УТВЕРЖДАЮ

Начальник Главного

санитарно-эпидемиологического

управления Минздрава СССР

П.ЛЯРСКИЙ

11 мая 1966 г. N 629-66

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ,

ВЫЗВАННЫХ ШИГЕЛЛАМИ, САЛМОНЕЛЛАМИ И ЭНТЕРОПАТОГЕННЫМИ

КИШЕЧНЫМИ ПАЛОЧКАМИ

 

I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

 

Острые кишечные заболевания бактериальной природы обычно вызываются патогенными бактериями семейства кишечных: салмонеллами (в том числе салмонеллами тифа, паратифа А, паратифа В), шигеллами, эшерихиями (энтеропатогенные кишечные палочки). Во всех случаях наиболее достоверным методом для подтверждения диагноза является выделение возбудителя, поэтому при всех подобных заболеваниях применяется бактериологический метод исследования.

В связи с тем что высев этиологического агента не всегда удается, значительную помощь в диагностике кишечных заболеваний оказывают серологические исследования.

Исследования для обнаружения патогенных кишечных микробов производятся с целью:

а) диагностики острого и хронического заболевания;

б) выявления бактерионосительства у реконвалесцентов перед выпиской из больницы;

в) выявления источника заболевания;

г) выявления бактерионосителей среди работников пищевых объектов, детских и лечебных учреждений, а также других лиц, приравненных к упомянутым группам.

Получение положительного результата при любом исследовании должно быть правильно истолковано в зависимости от совокупности обстоятельств: наличия заболевания у самого обследуемого или в его окружении, симптомов этого заболевания, характера материала, доставленного для исследования, профилактических или диагностических целей исследования и т.д.

Первоначальное представление о принадлежности микроба к семейству кишечных возникает на основании изучения его формы (палочки) и отношения к окраске по Граму (грамотрицательные). Однако все микробы семейства кишечных морфологически подобны, в связи с чем микроскопические признаки не являются дифференциальными. Основные различия между отдельными представителями этого семейства заключаются в разном метаболизме и антигенной структуре. Отсюда следует, что идентификация патогенных кишечных бактерий построена на определении их ферментативной и серологической характеристики.

Первичное выделение проводят на питательных средах с лактозой, позволяющих выявить разное отношение микробов к этому углеводу. Отсутствие способности ферментировать лактозу в первые сутки является одним из кардинальных дифференциальных признаков для патогенных микробов семейства кишечных (за исключением энтеропатогенных кишечных палочек). Дальнейшая идентификация основывается на способности расщеплять углеводы, мочевину и образовывать летучие продукты метаболизма (индол, сероводород). Идентификация заканчивается реакцией агглютинации с видовыми, типовыми и групповыми диагностическими сыворотками; она позволяет определить антигенную формулу изучаемой культуры, специфичную для рода, вида, подвида и типа.

Основные биохимические признаки некоторых родов семейства кишечных бактерий представлены в табл. 1.

 

Таблица 1

 

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НЕКОТОРЫХ РОДОВ СЕМЕЙСТВА КИШЕЧНЫХ

 

┌───────────┬───────┬─────────────────────────────────┬───────────────────┐

│Род микроба│Подвиж-│           Расщепление           │    Образование    │

│           │ность  ├───────┬───────┬────────┬────────┼────────────┬──────┤

│           │       │лактозы│глюкозы│сахарозы│мочевины│сероводорода│индола│

├───────────┼───────┼───────┼───────┼────────┼────────┼────────────┼──────┤

│Эшерихии   │  +/-  │ ++    │  ++   │  ++    │  -/+   │     +      │ +/-  │

│           │       │       │       │        │        │            │      │

│Салмонеллы │  +/-  │ -     │  ++   │  -     │  -     │     +/-    │ -    │

│           │       │       │  +-   │        │        │            │      │

│           │       │       │       │        │        │            │      │

│Шигеллы    │  -    │  -    │  +-   │   -    │  -     │     -      │ -/+  │

│           │       │ (+)   │       │  (+)   │        │            │      │

│           │       │ Зонне │       │        │        │            │      │

│           │       │       │       │        │        │            │      │

│Протеи     │  +    │ -     │  ++   │  -     │  +     │     +/-    │ +/-  │

└───────────┴───────┴───────┴───────┴────────┴────────┴────────────┴──────┘

 

Условные обозначения: + расщепляет (образует); - не расщепляет (не образует); ++ расщепляет с образованием кислоты и газа; +- расщепляет с образованием кислоты без газа; +/- большинство представителей расщепляет (образует); -/+ большинство представителей не расщепляет (не образует); (+) замедленное расщепление.

Примечание. Только шигеллы не обладают жгутиками и неподвижны; только протеи постоянно ферментируют мочевину.

 

Основными возбудителями острых кишечных инфекций, возникающих в виде спорадических заболеваний или эпидемических вспышек, являются шигеллы и салмонеллы тифа и паратифов А и В. Прочие салмонеллы чаще служат причиной пищевых токсикоинфекций, эпидемиология которых носит иной характер. Энтеропатогенные кишечные палочки являются, как правило, возбудителями колиэнтеритов у маленьких детей. Нередко имеют место смешанные инфекции или возникновение заболеваний, вызванных одним кишечным микробом на фоне носительства другого.

Полиэтиологичность кишечных заболеваний, сходная клиническая симптоматика при разных возбудителях и наличие стертых форм заболеваний диктуют необходимость проводить исследование, не упуская возможности выделения патогенного представителя любого из родов семейства кишечных.

 

II. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

 

1. Материал для исследования

 

Основным материалом для исследования служат испражнения. При заболеваниях, протекающих по типу пищевых токсикоинфекций, весьма целесообразно также исследование рвотных масс и промывных вод желудка. Кроме того, материалом для выделения бактерий являются кровь, моча, желчь, органы трупа и в некоторых случаях пунктат костного мозга, соскоб розеол и т.д.

При остром кишечном заболевании выделение из фекалий возбудителя - шигелл, салмонелл и энтеропатогенных кишечных палочек - удается тем чаще, чем раньше от начала заболевания производят исследование; особенно важно его провести до начала лечения антибиотиками <*>.

--------------------------------

<*> В больничных условиях материал для первого исследования следует забирать в приемном покое.

 

Появление у больного повторно некоторых, даже слабо выраженных клинических симптомов (повышение температуры до 37 град., незначительное ухудшение характера стула, его учащение и другие "микросимптомы"), как правило, сопровождается увеличением концентрации возбудителя в испражнениях.

Многократное бактериологическое исследование, производимое по обоснованным клиническим показаниям, увеличивает возможность обнаружения микробов, т.е. улучшает диагностику, уточняет сроки бактериовыделения и выписки, что весьма важно для своевременного и правильного лечения и проведения соответствующих противоэпидемических мероприятий.

При брюшном тифе и паратифах выделение возбудителей из фекалий и мочи является наиболее успешным с конца 2-й недели заболевания. При отрицательных результатах проводят повторные исследования с промежутками в 3-6 дней.

На 1-2-й неделе заболевания брюшным тифом или паратифами возбудителя легче всего выделить из крови (гемокультура). При исследовании на бактерионосительство дополнительным материалом для исследования служит желчь (дуоденальное содержимое).

Бактериологическое исследование органов трупа нужно производить как можно быстрее после смерти. В случае смерти от острых кишечных заболеваний исследованию подлежат: содержимое толстых и тонких кишок, отрезки кишечника, кусочки печени, селезенки, желчь, кровь, костный мозг, мезентериальные железы.

Материал для посева доставляют в стерильной посуде (пробирки, баночки и стаканчики), снабженной бумажной наклейкой, где указывается фамилия обследуемого и наименование исследуемого материала. К материалу, направленному в лабораторию на исследование, должен быть приложен препроводительный документ, в котором излагаются следующие данные: наименование учреждения, направляющего материал, фамилия, имя, возраст обследуемого, адрес, место работы, должность (если материал взят у ребенка, то указывают, посещает ли он детское учреждение и какое), дата заболевания, диагноз или другие показания к анализу, дата и время сбора материала, фамилия и должность лица, собиравшего материал.

Сбор испражнений для исследования. Наиболее полноценным материалом для исследования являются испражнения после дефекации. При естественной дефекации сбор производят с судна, горшка, пеленки стерильным деревянным шпателем или стерильной стеклянной палочкой, вмонтированными в ватную пробку пробирки. При наличии в испражнениях слизи или гноя их необходимо включать в посевной материал.

Судна и горшки после использования следует дезинфицировать осветленным раствором хлорной извести (но не лизолом или карболовой кислотой), а затем многократно и тщательно промывать горячей водой для того, чтобы на них не оставалось следов дезинфицирующих веществ.

