фагоцитоза можно

получить  также  на  половинках  покровных  стекол,  помещенных  в

пробирки с 1,5-2 мл КПЭ.

    Объектом  фагоцитоза  могут  служить  эритроциты  барана  и В.

anthracis  СТИ-I.  Суточную  культуру  В.  anthracis СТИ-I, убитую

кипячением в  2%-ном  растворе  соды  в течение 60 мин.  с момента

закипания,  отмывают  не  менее  3 раз 0,9%-ным  раствором хлорида

натрия,  ресуспендируют  в нем и определяют концентрацию суспензии

по  стандарту  оптической  мутности. Взвесь разводят средой 199 до

                                                    9

концентрации, соответствующей соотношению 10-20 x 10  кл/мл.

Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмыть 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осаждая на центрифуге при 800 g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ную взвесь ЭБ на среде 199.

В чашки Петри, содержащие КПЭ, наливают 1 мл свежей среды 199 и вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30-60 мин. чашки споласкивают холодным раствором Хенкса, просушивают и фиксируют 10 мин. метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому.

Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.

Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на один фагоцит, абсолютным фагоцитарным показателем (АФП) - суммарным показателем активности полиморфноядерных лейкоцитов, которое рассчитывают по формуле:

АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл крови ФЧ

Пример:

а) Общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови - 500,

содержание полиморфноядерных лейкоцитов - 60%, ПФ - 80%, ФЧ-5.

 

                                              500 x 60

    Количество полиморфноядерных лейкоцитов = -------- = 300;

                                                 100

 

б) полиморфноядерных лейкоцитов 300-100%, фагоцитирующих (ПФ) - 80%, т.е. количество фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов =

 

                                   300 x 80

                                   -------- = 240;

                                     100

 

в) АФП = 240 x 5 = 1200.

 

6. Определение влияния вакцинного штамма на развитие клеточного и гуморального иммунного ответа на гетерологичный антиген.

6.1. Определение влияния вакцинного штамма на развитие клеточного иммунного ответа на гетерологичный антиген по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ).

    Мышей   разделить   на   три   группы.   Мышей  первой  группы

иммунизировать   исследуемой   вакциной,   мыши  второй  группы  -

интактные   (положительный   контроль),   мыши  третьей  группы  -

интактные с введением только разрешающей дозы ЭБ (контроль). Мышам

                                                           7

1-ой и 2-ой групп вводят ЭБ без адьюванта Фрейнда в дозе 10  кл/на

мышь в объеме 0,1 мл в межлопаточную область подкожно, параллельно

внутрибрюшинно  (возможны  и другие способы введения - перорально,

внутривенно,  подкожно)  ввести  исследуемую  вакцину. Разрешающую

             8

дозу  ЭБ  (10  кл/на  мышь)  ввести на 5-й день в объеме 0,02 мл в

подушечку  задней  лапы,  в  контрлатеральную  -  0,9%-ный раствор

хлорида натрия всем трем группам животных.

Учет результатов - местную реакцию на введение разрешающей дозы ЭБ оценивать через 18-20 часов путем определения веса опытной (Ро) и контрольных (Рк) лапок. Интенсивность  местной реакции определяют по индексу (ИР), рассчитываемой по формуле:

 

                                  Ро - Рк

                             ИР = ------- x 100%

                                    Рк

 

Оценка результатов. Значение ИР в опытной (1-ой) группе выше двух его значений в положительном контроле (2-я группа) следует оценивать как выраженный иммуностимулирующий эффект вакцины. При значении ИР равного контролю (3-я группа) или менее положительного контроля - как выраженный иммуносупрессирующий эффект вакцинации.

6.2. Влияние вакцинного штамма на развитие гуморального ответа на гетерологичный антиген.

Определение поликлональной активности В-лимфоцитов.

Для получения этого показателя определить число клеток, продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК). Необходимо подчеркнуть, что иммунизация мышей эритроцитами барана в этих опытах не производится, а определяется количество спонтанных "фоновых" АОК в селезенке. Увеличение их количества после введения вакцины является показателем поликлональной активации В-лимфоцитов. Число АОК в селезенке определяют методом локального гемолиза в геле.

