"Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство. Р 4.1.1672-03" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации,

Первый заместитель

Министра здравоохранения

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

30 июня 2003 года

Дата введения -

30 июня 2003 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

РУКОВОДСТВО

ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ

РУКОВОДСТВО

Р 4.1.1672-03

1. Разработано: ГУ НИИ питания РАМН (руководитель В.А.Тутельян, ответственный исполнитель К.И.Эллер, Ю.П.Алешко-Ожевский, Т.В.Аристархова, В.Г.Байков, Н.А.Бекетова, В.В.Бессонов, С.В.Волкович, Л.Ш.Воробьева, О.А.Вржезинская, М.М.Г.Гаппаров, Н.А.Голубкина, Г.Ф.Жукова, М.Г.Киселева, Т.В.Киселева, В.М.Коденцова, С.Н.Кулакова, Л.Г.Левин, Ф.А.Медведев, Г.В.Никольская, В.В. Пименова, И.М. Скурихин, О.И. Соловьева, В.Б. Спиричев, Л.А.Харитончик, С.А.Хотимченко); Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И.Петухов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (И.В.Брагина); Фармакопейным комитетом Минздрава России (В.Л.Багирова, Е.Л.Ковалева); ВИЛАР РАСХН (С.А.Пинеев).

2. Утверждено и введено в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 30 июня 2003 г.

3. Вводится впервые.

Область применения

Настоящее Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище (далее - Руководство) разработано в соответствии с Федеральными законами "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30.03.99 N 52-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, N 14, ст. 1650), "О качестве и безопасности пищевых продуктов" от 02.01.00 N 29-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000, N 2, ст. 150), Постановлением Правительства Российской Федерации от 21.12.00 N 987 "О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов".

Руководство устанавливает методы контроля ингредиентного состава и показателей качества и безопасности биологически активных добавок к пище (далее - БАД).

Руководство предназначено для юридических лиц и индивидуальных предпринимателей, осуществляющих деятельность в сфере производства и оборота БАД, а также для организаций и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации (далее - госсанэпидслужбы России), осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль за безопасностью и эффективностью БАД в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" и другими нормативными документами.

Методы контроля, изложенные в Руководстве, применяются на этапах экспертизы и регистрации БАД, при разработке и производстве БАД, их ввозе, хранении, транспортировке и реализации на территории Российской Федерации, при разработке нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.

Глава 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАКРОНУТРИЕНТОВ

I. Методы определения азотистых соединений

1. Метод определения общего белка

Метод заключается в определении азота по Кьельдалю с последующим пересчетом на белок. Сущность метода состоит в разложении органического вещества пробы кипящей концентрированной серной кислотой с образованием солей аммония, переведении аммония в аммиак, отгонке его в раствор кислоты, количественном учете аммиака титрометрическим методом и расчете содержания азота в исследуемом материале.

Подготовка к испытанию

Среднюю пробу БАД готовят согласно прописи отбора проб по стандарту определения белка на соответствующий продукт, в случае отсутствия стандарта - по техническим условиям на БАД. Для пересчета содержания белка на сухое вещество (в случае необходимости определения данного показателя) определяют влажность исследуемого БАД или пищевого сырья.

Подготовка реактивов и растворов

Приготовление смешанных катализаторов

Катализатор 1. Смешивают 1 весовую часть сернокислой меди и 30 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

Катализатор 2. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди, 100 весовых частей сернокислого калия и 2 весовые части селена. Тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

При приготовлении катализаторов 1 и 2 допускается заменять сернокислый калий надсернокислым калием в том же количестве.

Катализатор 3. Перекись водорода, 30%-ный водный раствор.

Приготовление 4%-ного раствора борной кислоты

40 г борной кислоты растворяют в небольшом количестве теплой дистиллированной воды при нагревании и переносят в колбу вместимостью 1000 куб. см. После охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1000 куб. см.

Приготовление 0,05 моль/куб. дм (0,1 н) раствора серной кислоты

Используют стандарт-титр серной кислоты. Раствор готовят в соответствии с правилами, приложенными к комплекту.

Допускается приготовление 0,05 моль/куб. дм раствора серной кислоты из концентрированной серной кислоты в соответствии с ГОСТ 25791.1-83.

Приготовление смешанного индикатора

Растворяют 0,20 г метилового красного и 0,10 г бромкрезолового зеленого в 100 куб. см 96%-ного этилового спирта.

Проведение испытания

Приготовление минерализата

Из усредненной измельченной гомогенной пробы исследуемого БАД для анализа взвешивают на обеззоленном фильтре или в пробирке точную навеску, с погрешностью не более 0,1%. Содержание азота в анализируемой пробе должно быть не менее 10 мг. Навеску количественно переносят в колбу Кьельдаля.

Минерализацию осуществляют одним из двух способов.

Способ 1

Добавляют в колбу Кьельдаля 1,5-2 г смешанного катализатора 1 или 2. После прибавления катализатора осторожно приливают 10-15 куб. см концентрированной серной кислоты.

Способ 2

Добавляют в колбу Кьельдаля 7-10 куб. см 30%-ной перекиси водорода в качестве окислителя. После прекращения бурной реакции приливают такое же количество концентрированной серной кислоты.

Колбу покрывают стеклянной воронкой и устанавливают на нагреватель так, чтобы ее ось была наклонена под углом 30-45 град. к вертикали. Вначале коблу нагревают умеренно, чтобы предотвратить бурное пенообразование.

При нагревании навеску время от времени помешивают вращательными движениями колбы. После исчезновения пены нагревание усиливают, пока жидкость не будет доведена до постоянного кипения. При этом следят за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось черных несгоревших частиц, смывая их легким встряхиванием содержимого колбы или прибавлением небольшого количества серной кислоты.

После того как жидкость обесцветится (допускается слегка зеленоватый оттенок), нагрев продолжают в течение 30 мин.

После охлаждения к содержимому колбы постепенно приливают, взбалтывая, около 70 куб. см дистиллированной воды, охлаждают и приступают к отгонке аммиака.

В бачок-парообразователь через воронку наливают дистиллированную воду (несколько больше половины общего объема бачка) и открывают кран на воронке и зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля.

Нагревают воду в бачке на газовой горелке или электрической плитке. Присоединяют пустую колбу Кьельдаля к каплеуловителю холодильника и воронке для щелочи и после того, как вода в бачке закипит, закрывают кран воронки бачка-парообразователя. Включают холодильник, подставляют под него пустую коническую колбу и в течение 5-10 мин. "пропаривают" прибор.

После пропаривания открывают краны воронки бачка-парообразователя и воронки для щелочи и закрывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля.

Под холодильник подставляют вместо пустой конической колбы коническую колбу с предварительно налитыми в нее из пипетки 20 куб. см 4%-ной борной кислоты и 5 капель смешанного индикатора или 25 куб. см 0,05 моль/куб. дм раствора серной кислоты. Колбу подставляют под холодильник так, чтобы его кончик был погружен в раствор кислоты на глубину не менее чем 1 см. Вместо пустой колбы Кьельдаля присоединяют колбу с сожженной навеской анализируемой пробы.