Испражнения можно собирать также непосредственно из прямой кишки с помощью ректальной трубки (трубка Цимана). Стеклянная ректальная трубка имеет диаметр от 5 мм (для детей) до 10 мм (для взрослых) и длину около 150 мм; нижний конец ее запаян наглухо, как в пробирке, и на расстоянии 15-20 мм от него имеются два отверстия с оплавленными краями, расположенные с двух сторон (одно несколько ниже другого). Открытый конец трубки закрывают ватой, трубку через ватную или ватно-марлевую пробку опускают в пробирку и в таком виде стерилизуют. Такие трубки вводят в прямую кишку на 8-10 см. Собирая материал ректальной трубкой, надо добиваться получения достаточного для посева количества кала.

При профилактическом обследовании здоровых людей на носительство салмонелл исследуемым лицам необходимо давать предварительно (за 2-3 часа) 25-30 г сернокислой магнезии, которая является желчегонным и слабительным <*>. Сбор испражнений производят на стерильные эмалированные тарелки. Можно использовать также тазы, лотки, картонные тарелки, картонные стаканчики (при массовых обследованиях) или ректальные трубки после дефекации.

--------------------------------

<*> При отсутствии сернокислой магнезии можно давать глауберову соль в половинной дозе.

 

Больным и реконвалесцентам давать слабительное не рекомендуется. В этих случаях не следует также пользоваться ректальной трубкой для взятия материала.

Материал для исследования, как правило, не рекомендуется собирать в период применения антибиотиков.

При невозможности немедленного посева собранные порции испражнений или ректальную трубку с материалом помещают в пробирки с консервирующим раствором. В качестве консерванта лучше всего применять глицериновую смесь. Удовлетворительный результат дает также буферный раствор фосфорнокислых солей (pH 8,0). В пробирку наливают 5 мл консерванта; количество помещенных в него испражнений должно составлять около 1/3 объема консерванта (приготовление консервирующих растворов см. в Приложении 2).

Сбор мочи. Мочу (20-30 мл) собирают в стерильную посуду, перед посевом ее центрифугируют и осадок засевают на среды обогащения и плотные дифференциальные среды.

Взятие крови. Для бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов на 1-й неделе заболевания берут 5-10 мл крови стерильным шприцем из локтевой вены и засевают в соотношении 1:10 в одну из сред обогащения: желчную среду Раппопорт или бульон с 10-20% бычьей желчи (см. Приложение 2). Посев крови производят у постели больного с соблюдением правил асептики.

Хотя легче выделить культуру из крови в течение 1-2-й недели заболевания, ее можно высеять на протяжении всего лихорадочного периода и во время рецидивов, увеличивая количество засеваемой крови до 15-20 мл. Соотношение объемов засеваемой крови и питательной среды должно сохраняться и в этом случае.

При отсутствии желчи кровь можно засевать по способу Клодницкого и Самсонова в 80-100 мл стерильной дистиллированной или водопроводной воды.

При получении для исследования уже свернувшейся крови часть сыворотки отсасывают и используют для реакции Видаля, а сгусток после измельчения может быть посеян на желчные среды.

Взятие желчи (дуоденального содержимого). Пробы содержимого двенадцатиперстной кишки берут при помощи дуоденального зонда. Зондирование производят в лечебном учреждении или на бактерионосительском пункте. (Возможность применения этого метода исследования клиницист должен решать в каждом случае строго индивидуально.)

Зонд вводят обследуемому натощак. Через 15 минут после того как из зонда выделится первая порция дуоденального сока, в двенадцатиперстную кишку через зонд вводят 50 мл 30% стерильного раствора сернокислой магнезии. Этот раздражитель вызывает опорожнение желчного пузыря.

Необходимо собрать в отдельные стерильные пробирки порцию А из двенадцатиперстной кишки, порцию В из желчного пузыря и порцию С из желчных протоков. В лабораторию доставляют пробирки с двумя или тремя порциями желчи (А и В или А, В, С). Можно посеять и каждую порцию отдельно, и их смесь.

Дуоденальное содержимое имеет характерное зеленовато-желтое окрашивание, и для него свойственна щелочная реакция, поэтому до посева в пробах проверяют реакцию лакмусовой бумажкой. Если обнаружена кислая реакция и материал представляет собой белую жидкость с хлопьевидным осадком, что характерно для желудочного сока, то такой материал исследованию не подлежит.

Собранный материал необходимо доставлять в лабораторию без промедлений. Лишь в исключительных случаях допускается хранение материала не более суток в холодильнике при температуре +2, +4 град.

При транспортировке материала надо следить, чтобы жидкость в пробирках не смачивала ватные пробки, и предохранять собранный материал от замерзания.

 

2. Ход исследования испражнений, мочи,

дуоденального содержимого, трупного материала

 

Первый день исследования (посев материала на элективные среды). При любых показаниях к исследованию посев испражнений производят на чашку с плотной дифференциально-диагностической средой Плоскирева и в селенитовую среду обогащения, которая значительно увеличивает высеваемость салмонелл и шигелл.

В зависимости от показаний к обследованию при отсутствии селенитовой среды для посева испражнений можно применять следующие среды:

а) при кишечных заболеваниях неясной этиологии, при обследованиях на носительство и с профилактической целью посев делают на чашки со средами Плоскирева, Левина (или Асель-Либермана) и на среду обогащения Мюллера с последующим высевом на висмут-сульфитагар;

б) у больных с подтвержденной этиологией заболевания (дизентерия, брюшной тиф, паратифы, прочие салмонеллезы), а также в очагах заболеваний с известным возбудителем можно проводить исследование целенаправленно - на шигеллы или на салмонеллы. В первом случае посев производят на одну чашку со средой Плоскирева и на одну - со средой Левина или Асель-Либермана; во втором случае - на чашки с теми же средами, а также обязательно на среду обогащения Мюллера или Кауфмана с последующим высевом на висмут-сульфитагар. (О приготовлении сред обогащения см. Приложение 2.)

С целью выявления энтеропатогенных кишечных палочек у детей до 2 лет с дисфункцией кишечника и в окружении их делают дополнительный посев на чашку со средой Эндо или Асель-Либермана.

Посев мочи <*>, желчи и трупного материала производят на те же среды.

--------------------------------

<*> При посеве мочи в селенитовую среду обогащения последнюю берут в двойной концентрации и разводят пополам засеваемой мочой (см. Приложение 2).

 

Если испражнения доставлены в консерванте или среде обогащения, каплю взвеси испражнений наносят палочкой, вмонтированной в пробирку, пастеровской пипеткой или петлей на поверхность питательной среды у края чашки, тщательно растирают стерильным стеклянным или алюминиевым шпателем на небольшой площадке, а затем, оторвав шпатель от питательной среды, не прожигая его, делают посев по остальной поверхности среды.

При сборе испражнений ректальной трубкой после перемешивания ее содержимого с консервирующей жидкостью можно сделать ею же высев на чашку, после чего тщательно растереть материал шпателем.

Испражнения, доставленные без консерванта, суспендируют в физиологическом растворе в соотношении 1:10 и сеют, как указано выше. При наличии слизистых и гнойных примесей их следует включать в посевной материал.

Дуоденальное содержимое (желчь) засевают на чашку с плотной средой и во флаконы с бульоном в соотношении 1:10, после чего исходный материал оставляют в термостате. В течение последующих 3 дней делают высевы на плотные среды как из бульона, так и из пробирки с дуоденальным содержимым, которые в течение этого времени содержат в термостате при температуре 37 град.

Кусочки паренхиматозных органов трупа растирают в стерильной фарфоровой ступке с физиологическим раствором (1:5 - 1:10), после чего производят посев на плотные среды и среды обогащения.

На каждую чашку следует брать новую порцию любого посевного материала и в таком количестве, чтобы получить рост изолированных колоний.

Учитывая, что такие элективные среды, как среда Плоскирева и висмут-сульфитная, подавляют рост кишечных сапрофитов, целесообразно увеличить количество посевного материала на этих средах в 3-5 раз по сравнению со средами Эндо и Левина.

Непременным условием для получения изолированных колоний является отсутствие конденсата на поверхности питательной среды, что достигается розливом охлажденной до температуры 50 град. среды и ее подсушиванием. Готовить среду лучше накануне.

Для высокоэлективных сред (Плоскирева, висмут-сульфитной и др.) можно пользоваться крышками из картона, вырезанными на 0,5 см шире диаметра чашки. Картон впитывает пары жидкости и устраняет их конденсацию на поверхности питательной среды. В этом случае среду готовят в день посева. Картонные крышки стерилизуют отдельно от чашек.