6.2.1. Выявление антителообразуюших клеток методом локального гемолиза в геле.

    Эритроциты  барана  отмыть  0,9% -ным раствором хлорида натрия

путем  центрифугирования  7  мин. при  400  g 3 раза,  к 0,9%-ному

                                                     7

раствору  агарозы  <*>  добавить  из расчета 2-3 x 10  эритроцитов

барана  в  1  мл.  Полученную  рабочую  смесь  разлить по 2,5 мл в

пробирки, помещенные в водяную баню при температуре 43-44 град. С.

В  каждую  пробирку  добавить  по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток

                            7

селезенки  (концентрация  10  кл/мл), перемешать и вылить на чашку

Петри,  равномерно  распределяя  ее  по  дну.  Через  5 мин. чашки

поместить в термостат при температуре (37 +/- 2) град. С на 1 час.

Затем в каждую чашку  вылить по 2,5 мл разведенного в 5 раз средой

199 комплемента морской свинки сухого  или разведенного  в  10 раз

свежезамороженного комплемента. После 30 мин. инкубации подсчитать

число зон гемолиза на каждой чашке.

--------------------------------

<*> Приготовление 0,9%-ного раствора агарозы: навеску сухой агарозы (см. табл.) смешать с дистиллированной водой, смесь кипятить на водяной бане до полного растворения агарозы; перенести емкость с раствором в водяную баню с температурой 43-44 град. С, добавить 10-кратный раствор Хенкса, рН раствора довести до 7,2 1%-ным раствором KH2PO4 или NaOH (по цвету индикатора, присутствующего в растворе Хенкса).

 

Учет результатов. Рассчитать число антителообразующих клеток на селезенку и на 1 млн. ядросодержащих клеток (ЯСК) селезенки. Пример результатов опыта этого типа представлен в таблице:

 

N  
группы

Вакцинация

Срок после
вакцинации
(сут.) 

Число АОК на
селезенку 

Р 

Индекс   
поликлональной
стимуляции 

1  

(контр.) 

-    

120 +/- 24

- 

1       

2  

+    

3   

198 +/- 39

0,05

1,65    

3  

+    

7   

246 +/- 36

0,05

2,05    

4  

+    

10   

154 +/- 40

0,05

1,28    

5  

+    

15   

105 +/- 27

0,05

0,87    

6  

+    

20   

116 +/- 17

0,05

0,96    

 

Оценка результатов.

В этом опыте обнаружено на 3-7 день после прививки выраженное стимулирующее действие вакцины на функциональное состояние В-лимфоцитов.

 

Кол-во
чашек 

Масса  
агарозы 

Объем дистиллированной
воды        

Объем 10-кратного 
раствора Хенкса  

10  

225 мг  

22,5 мл       

2,5 мл      

 

6.2.2. Определение функциональной активности регуляторных Т-лимфоцитов.

Метод оценки активности Т-супрессоров и Т-хелперов основан на исследовании их способности соответственно угнетать или стимулировать in vitro зрелые клетки, продуцирующие антитела к эритроцитам барана.

    Тест-объектом    служат   клетки   селезенки   от   3   мышей,

                                                                 8

иммунизированных   внутривенно   эритроцитами   барана  (2  x  10

клеток/на мышь). Для иммунизации необходимо использовать сингенных

мышей, иммунизированных испытуемым и контрольным штаммом.

    Иммунизированных  ЭБ  мышей убить хлороформом, из их селезенок

                                                       7

приготовить  общую  клеточную  взвесь  (концентрация 10  кл/мл) по

описанному выше  методу (п.  2.2.). Клетки отмыть 1 раз средой 199

путем  центрифугирования  в  течение  7  мин.  при  400 g. Довести

                      7

концентрацию   до   10   кл./мл, 0,2  мл  этой  взвеси  смешать  в

центрифужной   пробирке   с  0,2  мл  взвеси  спленоцитов  той  же

концентрации  от  иммунизированных испытуемой вакциной животных. В

контрольной  пробирке к 0,2 мл первой взвеси добавить 0,2 мл среды

199.  Все пробирки  инкубировать в течение 30 мин. при температуре

(37  +/-  2)  град. С, затем их центрифугировать 7 мин. при 400 g.