Закрывают кран воронки для щелочи, наливают в воронку 33% раствора щелочи и открывают понемногу кран воронки для щелочи при осторожном покачивании колбы Кьельдаля, приливают избыток щелочи, при этом цвет раствора должен резко измениться - от прозрачного до синего или бурого. Открывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля и закрывают остальные краны, при этом пар будет проходить через жидкость в колбе Кьельдаля и увлекать аммиак. В холодильнике пар конденсируется. Раствор аммиака попадает в колбу с 0,1 н. раствором серной кислоты. При нормальном кипении объем раствора в приемной колбе через 20-30 мин. обычно составляет 150-180 куб. см. Конец отгонки можно установить с помощью красной лакмусовой бумажки. Для этого приемную колбу отставляют от аппарата, предварительно обмыв конец холодильника дистиллированной водой, и подставляют лакмусовую бумажку под стекающие капли дистиллята. Если лакмус не синеет, отгон аммиака закончен. Если лакмус синеет, приемную колбу снова подставляют под холодильник и продолжают отгонку. После окончания отгонки приемную колбу опускают и конец холодильника обмывают дистиллированной водой в приемную колбу. После этого открывают краны на воронке бачка-парообразователя и воронке для щелочи и закрывают зажим отводящей пар трубки в колбу Кьельдаля. Содержимое приемной колбы титруют 0,1 моль/куб. дм раствором гидроокиси натрия до перехода окраски в зеленую.

Необходимо параллельно с определением азота в исследуемой пробе проводить определение азота в реактивах ("холостой опыт") для внесения соответствующей поправки в результат анализа. Определение азота в реактивах следует повторять каждый раз после замены партии серной кислоты, катализатора или титрованных растворов. Допускается отгонка аммиака (особенно в случае применения больших колб для сжигания) без использования пара непосредственно нагревом колбы на электрическом нагревателе. Проведение отгонки аммиака и все последующие операции проводятся так же, как и с применением пара.

Способ 3

Определение содержания азота проводят на автоматическом анализаторе типа "Кьельдек", фирма Текатор, Швеция, в соответствии с инструкцией к прибору.

Обработка результатов

Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при проведении отгонки аммиака в борную кислоту вычисляют по формуле:

(V - V ) x K x 0,0014 x 100

1 0

Х = ----------------------------,

где:

V - объем раствора серной кислоты, израсходованный на

титрование испытуемого раствора, куб. см;

V - объем раствора серной кислоты, израсходованный на

титрование в контрольном опыте, куб. см;

К - поправка к титру 0,05 ммоль/куб. дм раствора серной

кислоты, если он приготовлен не из стандарт-титра;

0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 куб. см раствора

серной кислоты, г;

М - масса навески, г.

Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее

массы при отгонке аммиака в серную кислоту вычисляют по формуле:

(V - V ) x K x 0,0014 x 100

1 0

X = ----------------------------,

где:

V - объем 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси натрия,

израсходованный на титрование 0,05 моль/куб. дм серной кислоты в

контрольном опыте, куб. см;

V - объем 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси натрия,

израсходованный на титрование серной кислоты в испытуемом

растворе, куб. см;

K - поправка к титру 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси

натрия;

0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 куб. см 0,05

моль/куб. дм раствора серной кислоты;

M - масса навески, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных испытаний. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

Расчет содержания общего азота в пробе при использовании автоматического анализатора (способ 3) проводят в соответствии с инструкцией к прибору.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между двумя параллельными определениями (r) не должно превышать значений, вычисляемых по формуле:

r = 0,03 + 0,02 x Х ,

но не более 0,1% абсолютного содержания общего азота, где X -

среднее арифметическое результатов двух параллельных определений,

Допустимое расхождение между результатами испытаний,

выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать

значений, вычисляемых по формуле:

R = 0,04 + 0,045 x Х ,

но не более 0,2% абсолютного содержания общего азота, где Х -

среднее арифметическое результатов двух испытаний, выполненных в

двух разных лабораториях, %.

Массовую долю азота в пересчете на сухое вещество продукта

(Х ) в процентах вычисляют по формуле:

X x 100

X = --------,

3 100 - W

где:

X - массовая доля азота в испытуемой пробе, %;

W - влажность испытуемой пробы, %.

Массовую долю белка (Y) в процентах вычисляют по формуле:

Y = K x X , X или X ,

1 2 3

где К - коэффициент пересчета азота на белок БАД:

с высоким (более 15%) содержанием липидов - 6,25;

с умеренным (2-15%) содержанием липидов - 6,38;

с низким содержанием липидов - 5,70.

2. Определение аминокислотного состава

Сущность метода заключается в гидролизе образца до аминокислот и последующем количественном определении образовавшихся аминокислот на аминокислотном анализаторе.

Подготовка к испытанию

В пробе определяют общий белок, содержание липидов и влажность по методикам, описанным в настоящем Руководстве.

Для жидких БАД учитывают содержащуюся воду в процессе приготовления гидролизующей смеси таким образом, чтобы концентрация соляной кислоты была 6 М. При содержании липидов более 5% проводят обезжиривание способом, указанным в табл. 1. После обезжиривания остаток подсушивают на воздухе и определяют содержание общего белка. Рассчитывают величину навески образца для гидролиза исходя из соотношения белка к кислоте, представленных в табл. 1, и при условии содержания белка в пробе не менее 5 мг.

Таблица 1

УСЛОВИЯ ПОДГОТОВКИ ПРОБ К АНАЛИЗУ ДЛЯ БАД,

СОДЕРЖАЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ УРОВНИ ЛИПИДОВ

N раз- дела	БАД с содержанием липидов	Способ удаления липидов	Весовое соотно- шение белок : соляная кислота 6 М
1.	низким, менее 2%	не требуется	1:200
2.	высоким, более 15%	экстракция 10-кратным коли- чеством диэтилового эфира 3-4 раза или смесью этанол- хлороформ (1:2) 10-кратным количеством 2 раза	1:250
3.	умеренным, 2-15%	не требуется	1:1000

Проведение испытания

Три навески БАД или обезжиренного остатка, подготовленных к гидролизу в соответствии с разделом 1, взятых с точностью 0,0001 г, помещают в стеклянную ампулу с оттянутым концом, заливают расчетным количеством соляной кислоты (в случае жидких БАД берут расчетное количество концентрированной кислоты и доводят до концентрации 6 М).

Ампулы запаивают, устанавливают в строго вертикальном положении в металлический патрон или фарфоровый стакан с парафином и помещают в сушильный шкаф с заранее отрегулированной температурой 110 +/- 2 град. С. Нагревание проводят непрерывно в течение 24, 48 и 72 ч. Затем ампулы охлаждают до комнатной температуры. Необходимость трех временных отрезков гидролиза объясняется различиями в скорости отщепления отдельных аминокислот. На основании результатов последующих анализов содержания аминокислот за каждое время гидролиза строят кривую и методом интерполяции или экстраполяции до нулевого времени находят максимальную величину.

Каждую ампулу вскрывают и сразу приступают к удалению соляной кислоты. Если в гидролизате образовался видимый осадок, его удаляют центрифугированием или фильтрованием с последующим доведением фильтрата в мерной колбе до 25 куб. см до точного объема. В случае конечного объема больше 5 куб. см и при использовании высокочувствительных приборов для удаления соляной кислоты берут аликвоту.

Удаление соляной кислоты проводят одним из следующих способов:

а) помещают ампулу или пробирку в вакуум-эксикатор над гранулированным гидратом окиси натрия (NaOH) на 12-18 ч;

б) на роторном испарителе при температуре не выше 60 град. С. Для этого гидролизат количественно переносят в грушевидную колбу, ополаскивая ампулу дистиллированной водой.