При посеве испражнений в среды обогащения соблюдают соотношение посевного материала и среды 1:5. Засеянные чашки, пробирки со средами обогащения и др. помещают в термостат при температуре 37 град. на 18-20 часов.

Учитывая возможность неудачи первичного посева (отсутствие роста или сплошной рост), исследуемый материал хранят в холодильнике до следующего дня.

Второй день исследования. Через 18-20 часов производят просмотр посевов на чашках и отбор подозрительных колоний, а также высев из сред обогащения на плотные питательные среды.

Для отбора подозрительных колоний посевы на чашках со средами Плоскирева и Левина рассматривают простым глазом или с помощью лупы в проходящем дневном или искусственном свете; посевы на чашках с висмут-сульфитным агаром рассматривают в падающем свете.

Патогенные кишечные бактерии на всех средах растут в виде круглых колоний с ровными краями диаметром 1-2 мм. На средах с эозином и метиленовым синим (Левина), среде Эндо, среде Асель-Либермана колонии шигелл и салмонелл бесцветные, прозрачные (реже слегка мутноватые), нежные. Колонии палочек Зонне более плотные, иногда белесоватые. На среде Плоскирева у всех патогенных микробов колонии также бесцветные, но более плотные и меньших размеров. На всех перечисленных средах шигеллы Зонне могут образовывать крупные, мутноватые колонии с изрезанными краями (так называемая плоская форма). На висмут-сульфитном агаре салмонеллы тифа и паратифов вырастают, как правило, в виде черных или серовато-зеленых колоний с черным центром. Почти все салмонеллы изменяют цвет этой среды так, что на месте снятой колонии остается черный след. Просмотр чашек с висмут-сульфитным агаром производят через 24 и 48 часов после посева.

Колонии, подозрительные в отношении принадлежности к шигеллам или салмонеллам, пересевают в пробирки с комбинированными средами: средой Ресселя или "скошенным столбиком с мочевиной". На комбинированной среде посев делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. С каждой чашки снимают не менее 3 подозрительных колоний. Пробирки с посевами инкубируют в термостате при температуре 37 град. до следующего дня.

Если на чашках подозрительные колонии отсутствуют, а посев на среды обогащения не производили, может быть дан отрицательный ответ. Если материал был посеян в среду обогащения, ответ выдают после учета результатов дополнительного высева. Высев из селенитовой среды обогащения производят на чашку со средой Плоскирева, а из сред Мюллера и Кауфмана - на чашку с висмут-сульфитным агаром.

Из посева желчи на бульон и исходной желчи, содержащихся в термостате, делают первый высев на чашки с висмут-сульфитным агаром и средой Плоскирева.

При исследовании на наличие энтеропатогенных кишечных палочек производят пробную агглютинацию на стекле подозрительных колоний со среды Эндо или Асель-Либермана. Посевы рассматривают в падающем или проходящем свете. Колонии энтеропатогенных кишечных палочек большей частью малинового цвета с фиолетовым оттенком, реже розовые, как правило, не имеют металлического блеска. В случае роста однотипных колоний 10 из них испытывают в реакции агглютинации на стекле с комплексными сыворотками против наиболее распространенных серотипов (О111В4, О55В5, О26В6 и т.д.) <*>.

--------------------------------

<*> Смеси сывороток к энтеропатогенным кишечным палочкам, наиболее часто вызывающим острые кишечные заболевания у маленьких детей, выпускают производственные отделы институтов. Смеси можно приготовить и в лаборатории из неадсорбированных сывороток. Их составляют не более чем из 5 типовых сывороток: при этом разведение каждой сыворотки не должно быть больше 1:10. Например, в смесь из 5 сывороток берут по 1 мл сыворотки и 5 мл физиологического раствора. При В-титре не выше 1:200 следует делать разведение не более 1:5.

 

В пробной агглютинации испытывают только часть колонии для того, чтобы в случае положительной реакции можно было выделить культуру из остальной части колонии для ее дальнейшей идентификации.

Если на чашке вырастает несколько видов колоний (типичные, с металлическим блеском и без такового, разного размера), то в пробной агглютинации испытывают все виды колоний.

Колонии, давшие положительную реакцию агглютинации с одной из сывороток, высевают на скошенный агар. Если микробы из всех отобранных колоний не агглютинировались, дается отрицательный ответ. При наличии бесцветных, прозрачных колоний, подозрительных на принадлежность к шигеллам и салмонеллам, их отсевают для дальнейшего изучения.

Если в результате прямого посева испражнений при исследовании как на шигеллы и салмонеллы, так и на патогенные эшерихии не выросло вообще ни одной колонии, необходимо произвести повторный высев, увеличив порцию засеваемого материала. При повторном отсутствии роста следует получить новый материал для анализа.

Третий день исследования. Через 48 часов производят идентификацию культур, высеянных накануне на среду Ресселя или "скошенный столбик", по ферментации лактозы, глюкозы и мочевины, а также по серологическим свойствам в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными специфическими сыворотками. Предварительно следует убедиться в чистоте культуры, выросшей на среде Ресселя или "скошенном столбике с мочевиной". При сомнении в чистоте культуры производят рассев ее на чашки со слабо щелочным питательным агаром; при росте через 18-24 часа однородных колоний можно считать выделенную культуру чистой, при неоднородном росте все виды колоний отсевают на среду Ресселя или "скошенный столбик с мочевиной".

На этих средах в случае ферментации глюкозы реакция среды становится кислой и цвет индикатора в столбике изменяется. Если при расщеплении глюкозы, помимо кислоты, образуется газ, в среде появляются пузырьки. При ферментации лактозы изменяется цвет индикатора в скошенной части среды. При расщеплении мочевины увеличивается щелочность сред и цвет соответствующего индикатора меняется.

Если культуры, высеянные на "короткий" пестрый ряд, сбраживают лактозу и глюкозу с образованием газа, они принадлежат к разновидностям кишечной палочки. Если культуры расщепляют мочевину, они относятся к роду протеев. В этих случаях, если не был произведен посев в среду обогащения, дают отрицательный ответ.

Культуры, не расщепляющие лактозу и мочевину, но ферментирующие глюкозу, подвергают дальнейшему изучению. Исследуют морфологию выделенного микроба в мазке, окрашенном по Граму. Все бактерии семейства кишечных являются грамотрицательными палочками.

Культуры, ферментирующие глюкозу без газообразования, подозрительны как относящиеся к дизентерийным или брюшнотифозным.

Палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, т.е. дающие в среде пузырьки, могут принадлежать к роду салмонелл.

Все подозрительные культуры пересевают на пестрый ряд, состоящий из полужидких или жидких с поплавками сред с маннитом и сахарозой, а также на бульон для определения образования индола и сероводорода. С этой целью под пробку в пробирке с бульоном помещают две индикаторные бумажки (способ приготовления индикаторных бумажек см. в Приложении 2). При наличии индола соответствующая бумажка краснеет, при выделении сероводорода - другая чернеет. Бульон можно заменить 1% пептонной водой.

Если посев был произведен на полужидкие среды с углеводами, они могут быть использованы для определения подвижности культуры. При употреблении жидких сред с поплавками для определения подвижности в пестрый ряд включают пробирку с полужидким агаром (0,2%).

Серологическая идентификация культур, ферментирующих глюкозу без газообразования. Ее производят путем постановки реакции агглютинации на стекле с адсорбированными сыворотками.

Реакцию ставят следующим образом: на обезжиренное предметное стекло наносят 3-4 капли различных сывороток. Петлю исследуемой культуры вносят в сыворотку и тщательно размешивают ее путем растирания круговыми движениями петли. После каждой сыворотки петлю прожигают на огне. Положительная реакция на стекле должна наступить в течение 1-3 минут.

В соответствии с частотой выделения разных видов возбудителей в целях экономии труда, времени и диагностических препаратов сыворотки для постановки реакции применяют в определенной последовательности.

Сначала испытывают культуру в реакции с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой Флекснера, Ньюкестл, Зонне <*>.

--------------------------------

<*> Поливалентные сыворотки готовят производственные отделы институтов. Приготовление в лаборатории смеси из адсорбированных сывороток не допускается, так как они не подлежат разведению.

 

При наличии отрицательного результата культуру проверяют с адсорбированными брюшнотифозными сыворотками (9, Vi, d).