Haдосадок  слить,  в  каждую  пробирку  добавить по 2,5 мл рабочей

смеси  агарозы  с  эритроцитами  барана  (см. п. 2.8.). Содержимое

пробирки перемешать осторожным встряхиванием и немедленно вылить в

чашку  Петри,  равномерно распределяя смесь по дну. Чашку оставить

при температуре  18-20 град. С  на 5 мин.,  затем  инкубировать 90

мин.  при  температуре  (37 +/- 2)  град. С. Далее в  каждую чашку

налить по 2,5  мл  разведенного комплемента морской свинки  (сухой

комплемент разводят  средой  199  в  5  раз,   свежезамороженный -

в 10 раз) и продолжить  инкубацию   при   температуре  (37  +/- 2)

град. С  еще   в  течение  30  мин.,  после   чего  в   проходящем

электрическом свете подсчитать число зон гемолиза в каждой чашке.

Учет результатов.

Подсчитать индекс эффективности (ИЭ) по формуле:

 

                        число АОК в опыте

                  ИЭ = --------------------

                       число АОК в контроле

 

Пример результатов опытов этого типа представлен в таблице:

 

N опыта

Число АОК на чашку   

Р   

Индекс      
эффективности  

В контроле 

В опыте  

1  

148 +/- 36 

81 +/- 30 

< 0,05 

0,55       

2  

132 +/- 40 

186 +/- 24

< 0,05 

1,41       

 

Оценка результатов.

В эксперименте N 1 число АОК на чашку в опыте было меньше, чем в контроле; индекс эффективности составил 0,55, что указывает на высокую активность Т-супрессоров в исследуемой селезенке. В эксперименте N 2 число АОК в опыте было больше, чем в контроле; индекс эффективности составил 1,41. Это указывает на повышенную активность Т-хелперов в исследуемой селезенке.

6.2.3. Исследование влияния испытуемого штамма на иммунореактивность - развитие гуморального иммунного ответа на гетерологичный антиген.

Определение АОК к эритроцитам барана (ЭБ) гетерологичному Т-зависимому антигену.

    Для  проведения этих экспериментов мышей разделить на 2 группы

по  10  штук  в  каждой. Мыши 1-ой группы иммунизированы изучаемым

вакцинным  препаратом,  мыши  2-ой группы интактные (контрольные).

                                                     7

Мышам  обеих  групп   ввести  внутривенно  по  2 x 10  эритроцитов

барана. Иммунный ответ на гетерологичный антиген оценивать через 4

суток  после  введения  эритроцитов.  Методика  определения  числа

АОК - см. п. 2.8.

Учет результатов.

Пример анализа результатов опыта приведен в таблице:

 

Группы мышей 

Число АОК на селезенку к эритроцитам барана 

1       

1568026 +/- 70 <*>             

2       

24400 +/- 4390               

<*> Отличие значимо (р < 0,05).                                

 

Оценка результатов.

Приведенные в таблице результаты показывают, что у вакцинированных животных иммунный ответ на гетерологичный антиген угнетен. Это является признаком временного иммунодефицита, обусловленного увеличением количества и функциональной активности Т-супрессоров и (или) снижением количества и функциональной активности Т-хелперов.

 

 

 

 

 

Приложение N 4

(обязательное)

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ

СВОЙСТВ ВАКЦИННОГО ШТАММА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

 

1. Испытуемую и эталонную культуры засевают в 3 пробирки под резиновыми пробками со средой ГКИ. Через 16-18 ч инкубации при температуре 37 град. С делают пересев на 3 пробирки с такой же средой. Таких пересевов делают не менее 20 раз. При каждом пассаже делают мазки из культуры, фиксируют их метиловым спиртом с 10% формалина и окрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение часа. При микроскопии не менее 5 мазков из культур каждого пассажа не должны обнаруживаться даже единичные капсульные бациллы. После проведения 20 пассажей, при отсутствии капсулообразования в этих условиях, пассированную культуру изучают более детально. Ее высевают на чашку Петри со средой Шефера или 1%-ный бикарбонатный агар и инкубируют 48 ч при температуре 37 град. С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (10-50%). После 48-часовой инкубации просматривают характер выросших колоний (см. п. 4.7.2.). В мазках из колоний не должно быть даже единичных капсульных бацилл. После 20-кратного пассирования культур на среде ГКИ проверяют их остаточную вирулентность для белых и черных мышей в соответствии с прилож. 2, она должна соответствовать п. 5.2.