Остаток переносят количественно в мерную колбу с помощью цитратного буфера, pH 2,2, или раствора соляной кислоты 0,02 М и доводят до метки. Полученный раствор гидролизата подвергают анализу на аминокислотном анализаторе в соответствии с инструкцией к прибору.

В случае, если анализ не может быть проведен немедленно, осадок освобождают от следов соляной кислоты путем добавления к нему дистиллированной воды и повторного испарения на роторном испарителе или в вакуумном эксикаторе. Операцию повторяют до полного исчезновения запаха соляной кислоты.

Хранят образец в морозильной камере или нижней камере холодильника при температуре не выше 5 град. С, перед анализом разводят цитратным буфером до необходимой концентрации. Обнаруженный осадок отфильтровывают через плотный фильтр.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) для основных аминокислот при концентрациях, характерных для трех важнейших групп продуктов, приведены в табл. 2.

Таблица 2

ДОПУСТИМЫЕ ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)

И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СОДЕРЖАНИЯ АМИНОКИСЛОТ В ОСНОВНЫХ ГРУППАХ БАД

Аминокислота	С высоким содержанием белка		С умеренным содержанием белка		С низким содержанием белка
Аминокислота	Rr, %	RR, %	Rr, %	RR, %	Rr, %	RR, %
1	2	3	4	5	6	7
Лизин	11	25	10	25	12	30
Гистидин	19	32	19	37	20	31
Аргинин	11	29	14	26	12	32
Аспарагиновая кислота	11	24	8	19	10	26
Треонин	12	26	12	30	10	24
Серин	14	28	11	32	16	32
Глутаминовая кислота	9	19	8	16	10	22
Пролин	20	40	17	42	22	41
Глицин	13	24	13	24	15	26
Аланин	12	30	13	32	21	38
Цистин	20	60	17	55	15	45
Валин	11	28	10	28	20	39
Метионин	18	50	11	35	22	50
Изолейцин	15	39	11	40	11	50
Лейцин	11	26	13	24	14	39
Тирозин	10	27	14	32	20	45
Фенилаланин	17	31	11	44	11	40
Оксипролин	12	40	14	40	10	28
Триптофан	18	60	19	60	22	65

II. Методы определения липидов

1. Методы определения содержания жира

в БАД на растительной и жировой основе

1.1. Гравиметрический метод

Метод основан на извлечении сырого жира из БАД растворителем, последующем удалении растворителя, высушивании и взвешивании извлеченного жира.

Подготовка проб к испытанию

Перед началом определений продукт, отобранный из средней пробы по ГОСТ 26312.1-84, тщательно перемешивают, отбирают навеску массой 50 г и измельчают на мельнице.

Приготовление патрона из фильтровальной бумаги

Для приготовления патрона фильтровальную бумагу обезжиривают следующим образом. Листы фильтровальной бумаги свертывают в трубку и помещают в цилиндр с пришлифованной пробкой так, чтобы вся бумага поместилась в цилиндре. В цилиндр перед помещением бумаги наливают 100-200 куб. см диэтилового эфира или гексана. После того как растворитель поднимется по бумаге до его верхнего края, цилиндр открывают, бумагу вынимают и дают растворителю испариться, затем ножницами от верхнего края отрезают полоску шириной 4-5 см, а остальную часть бумаги используют для приготовления патронов. Вату обезжиривают также в цилиндре. Обезжиренную вату и бумагу хранят в закрытой посуде. Обезжиренный прямоугольный кусок бумаги навертывают на деревянную болванку. По мере навертывания свободный край бумаги подворачивают складками для образования донышка патрона. Бумагу и болванку берут таким образом, чтобы стенки патрона получились двойными, а его диаметр был на 0,5 см меньше диаметра экстрактора. На дно патрона кладут кусочек обезжиренной ваты.

Проведение испытания

В патрон из фильтровальной бумаги отвешивают 1-5 г испытуемой пробы, с погрешностью не более 0,01 г, сверху кладут кусочек обезжиренной ваты. Приготовленный таким образом патрон помещают в экстрактор аппарата Сокслета так, чтобы он не был выше верхнего изгиба трубки. Колбу аппарата Сокслета высушивают при температуре 105 +/- 5 град. С в течение 2 ч и после охлаждения взвешивают. Колбу наполняют примерно на 2/3 объема гексаном или диэтиловым эфиром и присоединяют к экстрактору. Пускают воду в холодильник и колбу с растворителем нагревают на водяной или песочной бане. При этом растворитель, находящийся в колбе, испаряется и в виде паров проходит через широкую трубку экстрактора в холодильник, где охлаждается и в виде капель поступает в экстрактор с патроном. При заполнении экстрактора растворителем до верхнего изгиба сифонной трубки последний переливается в колбу, унося с собой жир. В течение 1 ч должно быть 7-9 сливов растворителя. Экстракцию ведут 2 ч. Затем патрон удаляют из экстрактора и отгоняют растворитель из колбы в экстрактор. После заполнения экстрактора до верхнего изгиба сифонной трубки чистый растворитель сливают из экстрактора, который затем вновь присоединяют к аппарату Сокслета, и отгоняют оставшийся в колбе растворитель. По окончании отгонки растворителя отсоединяют экстрактор, колбу выдерживают на бане до испарения растворителя. После испарения растворителя колбу помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре 105 +/- 5 град. C в течение 60 мин., охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Последующее взвешивание проводят после повторной сушки в течение 30 мин. Высушивание и взвешивание повторяют до тех пор, пока разность результатов двух последовательных взвешиваний будет не более 0,001 г. Одновременно определяют влажность.

Обработка результатов

Массовую долю сырого жира в процентах, в пересчете на сухое вещество, в испытуемой пробе (X) вычисляют по формуле:

(M - M ) х 100

2 1

X = ---------------,

M x (100 - W)

где:

M - масса пробы, г;

M - масса пустой колбы, г;

M - масса колбы с жиром, г;

W - массовая доля влаги в испытуемой пробе, %.

За окончательный результат определения принимают среднее

арифметическое результатов (X ) двух параллельных определений.

Вычисления проводят с точностью до 0,1%.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не

должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,02 x Х ,

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее

арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний,

выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать

значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,035 x Х ,

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее

арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных

лабораториях, %.

1.2. Определение содержания жира в БАД

на зерновой основе

Для определения массовой доли жира в БАД на зерновой основе используют три варианта метода:

а) экстракционный метод с предварительным гидролизом навески;

б) рефрактометрический;

в) бутирометрический.

А. Экстракционный метод с предварительным

гидролизом навески

Метод основан на извлечении жира из предварительно гидролизованной навески изделия растворителем и определении количества жира взвешиванием после удаления растворителя из определенного объема полученного раствора.

Проведение испытания

Навеску продукта в 1-5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,05 г, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 300 куб. см, приливают 100 куб. см 1,5% соляной кислоты (или 10 куб. см 5% серной кислоты), кипятят в колбе с обратным холодильником на кипящей бане 30 мин. Затем колбу охлаждают водой до комнатной температуры, приливают в колбу 50 куб. см хлороформа, плотно закрывают хорошо пригнанной пробкой, энергично взбалтывают в течение 15 мин., затем выливают содержимое в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 2-3 мин. при 3000 об./мин.