Если культура не агглютинируется О-сывороткой (9), но агглютинируется Vi-сывороткой, О-агглютинабильность может быть восстановлена путем разрушения Vi-антигена, расположенного на поверхности клетки и препятствующего реакции агглютинации с О-сывороткой. Разрушение Vi-антигена достигается путем нагревания культуры в водяной бане в течение часа при температуре 56 град. Для агглютинации с О- и Vi-сыворотками культуру следует брать с косяка среды Ресселя или "скошенного столбика", а для агглютинации с Н-сывороткой (d) - из конденсационной воды.

В случае положительной реакции агглютинации на стекле с адсорбированными брюшнотифозными сыворотками серологическая идентификация культуры может считаться законченной.

При отсутствии агглютинации с этими сыворотками применяют другие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сыворотки к шигеллам Бойда, Григорьева-Шига и Штуцера-Шмитца, Лардж-Сакса (3, 4, 5, 6, 7) и провизорных типов (8, 9, 10) <*>.

--------------------------------

<*> Необходимо учесть, что, кроме салмонеллы брюшного тифа, встречаются очень редко варианты салмонелл, не образующие газа при ферментации углеводов. Поэтому культуры, не агглютинирующиеся всеми перечисленными сыворотками, следует испытывать с салмонеллезными поливалентными сыворотками.

 

При положительном результате реакции агглютинации на стекле с одной из поливалентных сывороток продолжают серологическую идентификацию культуры, для чего ее испытывают с адсорбированными сыворотками, входящими в состав поливалентной.

Например, если получена положительная реакция с поливалентной сывороткой Флекснера, Ньюкестл, Зонне, культуру испытывают раздельно с поливалентной агглютинирующей адсорбированной сывороткой Флекснера и с адсорбированными сыворотками Ньюкестл и Зонне.

Для шигелл, не имеющих подразделения на серологические типы, в случае положительной реакции с соответствующей моновалентной адсорбированной сывороткой серологическая идентификация может считаться законченной (Зонне, Ньюкестл, Штуцера-Шмитца, Григорьева-Шига).

При положительной реакции с поливалентными сыворотками Флекснера, Бойда, Лардж-Сакса и провизорных типов производят серологическое типирование согласно новой отечественной классификации дизентерийных бактерий (см. табл. 7):

а) для культур Флекснера с помощью типовых (I, II, III, IV, V) и групповых (3, 4, 6, 7, 8) сывороток;

б) для культур Бойда с помощью типовых (с 1 по 15) сывороток;

в) для культур Лардж-Сакса с помощью типовых (с 3 по 7) сывороток;

г) для культур провизорных типов с помощью типовых (с 8 по 10) сывороток.

Серологическая идентификация культур, ферментирующих глюкозу с образованием газа. Серологическую идентификацию газообразующих культур начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле с агглютинирующими адсорбированными поливалентными салмонеллезными О-сыворотками: групп A, B, C, D, E и редких групп.

При получении отрицательного результата следует проверить культуру в реакции агглютинации на стекле с адсорбированной сывороткой Ньюкестл (рецептор VI) <*>.

--------------------------------

<*> Среди дизентерийных культур Ньюкестл иногда встречаются газообразующие варианты, поэтому культуры грамотрицательных газообразующих палочек надо испытывать сывороткой Ньюкестл.

 

При положительной реакции с одной из поливалентных салмонеллезных сывороток ставят реакцию раздельно с каждой из О-сывороток, входящих в поливалентную, для определения, к какой из групп по схеме Кауфмана-Уайта принадлежит выделенная культура.

Например, при положительной реакции агглютинации с поливалентной сывороткой групп А, В, С, D, Е культуры агглютинируют последовательно с монорецепторными салмонеллезными О-сыворотками (2, 4, 7, 8, 9, 3, 10).

После установления принадлежности к группе (А, В, С, D, Е или другой) испытывают культуру с адсорбированными монорецепторными Н-сыворотками против Н-антигенов специфической фазы салмонелл, входящих в данную группу. При этом Н-сыворотки применяют в порядке, соответствующем распространению видов салмонелл в данной местности. После определения специфической (1-й) фазы Н-антигена испытывают культуру в реакции на стекле с сыворотками против неспецифической (2-й) фазы Н-антигена и таким образом устанавливают антигенную формулу выделенной культуры (см. Приложение 4, табл. 9).

Реакцию агглютинации с адсорбированными (монорецепторными) сыворотками ставят на стекле по методике, описанной выше. При наличии соответствующего антигена агглютинация салмонелл монорецепторными сыворотками наступает в течение 1-2 минут.

Для агглютинации с О-сыворотками культуру следует брать с верхней части скошенного агара, для агглютинации с Н-сыворотками - из конденсационной воды, где расположены наиболее подвижные особи.

В лаборатории нельзя готовить самостоятельно смеси из отдельных монорецепторных О- и Н-сывороток, так как они не подлежат разведению. Можно готовить смеси из неадсорбированных сывороток к представителям разных салмонелл (например, из сывороток к салмонеллам паратифа А, typhi murium, cholerae suis, newport, enteritidis, anatum). В этом случае берут по 1 части сывороток и добавляют 19 частей физиологического раствора, чтобы получить разведение каждой сыворотки 1:25. Эту смесь можно применять взамен адсорбированной поливалентной сыворотки групп A, B, C, D, E.

Серологическая идентификация энтеропатогенных эшерихий. Культуры, выделенные с чашек со средой Эндо или Асель-Либермана, вновь испытывают в реакции агглютинации на стекле со смесью агглютинирующих ОВ-колисывороток.

Если культура, выросшая на скошенном агаре, не агглютинируется смесью ОВ-сывороток, выдается отрицательный ответ.

Культуры, дающие положительную реакцию в смеси сывороток, испытывают далее с каждой из типовых сывороток, входящих в данную смесь. Типовые сыворотки разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5 - 1:10. При положительном результате агглютинация наступает быстро и носит крупнохлопчатый характер.

Если культура агглютинируется всеми или несколькими сыворотками, входящими в смесь, выдается отрицательный ответ.

При положительном результате с одной из сывороток и при отсутствии агглютинации в физиологическом растворе хлористого натрия ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках, начиная с разведения 1:50 и до титра сыворотки, указанного на ампуле, со взвесью живой культуры для определения титра В-антигена и с гретой (1 час при температуре 100 град.) - для определения О-антигена. Для приготовления взвеси культуру смывают физиологическим раствором с поверхности скошенного агара, после чего часть ее, отлитую в отдельную пробирку, прогревают в водяной бане при температуре 100 град. в течение часа. Методика разведения сыворотки аналогична той, которая описана для постановки реакции Видаля.

Одновременно производят посев той же культуры на среду Ресселя с лактозой и глюкозой, на среды с маннитом и сахарозой и на бульон (или 1% пептонную воду) для обнаружения индола. Пробирки с посевами и штативы с реакцией агглютинации ставят в термостат на 18-20 часов.

Независимо от положительного или отрицательного результата серологического исследования все выделенные культуры и их дубликаты должны храниться в лаборатории вплоть до выдачи окончательного ответа.

Кроме серологической идентификации выделенных культур, на 3-й день исследования производят просмотр чашек с посевами из сред обогащения.

Подозрительные колонии отсевают на среду Ресселя или "скошенный столбик с мочевиной".

В случае применения селенитовой среды обогащения при отсутствии подозрительных колоний на чашке со средой Плоскирева (если результат первичного посева был также отрицательным) может быть выдан окончательный отрицательный ответ.

Чашки с висмут-сульфитным агаром, применявшимся для высева из среды Мюллера, независимо от результатов их просмотра оставляют в термостате еще на 24 часа. На 3-й день также просматривают чашки с первым высевом дуоденального содержимого из флаконов с бульоном. Подозрительные колонии пересевают на среду Ресселя или "скошенный столбик с мочевиной".

Независимо от наличия или отсутствия подозрительных колоний производят второй высев на чашки из флаконов с посевом дуоденального содержимого.

Кроме перечисленных выше обязательных методов, в случае необходимости на 3-й день могут быть произведены также некоторые дополнительные виды исследования: посевы для определения фаголизабильности выделенного микроба и его чувствительности к антибиотикам.

Определение чувствительности дизентерийных культур к поливалентному дизентерийному бактериофагу и брюшнотифозных культур к брюшнотифозному фагу может оказать значительную помощь при их идентификации.

Проще всего определение фаголизабильности вести в бульоне по следующей методике: в 2 пробирки с бульоном (pH 7,6), разлитым по 4,5 мл, засевают изучаемую культуру, в одну из пробирок после посева добавляют 0,5 мл дизентерийного бактериофага, другая пробирка остается контрольной. Учет результатов проводят через 4-5 часов и через 18-20 часов инкубации при температуре 37 град.

При положительном результате в опытной пробирке рост задержан, она остается прозрачной, в контрольной - микробы размножаются и бульон становится мутным.