2. Испытуемую культуру пассируют 10 раз на белых мышах массой 16-18 г с предварительным введением кортизона для повышения чувствительности животных к испытуемой культуре. Для этого пяти белым мышам вводят подкожно кортизон в дозе по 5 мг, а через 3 ч - внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл испытуемую культуру с концентрацией бактериальной взвеси 10 единиц по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Погибших или умерщвленных через 2 сут. мышей вскрывают, делают посевы из селезенки, печени и крови. Посевы инкубируют при температуре 37 град. С одни сутки. Из выросших, типичных для штамма колоний готовят взвесь в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, которую вводят новой группе белых мышей. Таких пассажей на мышах проводят не менее 10. При каждом пассаже контролируют отсутствие в мазках из органов даже единичных капсульных бацилл. После завершения 10 пассажей на мышах, подвергнутых действию кортизона, пассированную культуру испытуемого штамма проверяют высевом в среду ГКИ (отсутствие капсулообразования), на остаточную вирулентность для мышей (п. 5.2.) и на безвредность для морских свинок (п. 5.3.-5.5.) и кроликов (п. 5.6.).

    3.  Для  пассажа  испытуемого штамма на морских свинках в опыт

берут  молодых  животных массой 150-200 г; 2-3 животным испытуемую

                                   8

культуру  вводят подкожно в дозе 10  микробов в 1 мл (10 единиц по

стандарту  мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Через 2 сут. морских

свинок  умерщвляют,  делают  посевы  из  места  введения  и  ткани

селезенки  на агар Хоттингера (аминный азот 200-250 мг%). Выросшую

культуру  суспендируют  в  0,9%-ном  растворе  хлористого натрия и

далее  ведут  пассажи  на  морских  свинках аналогично пассажам на

белых  мышах,  но  без  применения кортизона. При вакцинном штамме

пассажи  часто  прерываются  из-за  того,  что культура от забитых

животных  не выделяется. В случае невыделения культуры испытуемого

штамма  после  3-кратного  повторения  предыдущего  пассажа, опыты

прекращают  и  считают,  что  штамм  стабилен  в организме морских

свинок не реверсирует в вирулентное состояние. В случае завершения

пассажей,   культуру   10-го   пассажа   проверяют  на  отсутствие

капсулообразования   на   среде   ГКИ   (п. 6.1.),  на  остаточную

вирулентность  для  мышей  (п. 3.3.)  и  безвредность  для морских

свинок и кроликов (п. 3.4. и п. 3.5.).

 

 

 

 

 

Приложение N 5

(обязательное)

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

ВАКЦИННОГО ШТАММА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

 

1. Определение индекса иммунитета (ИИ) для морских свинок.

Количественная оценка иммуногенности испытуемого штамма в опытах на морских свинках проводится в сравнении с эталонным вакцинным штаммом СТИ-I по индексу иммунитета.

Индекс иммунитета представляет собой частное от деления величины LD50 заражающей культуры для вакцинированных свинок на величину LD50 такой же культуры для контрольных свинок.