В пробирке образуются три слоя. Верхний водный слой отбирают пипеткой. Пипеткой, снабженной резиновой грушей, отбирают хлороформенный раствор жира и фильтруют его в сухую колбу через небольшой ватный тампон, вложенный в узкую часть воронки, причем кончик пипетки должен при этом касаться ваты.

Фильтрат 20 куб. см помещают в предварительно доведенную до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах колбу вместимостью 100 куб. см.

Отбор и фильтрация должны производиться в течение 2 мин.

Хлороформ из колбы отгоняют на горячей водяной бане, пользуясь холодильником. Оставшийся в колбе жир сушат до постоянной массы (обычно 1-1,5 ч) при температуре 100-105 град. C, охлаждают в эксикаторе в течение 20 мин. и взвешивают колбу на аналитических весах.

Допускается также следующий способ расслаивания.

После гидролиза в охлажденную колбу добавляют 5 куб. см раствора аммиака, 50 куб. см хлороформа, затем содержимое колбы взбалтывают в течение 15 мин. и оставляют на 1 ч для отстаивания. За это время полностью отделяется и четко виден нижний хлороформный слой.

Если расслаивания не произойдет, добавляют еще 2-3 куб. см аммиака, следя за тем, чтобы реакция по фенолфталеину оставалась кислой.

После расслаивания отбор, фильтрацию, отгон хлороформного слоя и высушивание жира ведут, как описано выше.

Примечания. 1. Отгон и фильтрацию растворителя проводят под вытяжкой.

2. При отсутствии хлороформа допускается применение дихлорэтана, который следует хранить в темных склянках.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

(М - М ) х 100 x 50 100

Х = ------------------- x -------,

20 х М 100 - W

где:

М - масса колбы с высушенным жиром, г;

M - масса пустой колбы, г;

50 - объем хлороформа, взятого для растворения жира, куб. см;

М - масса навески исследуемого изделия, г;

20 - объем хлороформного раствора жира, взятого для отгона,

куб. см;

W - массовая доля влаги в испытуемом изделии, %.

За окончательный результат испытания принимают среднее

арифметическое (X ) результатов двух параллельных определений.

Вычисления проводят с точностью до 0,1%.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не

должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,02 x Х ,

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее

арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний,

выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать

значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,035 x Х ,

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где X - среднее

арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных

лабораториях, %.

Б. Рефрактометрический метод

Метод основан на извлечении жира из навески образца альфа'-бромнафталином или альфа'-хлорнафталином. Массовую долю жира в образце определяют по разности коэффициентов преломления растворителя и раствора жира в растворителе.

Подготовка к испытанию

Определение коэффициента преломления растворителей. Определяют коэффициент преломления альфа'-бромнафталина или альфа'-хлорнафталина при температуре 20 град. C, нанося 1-2 капли этих растворителей на призму рефрактометра.

Определение плотности растворителей

Плотность растворителей (ро, г/куб. см, при 20 град. С) определяют пикнометром и вычисляют по формуле:

ро = -,

где:

Q - водное число пикнометра, г;

М - масса растворителя, г.

Взвешивание проводят с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.

Калибровка пипеток. Микропипетки калибруют по растворителю, отмеривая ими соответствующий объем растворителя и взвешивая его в стаканчике с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.

Из трех взвешиваний берут среднее арифметическое и вычисляют объем пипетки (V) в куб. см по формуле:

V = --,

ро

где:

М - масса растворителя, соответствующая объему взятой пипетки, г;

ро - плотность растворителя при температуре 20 град. C.

Проведение испытания

При анализе взвешивают 2 г БАД с точностью до 0,05 г и помещают в фарфоровую ступку. Затем калиброванной пипеткой приливают 4 куб. см растворителя. Содержимое ступки энергично растирают в течение 3 мин. Смесь переносят из ступки на маленький складчатый фильтр. Первые 2-3 капли фильтрата отбрасывают, а последующий фильтрат в количестве 2-3 капель помещают на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.

При анализе изделий с низкой влажностью перед добавлением песка измельченную навеску смачивают 1 куб. см воды. Охладив массу, приливают точно 4-6 куб. см растворителя и вновь все растирают в течение 3 мин., затем добавляют 2 г безводного углекислого натрия, перемешивают, смесь из ступки переносят на складчатый фильтр и фильтруют в стаканчик.

Из полученного фильтрата наносят 2-3 капли на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.

Определение коэффициента преломления проводят при 20 +/- 0,2 град. C или любой комнатной температуре.

В последнем случае показатель преломления раствора приводят к температуре 20 град. C путем внесения поправки по табл. 3.

Таблица 3

ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПОПРАВКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

ПРЕЛОМЛЕНИЯ РАСТВОРА ЖИРА В альфа'-БРОМНАФТАЛИНЕ

Т, град. C	По- правка	Т, град. C	По- правка	Т, град. C	По- правка	Т, град. C	По- правка	Т, град. C	По- правка
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
отнять от показателя преломления
15,0	0,0022	16,0	0,0018	17,0	0,0013	18,0	0,0009	19,0	0,0004
15,1	0,0022	16,1	0,0017	17,1	0,0013	18,1	0,0008	19,1	0,0004
15,2	0,0021	16,2	0,0017	17,2	0,0012	18,2	0,0008	19,2	0,0004
15,3	0,0021	16,3	0,0016	17,3	0,0012	18,3	0,0007	19,3	0,0003
15,4	0,0020	16,4	0,0016	17,4	0,0011	18,4	0,0007	19,4	0,0003
15,5	0,0020	16,5	0,0016	17,5	0,0011	18,5	0,0007	19,5	0,0002
15,6	0,0019	16,6	0,0015	17,6	0,0011	18,6	0,0006	19,6	0,0002
15,7	0,0019	16,7	0,0015	17,7	0,0010	18,7	0,0006	19,7	0,0001
15,8	0,0018	16,8	0,0014	17,8	0,0010	18,8	0,0005	19,8	0,0001
15,9	0,0018	16,9	0,0014	17,9	0,0009	18,9	0,0005	19,9	0,0000
прибавить к показателю преломления
20,0	0,0000	22,0	0,0009	24,0	0,0018	26,0	0,0026	28,0	0,0035
20,1	0,0000	22,1	0,0009	24,1	0,0018	26,1	0,0027	28,1	0,0036
20,2	0,0001	22,2	0,0010	24,2	0,0018	26,2	0,0027	28,2	0,0036
20,3	0,0001	22,3	0,0010	24,3	0,0019	26,3	0,0028	28,3	0,0037
20,4	0,0002	22,4	0,0011	24,4	0,0019	26,4	0,0028	28,4	0,0037
20,5	0,0002	22,5	0,0011	24,5	0,0020	26,5	0,0029	28,5	0,0037
20,6	0,0003	22,6	0,0011	24,6	0,0020	26,6	0,0029	28,6	0,0038
20,7	0,0003	22,7	0,0012	24,7	0,0021	26,7	0,0029	28,7	0,0038
20,8	0,0004	22,8	0,0012	24,8	0,0021	26,8	0,0030	28,8	0,0039
20,9	0,0004	22,9	0,0013	24,9	0,0022	26,9	0,0030	28,9	0,0039
21,0	0,0004	23,0	0,0013	25,0	0,0022	27,0	0,0031	29,0	0,0040
21,1	0,0004	23,1	0,0014	25,1	0,0022	27,1	0,0031	29,1	0,0040
21,2	0,0005	23,2	0,0014	25,2	0,0023	27,2	0,0032	29,2	0,0040
21,3	0,0006	23,3	0,0015	25,3	0,0023	27,3	0,0032	29,3	0,0041
21,4	0,0006	23,4	0,0015	25,4	0,0024	27,4	0,0033	29,4	0,0041
21,5	0,0007	23,5	0,0015	25,5	0,0024	27,5	0,0033	29,5	0,0042
21,6	0,0007	23,6	0,0016	25,6	0,0025	27,6	0,0033	29,6	0,0042
21,7	0,0007	23,7	0,0016	25,7	0,0025	27,7	0,0034	29,7	0,0043
21,8	0,0008	23,8	0,0017	25,8	0,0026	27,8	0,0034	29,8	0,0043
21,9	0,0008	23,9	0,0017	25,9	0,0026	27,9	0,0035	29,9	0,0044