Однако более четкие результаты дает испытание фаголизабильности на плотной среде. Для этого на хорошо подсушенную чашку со слабо щелочным агаром (pH 7,6) наносят пастеровской пипеткой большие капли смыва 18-20-часовой агаровой культуры. На подсохшие капли культуры петлей или оттянутой пастеровской пипеткой наносят дизентерийный бактериофаг. Чашки подсушивают, после чего их перевертывают и помещают в термостат при температуре 37 град. на 18-20 часов. При положительном результате наблюдается задержка роста культуры на чашках с бактериофагом.

Культуры салмонелл испытывают на чувствительность к салмонеллезному О-фагу (см. ниже).

Для определения чувствительности микроба к наиболее широко применяемым антибиотикам смыв испытуемой культуры засевают сплошным газоном на чашку со слабо щелочным питательным агаром. Засеянные чашки подсушивают и на них, на расстоянии 2 см от края чашки, пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные различными антибиотиками. В настоящее время выпускают цветные диски: зеленые - пропитанные пенициллином, сиреневые - стрептомицином, синие - левомицетином, оранжевые - биомицином и ряд других. Чашки помещают в термостат при температуре 37 град. на 16-18 часов.

Отсутствие зоны задержки роста вокруг диска указывает на устойчивость микроба к данному антибиотику; зона задержки до 15 мм показывает, что микроб малочувствителен, от 15 до 25 мм - чувствителен и более 25 мм - высокочувствителен.

Эти методы определения чувствительности микробов к фагам и антибиотикам являются наиболее простыми и удобными для практических лабораторий.

В крупных, хорошо оснащенных лабораториях эти исследования можно производить при необходимости количественного определения методом серийных разведений, описанным в соответствующих руководствах.

Четвертый день исследования. Через 72 часа учитывают результаты посевов на пестрый ряд: ферментацию углеводов, образование индола и сероводорода, кислото- и щелочеобразование. Определяют подвижность бактерий по характеру роста на полужидких средах. Диффузный рост и помутнение всей среды указывают на подвижность микробов. Неподвижные бактерии растут только по ходу укола. Слабо подвижные варианты растут в виде отдельных мутных включений или ответвлений от роста по ходу укола. Подвижность можно определить также в раздавленной или висячей капле бульонной культуры.

Учитывают также результаты исследований чувствительности выделенных культур к бактериофагу и антибиотикам.

Таким образом, на 4-й день исследования для культур, выделенных из первичного посева, имеется сумма сведений об их антигенной структуре и биохимических свойствах, достаточная для окончательной идентификации штаммов с типичной характеристикой.

К роду шигелл относят культуры грамотрицательных неподвижных палочек, которые:

а) разлагают глюкозу без образования газа <*>;

--------------------------------

<*> Об исключениях см. ниже.

 

б) не разлагают в 1-е сутки лактозу;

в) не расщепляют мочевину;

г) обладают четкой серологической характеристикой, определяемой с помощью адсорбированных дизентерийных агглютинирующих сывороток (видовых, типовых, групповых);

д) имеют прочие ферментативные свойства, характерные для данного вида, типа (см. Приложение 4, табл. 5 и 6).

К роду салмонелл относят культуры грамотрицательных подвижных <*> палочек, которые:

--------------------------------

<*> Об исключениях см. ниже.

 

а) сбраживают глюкозу и маннит с образованием или без образования газа;

б) не ферментируют лактозу, сахарозу и мочевину;

в) не образуют индола;

г) обладают четкой серологической характеристикой, определяемой с помощью адсорбированных монорецепторных О- и Н-салмонеллезных агглютинирующих сывороток <*>.

--------------------------------

<*> Морфологические, биохимические и серологические свойства патогенных кишечных бактерий см. в таблицах Приложения 4.

 

При выделении подобных культур дается положительный ответ <*>.

--------------------------------

<*> Исследование культур, выделенных из сред обогащения, ведется так же, как это описано для культур, выделенных из первичного посева, но с опозданием соответственно на 1-2 дня.

 

Если же имеются отклонения от типичной серологической или биохимической характеристики, культуру подвергают дальнейшему изучению на месте или в более квалифицированной лаборатории, как это описано в соответствующей главе (см. ниже).

При исследованиях на патогенные серотипы кишечной палочки учитывают результаты развернутой реакции агглютинации с живой и гретой культурой.

Реакция считается положительной, если имеется агглютинация гретой культуры на 3-4 креста в пробирке с разведением сыворотки не ниже половины ее титра и живой культуры не менее чем в 1-2-м разведениях сыворотки (1:50 - 1:100).

На 4-й день исследования производят также второй просмотр чашек с посевами на висмут-сульфитный агар. При отсутствии подозрительных колоний на висмут-сульфитном агаре и отрицательном результате прямого посева испражнений и мочи выдается отрицательный ответ.

В случае роста подозрительных колоний работа ведется так же и в той же последовательности, как описано для второго дня исследования.

Кроме того, в этот день производят просмотр чашек со вторым высевом дуоденального содержимого из бульона и третий высев дуоденального содержимого из бульона <*>.

--------------------------------

<*> Третий высев дуоденального содержимого производят в том случае, если из первых высевов выделить патогенные бактерии не удалось.

 

3. Исследование крови для ранней диагностики брюшного тифа,

паратифов А и В и других салмонеллезных заболеваний

 

Первый день исследования. Кровь, засеянную в среду Раппопорт, желчный бульон или дистиллированную воду, помещают в термостат при температуре 37 град. на 18-20 часов.

Второй день исследования (через 24 часа). Производят просмотр посевов на средах обогащения. При росте салмонелл в первоначально прозрачной среде появляется помутнение, при росте газообразующих микробов в поплавке появляется пузырек газа. Если необходимо срочно получить ориентировочные данные о природе выделенной культуры, можно сделать из среды Раппопорт (или другой) препарат для определения подвижности микробов и окраски по Граму для просмотра в микроскопе.

В любом случае делают пересев с жидкой среды на чашки с дифференциальной средой Эндо или Левина. Так как благодаря стерильности крови микроб обычно выделяется в чистой культуре, можно дифференциальную среду заменить обычным питательным слабо щелочным агаром (pH 7,2-7,4).

Третий день исследования (через 48 часов). Просматривают чашки. Если имеется обильный рост однородных колоний (чистая культура), то 2-3 колонии отсевают на пробирки со средой Ресселя или "скошенным столбиком с мочевиной". Затем несколько колоний снимают одной петлей, испытывают в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными О-, Vi- и Н-салмонеллезными сыворотками, в первую очередь, к салмонеллам тифа, паратифов А и В.

В случае обнаружения грамотрицательных палочек, агглютинирующихся какой-либо из салмонеллезных сывороток, выдают предварительный положительный ответ. При отсутствии ясных данных по первичному посеву делают второй высев на чашки с плотной питательной средой.

Четвертый день исследования (через 72 часа). После учета результатов посева на среды с углеводами и установления антигенной формулы выделенной культуры при помощи повторной реакции агглютинации на стекле с О- и Н-монорецепторными сыворотками дают окончательный положительный ответ.

Если первые два высева из среды обогащения были отрицательными, делают третий высев на чашки на 5-е сутки (через 120 часов).

Предварительный отрицательный ответ при исследовании крови выдают после отрицательного результата третьего высева, т.е. на 6-й день исследования. Окончательный отрицательный ответ может быть выдан только после четвертого высева на 10-й день.

 

4. Сроки выдачи и формулировка ответов

 

1. При отрицательном результате (отсутствии подозрительных колоний) прямого посева испражнений, мочи и трупного материала <*> и отсутствии посевов в среды обогащения на 2-й день исследования выдают отрицательный ответ: "Патогенные бактерии семейства кишечных не обнаружены" <**>.

--------------------------------

<*> В том числе и при исследованиях на патогенные серотипы кишечных палочек.

<**> При посеве испражнений от детей в возрасте до 2 лет такой ответ выдают только в случае отсутствия на среде Эндо или Асель-Либермана колоний, агглютинирующихся смесью ОВ-колисывороток.

 

2. При отрицательном результате прямого посева испражнений, мочи, трупного материала и отсутствии подозрительных колоний на среде Плоскирева после высева из селенитовой среды обогащения при анализе на шигеллы и салмонеллы отрицательный ответ в такой же формулировке выдают на 3-й день.

3. На 3-й день выдают также отрицательный ответ при исследованиях на энтеропатогенные серотипы кишечной палочки в случае отрицательного результата реакции агглютинации на стекле с ОВ-сыворотками культуры, выросшей на скошенном агаре. Ответ формулируют: "Патогенные серотипы кишечных палочек не обнаружены".