    Для  определения  индекса  иммунитета  по  60  морских  свинок

вакцинируют однократно подкожно испытуемой и эталонной культурами,

              7

в  дозе 5 x 10  спор, однократно подкожно, в объеме 1 мл. Через 21

день  вакцинированных  морских  свинок заражают подкожно введением

тест-заражающей  культуры  сибиреязвенного микроба  71/12  в дозах

  9    8    7    6

10 , 10 , 10 , 10  спор   и  вирулентным  штаммом  сибиреязвенного

                       2    3     4

микроба в дозах  10, 10 , 10 ,  10  по 5-6 вакцинированных морских

свинок на каждую  заражающую  дозу  каждого  штамма.  Одновременно

равноценные группы свинок,  не  подвергшихся вакцинации,  заражают

                                                      5    4    3

теми  же заражающими штаммами. Штамм 71/12 в дозах: 10 , 10 , 10 и

  2

10  спор, также по 5-6 животных на дозу. Наблюдения за зараженными

животными ведут 10 дней. Затем определяют величины LD50 заражающей

культуры  для  группы  вакцинированных  и  для  группы контрольных

морских свинок раздельно.

2. В опытах на кроликах иммуногенность испытуемого сибиреязвенного штамма оценивают путем заражения вакцинированных животных только высоковирулентным штаммом возбудителя сибирской язвы.

    По   10   кроликов   массой   2-2,5   кг,  породы  "шиншилла",

                                7

иммунизируют подкожно по  5 x 10  спор в объеме 1 мл испытуемого и

эталонного  вакцинного штаммов. Спустя 3 недели кроликов заражают.

Заражающая доза для вакцинированных кроликов, и для 3 контрольных,

невакцинированных,   должна  составлять  50  LD50  тест-заражающей

вирулентной   споровой   культуры.  Вирулентную  культуру  титруют

непосредственно  перед  заражением  на  той же партии животных. За

зараженными кроликами наблюдают 10 дней.

    3.  Количественную  оценку иммуногенности испытуемого штамма в

опытах   на   кроликах   проводят   путем   определения   величины

среднеэффективной дозы  - ЕД50. 4 группы кроликов, по 4 животных в

каждой группе, вакцинируют подкожно споровой культурой испытуемого

                                          8          7          6

и  контрольного  штаммов  дозами: 2,5 x 10 , 2,5 x 10 , 2,5 x 10 ,

        5

2,5 x 10  спор.  Через  3  недели после  вакцинации всех кроликов,

включая   3   контрольных   кроликов,  заражают  высоковирулентной

споровой  культурой возбудителя сибирской язвы подкожно, в дозе 10

смертельных  доз  (Dcl).  Результаты опыта учитывают через 10 дней

после   заражения.   По   выживаемости   вакцинированных  кроликов

вычисляют   величины   ЕД50 испытуемого  штамма  и  контрольного

вакцинного штаммов СТИ-I.

Опыт учитывают при условии гибели всех контрольных кроликов, сроки - до 4 суток после заражения.

    4.  Для  оценки  иммуногенности испытуемого штамма в опытах на

овцах   берут   животных  в  возрасте  1-1,5  года  из  стада,  не

подвергавшегося вакцинации против сибирской язвы. Не менее, чем 10

                                                          7

овцам  вводят  под кожу испытуемый штамм в дозе 1-1,5 x 10  спор в

объеме 1 мл. Для этого опыта могут быть использованы овцы из опыта

по  оценке  безвредности  вакцинного  штамма. Такую же группу овец

иммунизируют эталонным вакцинным штаммом СТИ в тех же дозах.

Через 20-30 дней вакцинированных овец и трех контрольных непривитых заражают внутрикожно 10 Dcl высоковирулентной сибиреязвенной споровой культуры в объеме 0,2 мл. Смертельную дозу споровой сибиреязвенной культуры определяют непосредственно перед опытом титрованием споровой взвеси на 6-9 овцах из того же невакцинированного стада, что и подопытные животные. Наблюдение за зараженными животными ведут 10 дней. После заражения все контрольные, невакцинированные овцы должны погибнуть от сибирской язвы. Специфический характер гибели невакцинированных и вакцинированных овец должен быть подтвержден положительной бактериоскопией мазков и положительным результатом посева крови, взятой из надреза уха трупа.

 

 



Все нормативно-правовые акты по медицине // Здравоохранение, здоровье, заболевания, лечение, лекарства, доктора, больницы //

Рейтинг@Mail.ru Яндекс цитирования

Copyright © Медицинский информационный ресурс www.hippocratic.ru, 2012 - 2017