Отсчет показателя преломления раствора жира можно также производить при любой комнатной температуре без учета поправки на температуру при условии одновременного определения показателя преломления растворителя при той же температуре.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

V x ж П - П 100

р р рж

X = ------ x -------- x 100 x -------,

M П - П 100 - W

рж ж

где:

V - объем растворителя, взятого для извлечения жира, куб. см;

ж - относительная плотность жира при 20 град. C;

П - коэффициент преломления растворителя;

П - коэффициент преломления раствора жира в растворителе;

рж

П - коэффициент преломления жира;

М - масса изделия, г;

W - влажность изделия, %.

За окончательный результат испытания принимают среднее

арифметическое (X ) двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не

должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,03 + 0,035 x Х ,

но не более 0,6% абсолютного содержания жира, где X - среднее

арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний,

выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать

значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,06 x Х ,

но не более 1,2% абсолютного содержания жира, где X - среднее

арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных

лабораториях, %.

При вычислении процентного содержания жира пользуются показателями преломления и плотности жиров, указанными в табл. 4

Таблица 4

КОЭФФИЦИЕНТЫ ПРЕЛОМЛЕНИЯ ЖИРОВ

Наименование жира	Коэффициент преломления	Плотность
Кунжутное масло	1,4730	0,919
Подсолнечное масло	1,4748	0,919
Коровье масло	1,4605	0,920
Маргарин	1,4690	0,928
Арахисовое масло	1,4696	0,917
Горчичное масло	1,4720	0,918

Примечания. 1. Если в исследуемом образце находится неизвестный жир или имеется смесь жиров, поступают следующим образом: 1-5 г измельченного изделия заливают трехкратным количеством растворителя (хлороформа, тетрахлоруглерода и др.), взбалтывают в течение 15 мин., вытяжку фильтруют в колбочку, растворитель полностью отгоняют, остаток подсушивают и определяют коэффициент преломления смеси жиров или неизвестного жира.

2. Для смеси жиров или неизвестного жира плотность принимается равной 0,920.

3. При хорошем растирании навески с растворителем в ступке, когда смесь перенесена на фильтр, разрешается стекающие из воронки капли раствора жира и растворитель наносить на призму рефрактометра, не дожидаясь, пока профильтруется вся смесь.

4. Вся работа с органическими растворителями проводится в вытяжном шкафу или хорошо вентилируемой камере.

В. Бутирометрический метод

Метод основан на растворении исследуемой навески в 60%-ной серной кислоте и отделении слоя жира в молочном бутирометре центрифугированием в присутствии изоамилового спирта, который образует с серной кислотой изоамилово-серный эфир, уменьшающий величину поверхностного натяжения жировых шариков и способствующий слипанию их в единый жировой слой.

Объем выделившегося жира измеряют в градуированной части бутирометра.

Проведение испытания

Из средней пробы готовых образцов отбирают по две навески массой по 2 г каждая. Навески помещают в фарфоровые стаканчики и заливают 9 куб. см 60%-ной серной кислоты.

Стаканчики погружают в водяную баню с температурой воды 80 град. C и производят растворение навески в серной кислоте в течение 20 мин. при периодическом перемешивании стеклянной палочкой.

После растворения навески темную жидкость переносят в молочные бутирометры, смывая остатки из стаканчика с помощью 10 куб. см 60% серной кислоты.

В бутирометры осторожно (чтобы не замочить горлышко) приливают по 1 куб. см изоамилового спирта, плотно закрывают резиновыми пробками, плавно перемешивают в течение 3 мин. и помещают в гнезда водяной бани с температурой воды 80 град. C на 5 мин. (пробками вниз).

По истечении 5 мин. бутирометры вынимают из водяной бани, размещают в молочной центрифуге (пробками к периферии) и центрифугируют 5 мин. После центрифугирования бутирометры снова помещают на 5 мин. в водяную баню с температурой воды 80 град. C (пробками вниз), после чего вынимают и отмечают высоту желтого жирового слоя над темной жидкостью по числу малых делений градуированной части бутирометра.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

N x 0,01133 x 100 x 100

X = -----------------------,

Q x (100 - W)

где:

N - высота жирового слоя в бутирометре по числу малых делений;

0,01133 - количество жира, соответствующее одному малому делению бутирометра, г;

W - влажность, %;

Q - навеска изделия, г.

Для удобства и ускорения расчета можно использовать данные табл. 5.

Таблица 5

ПОКАЗАНИЯ БУТИРОМЕТРА В ЗАВИСИМОСТИ

ОТ СОДЕРЖАНИЯ ЖИРА

┌───────┬───────┬───────┬───────┬───────┬───────┬───────┬────────┐

│Показа-│Массо- │Показа-│Массо- │Показа-│Массо- │Показа-│Массовая│

│ния бу-│вая до-│ния бу-│вая до-│ния бу-│вая до-│ния бу-│ доля │

│тиро- │ля жи- │тиро- │ля жи- │тиро- │ля жи- │тиро- │жира, % │

│метра │ра, % │метра │ра, % │метра │ра, % │метра │ │

├───────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┼────────┤

│1 │ 0,57 │ 11 │ 6,23 │ 21 │ 11,90 │ 31 │ 17,56 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│2 │ 1,13 │ 12 │ 6,80 │ 22 │ 12,46 │ 32 │ 18,13 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│3 │ 1,70 │ 13 │ 7,36 │ 23 │ 13,03 │ 33 │ 18,69 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│4 │ 2,27 │ 14 │ 7,93 │ 24 │ 13,60 │ 34 │ 19,26 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│5 │ 2,83 │ 15 │ 8,50 │ 25 │ 14,16 │ 35 │ 19,82 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│6 │ 3,40 │ 16 │ 9,06 │ 26 │ 14,73 │ 36 │ 20,39 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│7 │ 3,96 │ 17 │ 9,63 │ 27 │ 15,29 │ 37 │ 20,96 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│8 │ 4,53 │ 18 │ 10,19 │ 28 │ 15,66 │ 38 │ 21,53 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│9 │ 5,10 │ 19 │ 10,76 │ 29 │ 16,42 │ 39 │ 22,09 │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│10 │ 5,66 │ 20 │ 11,33 │ 30 │ 17,00 │ 40 │ 22,66 │

└───────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┴────────┘

Для дальнейшего пересчета на сухое вещество умножают массовую

долю жира в процентах, найденную по таблице, на 100 и делят на

разность (100 - W). За окончательный результат испытания принимают

среднее арифметическое (X ) результатов двух параллельных

определений.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не

должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,02 x Х ,

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее

арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний,

выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать

значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,04 x X ,

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее

арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных

лабораториях, %.