4. При применении сред обогащения Мюллера и Кауфмана для исследования на салмонеллы при отрицательном результате прямого посева испражнений, мочи и трупного материала и отсутствии подозрительных колоний на висмут-сульфитном агаре, а также при отрицательном результате развернутой реакции агглютинации при анализе на патогенные серотипы кишечной палочки отрицательный ответ выдают на 4-й день.

5. Отрицательный ответ при исследовании дуоденального содержимого выдают лишь после третьего отрицательного высева, т.е. на 5-й день исследования.

6. Если из прямого посева испражнений, мочи, трупного материала и дуоденального содержимого выделена культура шигеллы, салмонеллы или патогенной кишечной палочки, типичная по морфологии, антигенным и биохимическим свойствам, на 4-й день исследования выдают ответ <*>: "Патогенные бактерии семейства кишечных обнаружены. Выделена палочка (указать род, вид и тип выделенного микроба)".

--------------------------------

<*> При выделении культур шигелл и салмонелл из посевов из сред обогащения сроки выдачи положительных ответов отодвигаются соответственно на 1-2 дня.

 

7. При обследовании в очагах инфекционных заболеваний для быстрейшей изоляции источников инфекции, а также при диагностических исследованиях для быстрейшего установления диагноза и назначения соответствующего лечения допускается выдача предварительного положительного ответа. Такой ответ выдают на 3-й день исследования в том случае, если выделена культура салмонеллы или шигеллы, имеющая типичные биохимические свойства на среде Ресселя или "скошенном столбике" и полностью идентифицированная серологически.

Ответ формулируют следующим образом: "Выделена палочка, подозрительная как шигелла (салмонелла). Окончательный ответ будет дан через 24 часа (указать род, вид и тип микроба)".

8. В некоторых случаях допускается производство анализов на шигеллы и салмонеллы ускоренным методом, без посева выделенной культуры на пестрый ряд. Такая методика допустима при массовых обследованиях очагов заболеваний с известной этиологией в случае выделения в окружении больного идентичных культур, а также при повторных обследованиях больных, от которых аналогичная культура уже была выделена ранее.

В этих случаях при условии выделения культуры, типичной по биохимическим свойствам на среде Ресселя или "скошенном столбике" и полностью серологически идентифицированной соответствующими адсорбированными сыворотками, может быть выдан на 3-й день исследования окончательный положительный ответ, сформулированный, как указано в п. 6 <*>.

--------------------------------

<*> Положительный ответ при исследованиях на патогенные серотипы кишечной палочки может быть выдан только после учета развернутой реакции агглютинации с живой и гретой культурой, т.е. на 4-й день исследования.

 

9. При исследовании крови на гемокультуру положительный и окончательный отрицательный ответ выдают в сроки, указанные в соответствующем разделе, в той же формулировке, что и при исследовании других материалов.

10. Предварительный отрицательный ответ при исследовании крови выдают на 6-й день после отрицательного результата третьего высева и формулируют следующим образом: "Патогенные бактерии семейства кишечных не выделены. Исследование продолжается. Окончательный ответ (указать дату)".

 

5. Затруднительные случаи идентификации выделенных культур

 

Затруднения в идентификации выделенных культур могут возникнуть:

а) если выделена культура патогенных кишечных бактерий с какими-либо отклонениями от типичной характеристики;

б) если выделена культура непатогенных бактерий семейства кишечных, сходная по ряду признаков с какими-либо патогенными бактериями.

В зависимости от того, обнаруживает ли изучаемая культура сходство с шигеллами или салмонеллами, идентификацию следует проводить различно. Однако во всех случаях прежде всего надо убедиться в том, что выделена чистая культура, для чего следует сделать рассев на чашке со слабо щелочным питательным агаром с последующим изучением морфологических, биохимических и антигенных свойств субкультур, полученных из снятых через 18-20 часов колоний.

Идентификация культур, подозрительных на принадлежность к шигеллам. Наиболее часто встречающиеся затруднения связаны с выделением культур, сходных по ряду признаков с дизентерийными, но относящихся к представителям других родов семейства кишечных бактерий.

Затруднения в идентификации таких культур возникают потому, что по биохимическим свойствам при посеве на "короткий" пестрый ряд они ведут себя аналогично дизентерийным бактериям, но не агглютинируются противодизентерийными сыворотками. Наряду с этим встречаются штаммы непатогенных кишечных бактерий, которые, помимо сходства биохимических признаков, обнаруживают и серологическое родство с шигеллами и могут агглютинироваться поливалентными и противодизентерийными сыворотками, главным образом к виду Флекснер.

Однако окончательное серологическое типирование в таких случаях, как правило, не удается.

Агглютинабильность этих культур дизентерийными сыворотками, как установлено в настоящее время, объясняется тем, что между отдельными представителями родов шигелла и эшерихиа имеется частичная общность, а в некоторых случаях и идентичность О-антигенных комплексов, а также частичная общность так называемых фимбриальных антигенов дизентерийных бактерий Флекснера и кишечных палочек.

При этом чаще всего речь идет о неподвижных, не образующих газа при расщеплении углеводов и не расщепляющих или медленно расщепляющих лактозу представителях семейства кишечных бактерий.

Идентификация таких культур проводится путем более углубленного изучения их культуральных, серологических и, что самое важное, биохимических свойств.

Тесты для дифференцирования шигелл от некоторых наиболее часто встречающихся сходных с ними бактерий даны в табл. 5, 6, 11.

Наибольшее сходство с шигеллами наблюдают у бактерий алкалесценс-диспар, которые достаточно часто обнаруживают при исследованиях испражнений.

Дифференциальным признаком для культур алкалесценс-диспар, не сбраживающих лактозу, является щелочеобразование на синтетической лакмусовой сыворотке (лакмус-мольке) или цитратной среде Кристенсена через 24-48 часов, а для культур, образующих на этих средах кислоту, дифференциальным признаком может служить створаживание молока.

Некоторые виды эшерихий и бактерий рода цитробактер могут быть ошибочно отнесены к шигеллам при позднем или слабом газообразовании. Для дифференцирования таких штаммов от шигелл следует использовать жидкие углеводные среды с поплавками, где ферментация углеводов проходит более интенсивно и облегчается учет газообразования. Большую помощь в этих случаях может оказать выявление способности к замедленной ферментации лактозы. Чтобы ускорить обнаружение этого признака, нужно использовать среду с повышенным содержанием лактозы (4%) и пониженным содержанием пептона (0,5%). Способность к расщеплению лактозы в этих условиях проявляется на 2-3-и сутки.

Существенное значение имеет определение подвижности выделенного микроба, которое в таких случаях следует производить на полужидком (0,2%) агаре, а также в висячей или раздавленной капле 4-6-часовой бульонной культуры.

Если сумма биохимических и морфологических признаков изучаемой культуры позволяет исключить ее принадлежность к шигеллам <*>, может быть выдан отрицательный ответ независимо от того, агглютинируется ли культура дизентерийными сыворотками. При этом надо учесть, что свежевыделенные культуры бактерий алкалесценс, наиболее часто вызывающие затруднения при дифференцировании непатогенных бактерий от шигелл, являются нередко инагглютинабильными вследствие наличия у них поверхностного антигена. Агглютинабильные О-варианты бактерий алкалесценс легко получить прогреванием взвеси культуры в течение 30 минут при температуре 100 град., выращиванием на питательном агаре, содержащем 1% глюкозы, или при выращивании на свежескошенном питательном агаре при комнатной температуре (20-25 град.).

--------------------------------

<*> Изредка встречающиеся у шигелл отклонения биохимических признаков приведены в табл. 2.

 

Дифференциальным признаком бактерий алкалесценс является положительная реакция агглютинации с гомологичной адсорбированной сывороткой. Дизентерийные бактерии этой сывороткой не агглютинируются.

При идентификации культур, подозрительных на принадлежность к шигеллам, следует иметь в виду возможность выделения и истинных дизентерийных бактерий, имеющих те или иные отклонения в ферментативной или серологической характеристике. Однако такие культуры встречаются гораздо реже.

Представители почти всех видов дизентерийных бактерий могут давать ферментативные отклонения, т.е. встречаться в виде следующих ферментативных минус- или плюс-вариантов (см. ниже):

а) маннитнегативные разновидности маннитферментирующих видов (Зонне, Флекснер) и, наоборот, маннитферментирующие разновидности маннитнегативных видов (Лардж-Сакс);

б) ферментирующие ксилозу варианты Флекснера (серотип 4);

в) ферментирующие лактозу варианты Бойда (серотип 9 - см. табл. 2).