1.3. Определение массовой доли жира

в БАД с высоким содержанием жира методом экстракции

в аппарате Сокслета

Метод предназначен для определения массовой доли жира в БАД с высоким содержанием жира при проведении исследований и арбитражного анализа.

Диапазон измеряемых концентраций от 40 до 85%.

Метод основан на экстракции растворителем в аппарате Сокслета.

Подготовка к испытанию

Гигроскопическую вату и фильтровальную бумагу помещают в аппарат Сокслета и экстрагируют этиловым эфиром в течение 2-3 ч.

Подготовка экстракционных патронов

Патроны для экстракционных насадок типа НЭТ готовят, как указано выше.

Подготовка БАД к экстракции

В фарфоровую ступку взвешивают по разности 5 г БАД с записью значения массы до четвертого десятичного знака. Смешивают с 15 г прокаленного сульфата натрия и переносят в подготовленный экстракционный патрон, после чего ступку и шпатель с помощью пинцета протирают несколько раз ватой, сначала сухой, а затем смоченной этиловым эфиром. Всю вату помещают в тот же патрон. Сверху кладут небольшой слой ваты, затем края патрона завертывают.

Экстракция жира

Патрон с навеской БАД помещают в экстрактор. К экстрактору присоединяют чистую колбу, предварительно высушенную в течение 1 ч при 100-105 град. C и взвешенную после охлаждения. Через холодильник при помощи воронки наливают в экстрактор этиловый эфир так, чтобы патрон в экстракторе был полностью покрыт слоем эфира. В колбу наливают также эфир на 1/3 ее объема.

Колбу собранного аппарата нагревают на закрытой водяной бане, обеспечивающей равномерное, не слишком сильное кипение эфира. Через 3 ч проверяют полноту экстракции. Для этого, охладив колбу, отсоединяют ее на мгновение от остальной части прибора и 1-2 капли эфира с нижнего конца сифона экстрактора наносят на чистое часовое стекло или кусочек фильтровальной бумаги. Экстракцию считают законченной, если после испарения эфира не остается масляных пятен на стекле или бумаге.

По окончании аппарат разбирают, вынимают патрон из экстрактора, последний присоединяют снова к колбе и отгоняют растворитель на водяной бане. Колбу сушат с жиром в сушильном шкафу в течение 1 ч при температуре 100-105 град. C. Колбу взвешивают после охлаждения ее в эксикаторе. Последующие взвешивания производят через каждые 15 мин. сушки. Масса считается постоянной, если отличается от предыдущей не более чем на 0,0004 г.

Расчет результата определения

Массовую долю жира в БАД в % (X) вычисляют по формуле:

(M - M ) x 100

1 2

X = ---------------,

где:

M - масса колбы с высушенным жиром, г;

М - масса пустой колбы, г;

М - навеска БАД, г.

Конечным результатом считают среднее арифметическое двух

параллельных определений (X ) отдельных проб БАД. Вычисления

проводят до второго десятичного знака.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не

должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,01 x Х ,

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее

арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний,

выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать

значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,02 x Х ,

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее

арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных

лабораториях, %.

2. Методы определения жирнокислотного состава

Метод основан на разделении метиловых эфиров жирных кислот, полученных из липидов БАД, с помощью газожидкостной хроматографии.

Выделение липидов из БАД

Липиды выделяют экстракционным методом, предложенным для данной группы БАД, исключающим термическое воздействие на объект и изложенным в вышеприведенных разделах.

Получение метиловых эфиров жирных кислот

Метанолиз в щелочной среде нейтральных масел и жиров проводят по ГОСТ 30418-96 "Масла растительные. Метод определения жирнокислотного состава". Получение метиловых эфиров жирных кислот может быть проведено метанолизом в кислой среде или переэтерификацией липидов метанолом в среде хлористого водорода по ГОСТ Р 51486-99 "Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот".

Для определения абсолютных количеств жирных кислот проводится анализ с применением внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют маргариновую кислоту или дибутилфталат.

Анализ метиловых эфиров жирных кислот

методом ГЖХ

Метод основан на использовании газожидкостной хроматографии (ГЖХ) метиловых эфиров жирных кислот по ГОСТ Р 51483-99 "Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме". Результаты выражают в массовых долях каждого индивидуального компонента БАД.

Эталонный стандарт - смесь метиловых эфиров известного состава, желательно, аналогичного составу анализируемого вещества.

Идентификацию пиков метиловых эфиров жирных кислот проводят по относительным приведенным временам удерживания или эквивалентным длинам цепи (ЭДЦ).

В качестве неподвижных жидких фаз используют полиэфиры типа полиэтиленгликольадипат, полипропиленгликольадипат, диэтиленгликольсукцинат, цианосиликоны (SP-100, FFAP, силары OV-275, Sil-88) или другие жидкости, дающие необходимое хроматографическое разделение.

Комментарий к условиям анализа

Температура термостата колонок:

а) при анализе смесей метиловых эфиров жирных кислот с длиной цепи более 14 углеродных атомов 170-190 град. C (изотермический режим). Условия подбирают таким образом, чтобы метилолеат выходил из колонки за 15 мин.;

б) при анализе смесей метиловых эфиров, содержащих низкомолекулярные компоненты, температуру термостата программируют в пределах от 120 до 195 град. C со скоростью 6-8 град. C в 1 мин. (при наличии метилового эфира масляной кислоты начальная температура программирования 70 град. C).

Величина вводимой пробы - около 1-2 мкл раствора метиловых эфиров в гексане для набивных колонок и 0,2-0,3 мкл для капиллярных.

В случае необходимости рекомендуется производить анализ на двух зафиксированных фазах с различными полярностями с целью проверки отсутствия скрытых пиков (для рыбьего жира или в случае одновременного присутствия С18:3, С20:0, С20:1).

Обработка результатов

Качественный анализ

Анализируют эталонную смесь метиловых эфиров. Строят график зависимости логарифма времени удерживания от числа углеродных атомов в цепи. Получают ряд параллельных прямых для насыщенных, моно-, ди- и т.д. ненасыщенных метиловых эфиров кислот или находят величины эквивалентной длины цепи ЭДЦ для ненасыщенных и разветвленных жирных кислот по формуле:

lg V - lg V

x n

ЭДЦ = n + ---------------,

lg V - lg V

n+1 n

где:

n - число атомов углерода в насыщенной кислоте нормального

строения, находящейся на хроматограмме перед неизвестным

компонентом;

lg V - логарифм времени удерживания кислоты с n-числом атомов

углерода;

lg V - логарифм времени удерживания кислоты с (n+1)-числом

n+1

атомов углерода;

lg V - логарифм времени удерживания неизвестного компонента.

Идентифицируют пики на хроматограмме анализируемой смеси по полученному графику или по величинам ЭДЦ. Следует избегать условий анализа, при которых происходит наложение пиков метиловых эфиров различных кислот (например, метиллинолената и метиларахината).

Количественный анализ и способы расчета

За исключением специальных анализов расчет проводят методом внутренней нормализации, когда все компоненты смеси представлены на хроматограмме и площадь всех пиков компонентов составляет 100%. При наличии интегратора пользуются полученными с его помощью цифрами. При отсутствии интегратора площади пиков измеряют, умножая высоту пика на его ширину (или ширину пика на половине его высоты) и учитывая переключения чувствительности усилителя, используемые во время записи хроматограммы.

Расчет без использования поправочных коэффициентов

Расчет массовой доли i-го компонента в % проводят по формуле:

С = ------,

SUM S

где:

С - массовая доля i-го компонента;

S - площадь пика i-го компонента;

SUM S - сумма всех площадей пиков.

За результат анализа принимают среднее арифметическое (X ) из

двух параллельных измерений.

Расчет с использованием поправочных коэффициентов

В случае, когда в анализируемой смеси присутствуют кислоты с

12 и менее углеродными атомами в цепи, расчет ведется с

применением поправочных коэффициентов.

Поправочные коэффициенты (K ) рассчитывают по хроматограммам

эталонных смесей известного состава, полученным в условиях,

применяемых для анализа образца по формуле:

M x SUM S

i i

K = -----------,

i S x SUM M

i i

где:

M - масса i-го компонента в эталонной смеси, г;

SUM M - масса эталонной смеси, г.

Часто используют относительные поправочные коэффициенты (K")

по отношению к поправочному коэффициенту метилпальмитата (К ):

C16

K" = ----.

i K

C16

Массовую долю i-го компонента анализируемой смеси определяют

по формуле:

K x S

i i

C = ----------- x 100.

i SUM K x S

i i

За результат анализа принимают среднее арифметическое из двух параллельных измерений с записью до первого десятичного знака.

Расчет с применением внутреннего стандарта

В случаях, когда не все компоненты в анализируемой смеси элюируются из колонки или присутствуют очень летучие компоненты, используют для расчета метод внутреннего стандарта.

В качестве внутреннего стандарта применяют метиловые эфиры кислот, отсутствующие в анализируемой смеси. При анализе проб, содержащих масляную кислоту, в качестве внутреннего стандарта используют валериановую кислоту, в остальных случаях - пентадекановую или маргариновую кислоту. Массовую долю i-го компонента пробы определяют по формуле:

M x K x S

s i i

C = ------------ x 100 x m,

i M x K x S

s s

где:

m - содержание липидов в продукте, мг в 100 г;

M - масса внутреннего стандарта, мг;

М - масса образца, мг;

K - поправочный коэффициент внутреннего стандарта;

S - площадь пика внутреннего стандарта.

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения содержания жирных кислот в продукте

рассчитывают (в %) по следующим формулам:

r = 0,225 + 0,04 x Х ,

но не более 1% абсолютного содержания кислоты;

R = 0,310 + 0,075 x Х ,

но не более 3% абсолютного содержания кислоты.

3. Методы определения стеринов

3.1. Колориметрический метод определения содержания

стеринов после омыления проб

Метод основан на колориметрической реакции стеринов, извлекаемых диэтиловым эфиром из омыленных проб растительных масел, с уксусным ангидридом в присутствии концентрированной серной кислоты.

Условия проведения анализа

Экстракцию неомыленных веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.

Подготовка к проведению анализа

Приготовление и очистка реактивов

Безводный сернокислый натрий прокаливают в течение 1-1,5 ч при температуре 110 град. C. Диэтиловый эфир обрабатывают марганцовокислым калием (5 г на л) и гидратом окиси калия (10 г на 1 куб. дм) в течение суток, а затем перегоняют. Этиловый спирт ректификованный технический освобождают от альдегидов. Начальную и конечную порции отгона отбрасывают. Хлороформ сушат в течение суток под хлористым кальцием и перегоняют.

Построение градуировочного графика

Градуировочный график строят на основании результатов анализа проб с известным содержанием чистого бета-ситостерина.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см отвешивают 0,15-0,20 г бета-ситостерина (с записью результата до 4-го знака после запятой). Навеску растворяют в 100 куб. см хлороформа. Из полученного раствора готовят серию стандартных растворов с содержанием бета-ситостерина 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,14; 0,16; 0,18; 0,20 г/куб. дм. Из каждого раствора отбирают пипеткой 3 куб. см, добавляют 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель серной кислоты. Через 10 мин. после добавления кислоты измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм. В качестве контроля служит раствор, состоящий из 3 куб. см хлороформа, 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.

Градуировочный график строят в координатах: оптическая плотность (D) - концентрация стандартных растворов бета-ситостерина. Градуировочный график строят для каждого спектрофотометра и проверяют при смене партий путем определения оптической плотности стандартных растворов двух разных концентраций.

Проведение анализа

Испытуемый образец (1-3 г) взвешивают в колбе вместимостью 100 куб. см (с записью результата взвешивания до 4-го знака после запятой), добавляют 0,1-0,3 г аскорбиновой кислоты и 10-30 куб. см свежеприготовленного 2 н. спиртового раствора KOH. Смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин.

Содержимое колбы охлаждают и количественно переносят в делительную воронку с 30-90 куб. см дистиллированной воды. Неомыляемые вещества экстрагируют диэтиловым эфиром 3-4 раза порциями по 20-60 куб. см. Объединенный эфирный экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой до нейтральной реакции промывной воды по фенолфталеину. Промытую эфирную вытяжку помещают в коническую колбу, засыпают 5-10 г безводного сульфата натрия и оставляют в темном месте на 30 мин., периодически взбалтывая. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в другую колбу, фильтр ополаскивают эфиром. Эфир отгоняют под вакуумом при температуре не выше 25-30 град. C.

Остаток в колбе после отгонки эфира растворяют в зависимости от навески исследуемого образца в 1-3 куб. см бензола. Затем производят разделение компонентов смеси неомыляемых веществ методом тонкослойной хроматографии. Для этого на пластинку "Силуфол" наносят 50-150 мкл бензольного раствора неомыляемых веществ в виде полоски, отстоящей на 2 см от нижнего и боковых краев пластинки.

На одном уровне с пробой на расстоянии 1 см от краев пластинки наносят по капле раствор бета-ситостерина. Пластинку помещают вертикально в хроматографическую камеру, в которую заранее наливают смесь диэтилового и петролейного эфиров, взятых в соотношении 1:1. Количество растворителя зависит от размеров хроматографической камеры и регулируется высотой его слоя, равной 1 см.

Развитие хроматограммы продолжается до тех пор, пока фронт растворителя не поднимается на 10-12 см. Обычно это занимает 10-12 мин. Затем пластинку вынимают из камеры и подсушивают на воздухе до исчезновения запаха эфира. Края хроматограммы шириной 2 см опрыскивают 5%-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты, после чего пластинки помещают на 1-5 мин. (до проявления) в термостат с температурой около 90 град. C. На уровне окрашенного пятна свидетеля соскребают слой адсорбента. Адсорбент элюируют хлороформом 6-8 раз порциями по 1 куб. см. После каждого элюирования адсорбент отделяют центрифугированием или фильтрацией. Объединенный элюат собирают в градуированную пробирку и упаривают до объема 3 куб. см. К хлороформному раствору стеролов приливают 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты (по капле). Через 10 мин. измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм.