 

Таблица 2

 

ОБ ОТКЛОНЕНИЯХ НЕКОТОРЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ,

ЗАКОНОМЕРНО ПРИСУЩИХ ДИЗЕНТЕРИЙНЫМ БАКТЕРИЯМ

 

┌─────────┬────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│Признаки │       Закономерность       │            Отклонения            │

├─────────┼────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤

│Газообра-│Не образуют газа            │Образуют только шигеллы Ньюкестл  │

│зование  │                            │(некоторые биотипы)               │

│         │                            │                                  │

│Маннит   │Не ферментируют: шигеллы    │Ферментируют только шигеллы       │

│         │Григорьева-Шига, Штуцера-   │Лардж-Сакса (единичные            │

│         │Шмитца, Лардж-Сакса,        │наблюдения)                       │

│         │провизорные 8, 9, 10        │                                  │

│         │Ферментируют: шигеллы       │Не ферментируют шигеллы Ньюкестл  │

│         │Флекснера, Ньюкестл, Бойда, │(оригинальный штамм встречается   │

│         │Зонне                       │редко), Флекснера, Зонне, Бойда   │

│         │                            │(крайне редко)                    │

│         │                            │                                  │

│Лактоза  │Ферментируют только шигеллы │На 2-е сутки ферментируют шигеллы │

│         │Зонне на 3-20-й день        │Зонне (исключительно редко),      │

│         │                            │шигеллы Бойда 9 (отдельные разно- │

│         │                            │видности данного серотипа медленно│

│         │                            │расщепляют лактозу)               │

│         │                            │                                  │

│Ксилоза  │Не ферментируют шигеллы     │Ферментируют шигеллы Флекснера,   │

│         │Флекснера, Ньюкестл         │серотип 4 (отдельные редкие       │

│         │                            │разновидности)                    │

└─────────┴────────────────────────────┴──────────────────────────────────┘

 

К ферментативным отклонениям относятся также случаи ферментации мальтозы в 1-е сутки палочками Флекснера.

Необходимо учесть, что в бульоне Хоттингера многие шигеллы способны образовывать сероводород, поэтому для правильной оценки этого признака лучше пользоваться посевом в 1% пептонную воду.

Идентификации культур помогает установление их неподвижности, определение их полной ферментативной характеристики (табл. 5, 6) и серологическая характеристика.

Кроме ферментативных отклонений, у шигелл могут встречаться отклонения в серологической характеристике, вызванные следующими причинами:

1) инагглютинабильностью дизентерийных культур, связанной с наличием поверхностного антигена или с недоразвитием антигенного аппарата при росте на ингибирующих средах;

2) отсутствием агглютинации шигелл Флекснера типоспецифическими монорецепторными сыворотками при наличии агглютинации в поливалентной и групповых сыворотках, связанным с утратой типоспецифического антигена. Чаще такая утрата наблюдается у культур серологического типа 4, хотя вообще это явление встречается достаточно редко;

3) не исключена возможность выделения новых типов или вариантов дизентерийных бактерий, не включенных в схему <*>.

--------------------------------

<*> Для окончательной идентификации такие культуры необходимо отправлять в научно-исследовательские институты.

 

Во всех случаях затруднений в серологической идентификации шигелл необходимо иметь предельно полную характеристику биохимических свойств культуры.

Для восстановления утраченной способности агглютинироваться в гомологичной сыворотке может быть применен ряд методов:

а) селекционирование отдельных колоний с целью обнаружения особей, обладающих полным антигенным комплексом.

Рассев культуры для селекционирования лучше производить из верхнего слоя 3-4-часовой бульонной культуры на чашку со свежеприготовленным питательным агаром. Не следует рассевать культуру для селекционирования на среду Плоскирева, так как у культур, выделенных с этой среды, иногда наблюдается частичная утрата агглютинабильности;

б) прогревание культур для разрушения поверхностного антигена (оболочечные антигены разрушаются нагреванием при температуре 100 град. в течение 1-1 1/2 часов, капсульные - при температуре 120 град. в течение 2 1/2 часов);

в) многократные пассажи через желчный бульон (20% бычьей желчи).

Одним из вспомогательных тестов в затруднительных случаях идентификации культур, подозрительных на принадлежность к шигеллам, является определение их чувствительности к поливалентному дизентерийному бактериофагу <*>.

--------------------------------

<*> Методика описана выше.

 

Важным дифференциальным тестом при идентификации культур семейства кишечных является постановка кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках.

Применение этой пробы не только помогает идентификации выделенной культуры, но в ряде случаев позволяет получить реверсию утраченных свойств и выделить из глаза морской свинки бактерии с типичной серологической характеристикой. Для постановки пробы петлю суточной агаровой культуры или 1-2 капли бульонной культуры вводят при помощи петли или пипетки в конъюнктивальный мешок глаза морской свинки, под нижнее веко. При этом следует соблюдать осторожность и не травмировать слизистую оболочку, а тем более роговицу. Подавляющее большинство свежевыделенных дизентерийных бактерий вызывает у морских свинок специфический кератоконъюнктивит на 2-5-е сутки: роговица глаза мутнеет, набухает и приобретает белесоватый оттенок, конъюнктива гиперемирована, появляется обильное гнойное отделяемое. Пробу не считают положительной, если имеется только конъюнктивит, а кератит отсутствует (роговица остается прозрачной, блестящей и гладкой). Для выделения культуры из глаза при положительной пробе отделяемое из конъюнктивального мешка засевают в бульон и через 18-20 часов инкубации производят высев на чашки со средами Левина и Плоскирева. Следует учитывать, что, кроме шигелл, кератоконъюнктивит вызывают патогенные кишечные палочки серотипа О124:В17 и очень редко - некоторые другие бактерии, например S. typhi murium. Однако все эти бактерии можно отличить от шигелл по биохимическим признакам.

Идентификация культур, подозрительных на принадлежность к салмонеллам. При идентификации культур, подозрительных на принадлежность к салмонеллам, чаще всего вызывают затруднения некоторые бактерии из родов аризона и цитробактер, биохимически сходные с салмонеллами или агглютинирующиеся салмонеллезными сыворотками.

Основными общеизвестными биохимическими признаками, исключающими принадлежность культуры к салмонеллам, является сбраживание лактозы (даже в поздние сроки), расщепление мочевины, образование индола и разложение сахарозы <*>.

--------------------------------

<*> Развернутая ферментативная характеристика салмонелл дана в табл. 8.

 

При отсутствии этих признаков необходимо получить подробную ферментативную характеристику выделенной культуры. Способность микробов ферментировать салицин даже в поздние сроки указывает на то, что культура не принадлежит к роду салмонелл.

Вспомогательным признаком является отношение культуры к глицерину. В подавляющем большинстве случаев салмонеллы не образуют газа в глицерине в 1-е сутки. Для дифференциации салмонелл от бактерий родов аризона и цитробактер рекомендуется производить посев в жидкую среду с повышенным содержанием лактозы (4%) и пониженным содержанием пептона (0,3-0,5%). Кроме того, бактерии рода аризона в отличие от салмонелл не расщепляют дульцита. Если культура обладает суммой биохимических свойств, типичных для салмонелл, но не агглютинируется салмонеллезными О- и Н-сыворотками, следует испытать ее способность лизироваться салмонеллезным О-фагом <*>.

--------------------------------

<*> Методику испытания чувствительности салмонелл к О-фагу см. в Приложении.

 

Положительный результат является дополнительным признаком, указывающим на принадлежность культуры к роду салмонелл.

При серологической идентификации салмонелл иногда возникают трудности в определении жгутикового антигена или одной из его фаз, что связано либо с утратой подвижности, либо с преобладанием у популяции той или иной фазы Н-антигена. Следует при этом помнить о существовании в группе D серотипов неподвижных салмонелл S. gallinarum-pullorum, S. lishabi и монофазных культур, в группе С - S. cholerae suis var. Kunzendorf, в группе В - S. typhi murium var. binns.

Для восстановления подвижности 3-часовую бульонную культуру пересевают на свежескошенный агар или наносят каплю культуры на центр чашки с 0,5% питательным агаром для получения феномена роения. Наиболее подвижные особи находятся на периферической части макроколонии. Для получения отсутствующей фазы жгутикового антигена нужно сделать посев по Свену Гарду следующим образом: исследуемую культуру в виде бляшки засевают в центр чашки с 0,8-1% питательным агаром (см. среду в Приложении). К остуженному до температуры 50 град. агару перед тем, как залить его в чашку, добавляют 2-3 капли адсорбированной агглютинирующей Н-сыворотки к той фазе жгутикового антигена, которая была выявлена у данной культуры и которую желательно подавить. Через 24 часа инкубации при температуре 37 град. бактерии с искомой фазой Н-антигена оказываются на периферии макроколонии.

Для той же цели можно использовать более простой метод, предложенный Джеймсоном: по диаметру чашки с 1,2-1,5% питательным агаром вырезают канавку до дна чашки шириной 1 см. Чашки перед опытом просушивать не нужно. Через канавку в виде мостика накладывают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную в сыворотке к известной фазе Н-антигена изучаемой культуры. На один конец полоски наносят каплю исследуемой культуры. Через 24 часа инкубации при температуре 37 град. можно обнаружить бактерии с искомой фазой Н-антигена на агаре вокруг противоположного конца "мостика" из фильтровальной бумаги.

Следует отметить, что в идентификации культур, подозрительных на принадлежность к шигеллам или салмонеллам, наиболее важное значение имеет подробное изучение ферментативных свойств. Использование в целях идентификации культур только метода агглютинации подозрительных колоний на стекле прямо с чашки первичного посева или даже со среды Ресселя или "скошенного столбика" может явиться источником серьезных диагностических ошибок. К такому приему надо относиться с большой осторожностью.

При невозможности окончательной идентификации культуры на месте ее необходимо направить в вышестоящую лабораторию или научно-исследовательский институт. В этом случае ответ формулируется так: "Выделена культура, подозрительная на принадлежность к шигеллам (салмонеллам). Анализ необходимо повторить".

Выдача таких ответов допускается только как исключение при обязательном условии пересылки культур в вышестоящую лабораторию.

При достаточном наборе биохимических тестов и диагностических бактериальных препаратов неидентифицированные культуры представляют большую редкость.

 

6. Фаготипирование брюшнотифозных бактерий

 

Впервые схема фаготипирования брюшнотифозных бактерий (S. typhi) была предложена в 1938 г. Крейджи и Иеном. В основу фаготипирования этих бактерий положено их строго специфическое отношение к адаптированным Vi-бактериофагам II серологического типа. Бактериофаг Vi-II - это один из Vi-фагов, активных в отношении культур, обладающих Vi-антигеном. Данный бактериофаг легко адаптируется к устойчивым Vi-штаммам брюшнотифозных бактерий, утрачивая при этом способность лизировать исходный штамм-субстрат.

В настоящее время принята международная стандартная схема фаготипирования брюшнотифозных бактерий, разработанная в 1947 г. Крейджи и Феликсом. Она включает 78 препаратов типовых Vi-бактериофагов, с помощью которых выявляется такое же количество фаготипов этих бактерий. Бактериофаги и соответствующие им фаготипы бактерий обозначают заглавными буквами латинского алфавита (от А до Т включительно), часть фагов обозначена арабскими цифрами (от 25 до 48).

Помимо типовых адаптированных Vi-II бактериофагов, при типировании культур обязательно применяют один или несколько неадаптированных брюшнотифозных Vi-бактериофагов (серологических типов I, IV, VII и др.), которые выявляют присутствие в культуре типируемого штамма Vi-антигена.

Одним из необходимых условий для определения фаготипа культуры является наличие в ней Vi-ангигена, так как именно с ним связана чувствительность культур к Vi-бактериофагам <*>.

--------------------------------

<*> Практически почти все свежевыделенные культуры бактерий брюшного тифа содержат Vi-антиген, что выявляется с помощью Vi-сыворотки в реакции агглютинации. Если штамм дает слабую реакцию Vi-агглютинации и результаты фаготипирования получаются нечеткими, рекомендуется его рассеять, выделить 8-10 колоний, из них под контролем Vi-сыворотки отобрать наиболее богатые Vi-антигеном штаммы и вновь подвергнуть их фаготипированию. Высев для отбора колоний лучше сделать из молодой 3-4-часовой бульонной культуры.

 

Вторым обязательным условием для проведения фаготипирования является использование типовых бактериофагов в так называемых тест-разведениях (TD в иностранных источниках), которые обычно указывают либо в специальном приложении к набору типовых фагов, либо на этикетках ампул или флакончиков с фагами.

Штаммы фаготипа А лизируются всеми типовыми фагами. Подразделение типов на подтипы в группах В, С, D, Е и т.д. построено таким образом, что штаммы подтипов с порядковым номером 1 (В1, С1, D1, Е1 и т.д.) лизируются не только гомологичным фагом, но и фагами всех других подтипов данной группы.

В прилагаемой схеме указана активность типовых бактериофагов в отношении фаготипов бактерий брюшного тифа.

Техника фаготипирования. Суточную агаровую культуру типируемого штамма, проверенного предварительно с помощью Vi-сыворотки на содержание Vi-антигена, пересевают в пробирку с 2-3 мл мартеновского (можно хоттингеровского) бульона (pH 7,0-7,2) и помещают в термостат при температуре 37 град. на 3-4 часа. Молодую бульонную культуру наносят на чашку Петри, содержащую 25-30 мл 1,1-1,3% слабо щелочного питательного агара, хорошо подсушенного. Чашки с агаром рекомендуется приготовить накануне опыта, оставить их на ночь в термостате с закрытыми крышками, а на следующий день подсушить с открытыми крышками еще в течение 20-30 минут.

Культуру наносят на чашки петлей диаметром 5 мм или тонко оттянутой пастеровской пипеткой в виде отдельных капель, число которых должно быть на единицу больше числа используемых типовых бактериофагов (одна лишняя - для испытания с Vi-I фагом). Можно культуру засеять на чашку в виде сплошного газона. После того как нанесенная культура впитается в агар и засеянные участки подсохнут, на них наносят петлей или оттянутой пастеровской пипеткой типовые бактериофаги в тест-разведениях, а также Vi-I фаг.

После подсыхания капель фага чашки помещают в термостат при температуре 37-37,5 град., результаты типирования учитывают дважды - через 5-6 часов и через 18-20 часов. Учет результатов проводят невооруженным глазом и с помощью 5-кратной лупы через дно чашки в прямом освещении. Фаготип культуры определяют по схеме, которая прилагается к каждому набору типовых фагов (табл. 3, на вклейке).

 

Таблица 3

 

 

РЕАКЦИЯ ТИПОВЫХ ШТАММОВ S. TYPHI С ТИПОВЫМИ ФАГАМИ

 

Типо- вые  штам- мы	Типы фагов
	А	В1	В2	В3	С1	С2	С3	С4	С6	С7	D1	D2	D4	D5	D6	D7	D8	Е1	Е2	Е3	F1	F2	G	Н	I1	I2	К	L1	L2	М1	M2	N	О	Т	27	28	38	39	40	42	46
A	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++
B1	+/-	++ ++	-	+	-	-	-	+	+	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-	-	-	+	+	-	+/-	+/-	+/-	++ +	+	+	++ ++	+	++ ++
B2	+	-	++ ++	+	+	-	-	-	-	-	+/-	+/-	+	+	-	+	+	+	-	+	+	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
B3	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	+	+/-	-	-	-	-	++ +	-	-	-	-	-	-	-	++ +	++	+	++ +	++ +	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ +	++ ++	++ +	++ ++	+/-	++ +	++ ++
C1	+/-	+	+/-	+	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	+	-	+	+/-	+/-	+	-	+/-	-	+/-	+/-	+	+/-	+/-	+	+	-	+	-	+/-	+	-	-	+/-	+/-	++ +	++ +	+	++ ++	-	-
C2	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-
C3	-	-	-	-	+/-	++ ++	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	++ ++	-	-
C4	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
C6	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
C7	-	-	-	-	-	-	-	+	+	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D1	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-
D2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D5	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	++ ++	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D6	-	-	-	-	-	++ +	+	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	+	-
D7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D8	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
E1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	++ ++	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ +
E2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
E5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
F1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
F2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
G	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
H	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	-	++ ++
I1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
I2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
K	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
M1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
M2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
N	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	-	-	-	-
O	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-	+	-	++ ++	-	-	+	+/-	-	++ +	++ +	++ ++
T	-	+	-	-	-	-	+	+/-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	+/-	-	-	-	-	+/-	-	++ ++	-	++ ++	-	++ ++	++ ++	+	-
27	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-	-	++ ++
28	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	++ ++	-	-	-
38	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-	-
39	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-	-
40	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++ ++	-	-
42	-	-	-	++ +	-	-	+	++ ++	++ +	++ +	-	-	-	-	-	++ ++	-	+	-	-	+	++ +	-	-	-	++ ++	+/-	+	-	+	++ +	-	+	-	-	+	+	+	++ ++	++ ++	++ ++
46	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	++ +	-	-	-	++ ++