Контролем служит раствор, состоящий из 3 куб. см хлороформа, 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.

Обработка результатов

Массовую долю стеринов в пробе (X, %) рассчитывают по формуле:

V x V x C x 100

Х = ----------------,

V х М

где:

V - объем хлороформного раствора, взятого для проведения

колориметрической реакции, куб. см;

V - объем бензольного раствора неомыляемых веществ, куб. см;

V - объем бензольного раствора неомыляемых веществ,

нанесенный на пластинку, куб. см;

С - концентрация стеролов, определяемая по градуировочному

графику, г/куб. дм;

М - масса образца, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Таблица 6

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)

И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

┌───────────────────────────┬─────────────────┬──────────────────┐

│ Содержание в продукте, % │ Rr, % │ RR, % │

├───────────────────────────┼─────────────────┼──────────────────┤

│Менее 0,5 │ 20 │ 40 │

│ │ │ │

│0,5-1,0 │ 15 │ 30 │

│ │ │ │

│Более 1,0 │ 10 │ 20 │

└───────────────────────────┴─────────────────┴──────────────────┘

3.2. Определение состава стеринов методом ГЖХ

Метод основан на прямом газохроматографическом анализе стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии фракции неомыляемых веществ.

Условия проведения анализа

Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов, предложенных для данного продукта и исключающих разрушение стеринов.

Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Подготовка к проведению анализа

Подготовку проводят по п. "Колориметрический метод определения содержания стеринов".

Проведение анализа

Выделение стеролов из липидов

Омыление липидов, экстракцию неомыляемых веществ, выделение стеринов методом тонкослойной хроматографии проводят по п. "Колориметрический метод определения содержания стеринов".

Газохроматографический анализ

Аппаратура, используемая для проведения анализа, выбор оптимальных условий для разделения стеринов, определение эффективности хроматографических колонок изложены в п. выше.

Устанавливают следующие условия анализа на хроматографе: стеклянная или стальная колонка длиной 1,5-2,0 м и внутренним диаметром 3-4 мм, заполненная силанизированным целитом 545 (60-100 меш.), обработанным 3% полиметилсилоксаном SE-30 или аналогичной неподвижной фазой. Скорость потока газа-носителя 60-100 куб. см/мин. Температура термостата колонки 250-270 град. C, инжектора 300 град. C, детекторов 280 град. C.

Вводят в хроматограф около 3 мкл каждого компонента.

Обработка результатов

Рассчитывают площади пиков каждого компонента (S ) по формуле:

S = K x D x H ,

i i i i

где:

D - ширина i-го пика на половине его высоты, мм;

Н - высота i-го пика, мм;

K - поправочный коэффициент.

Для получения поправочных коэффициентов составляют 3-4

стандартные смеси стеролов, входящих в исследуемые образцы, и

холестерола. По хроматограммам стандартных смесей, полученных в

идентичных условиях, определяют поправочные коэффициенты по

отношению к холестеролу, коэффициент которого принят за единицу,

по формуле:

M S

i ст

К = --- x ---,

i M S

ст i

где:

M и М - масса i-го компонента и стандарта (холестерина);

i ст

S и S - площади их пиков соответственно.

i ст

Молярную долю каждого стерина (С ) рассчитывают методом

нормализации по формуле, принимая сумму площадей всех типов за

100%:

S х 100

--------,

SUM S

где:

S - площадь пика i-го компонента;

SUM S - сумма площадей пиков стеринов.

Метрологические характеристики

Таблица 7

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)

И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Содержание, %	Rr, %	RR, %
Менее 0,5	20	40
0,5-1,0	15	30
Более 1,0	10	20

3.3. Метод хромато-масс-спектрометрии

в анализе стеринов

Метод основан на прямом хромато-масс-спектрометрическом анализе стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии фракции неомыляемых веществ.

Условия проведения анализа

Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов, предложенных для данного БАД и исключающих разрушение стеринов.

Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света, отгонку растворителя следует проводить под вакуумом на ротационном испарителе при комнатной температуре.

Подготовку к проведению анализа и выделение стеринов из липидов проводят по п. "Колориметрический метод определения содержания стеринов".

Условия анализа: хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки данных, энергия ионизирующих электронов 70 eV; диапазон массовых чисел 39-500 а.е.м.; температура источника ионов 120 град. C; хроматографическое разделение на капиллярной колонке 47 м х 0,3 мм с химически связанной фазой SE-30, начальная температура колонки 50 град. C - 2 мин., 240 град. C - 8 мин. с последующим программированием со скоростью 4 град. C/мин. до 300 град. C и изотермой (30 мин.), температура испарителя 280 град. C, переходных линий 275 град. C. Скорость газа-носителя гелия 1,3 куб. см/мин., в момент ввода пробы сброс перекрыт на 30 с, далее деление потока 1:60.

Структуру компонентов определяют путем сравнения полученных масс-спектров с имеющейся базой данных, а также по молекулярным и характеристическим осколочным ионам, выбор которых определяется эмпирическими корреляциями между масс-спектром и структурой изучаемых стеринов.

Таблица 8

СОСТАВ ФРАКЦИЙ СТЕРИНОВ, % ОТН.,

ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЯДА БАД НА РАСТИТЕЛЬНОЙ ОСНОВЕ

И НА ОСНОВЕ МОРЕПРОДУКТОВ, ПОЛУЧЕННЫЙ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА

ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Стерины	М.м.	Соя	Аво- кадо	Апель- син	Ко- кос	Ама- рант (ши- ри- ца)	Рапс	Каль- мар
ДЕЛЬТА-5,7,22,24- эргостатетраенол	394	0,7
4альфа-метил-холеста- 5,7,22-триенол	396	0,4
холестерин	386	0,1	0,4	0,8	0,7	2,3	0,7	96,8
десмостерин	384							1,6
брассикастерин	398						10,3
эргостерин	396			0,3
24-метиленхолестерин	398			0,7				1,0
кампестерин	400	17,4	4,0	4,0	5,8	-	29,4
дигидрокампестерин	402	1,0					2,0
лофенол	400							0,4
стигмастерин	412	16,1	0,7	6,4	9,5
ДЕЛЬТА-7-кампестерин	400					4,3
обтусифолиол	426				0,6
клионастерин	414							0,2
циклоартанол	428				0,7
бета-ситостерин	414	47,5	89,9	83,5	44,2	-	52,9
дигидроситостерин	416	3,0
бета-амирин	426	1,4
ДЕЛЬТА-5-авенастерин	412	2,4	3,8	2,2	10,2		4,7
альфа-амирин	426	1,4
циклоэфкаленол	426	1,1			2,3
циклоартенол	426	2,4	0,1		16,2	1,0
ДЕЛЬТА-7-стигмастерин	412	2,6	0,4	0,6	4,4	60,6
ДЕЛЬТА-7-авенастерин	412	1,4	0,6	1,0
24-метиленцикло- артанол	440		0,1		4,1
ДЕЛЬТА-7-ситостерин	414					31,8
цитростадиенол	426	2,4		0,5	1,3

4. Метод определения фосфолипидов

(определение суммарного фосфора)

Метод основан на способности фосфора, соединяясь с молибденом аммония, образовывать фосфорно-молибденовую кислоту, которая восстанавливается амидоловым реагентом и дает голубое окрашивание.

Специфические приборы и реактивы

Спектрофотометр.

Молибдат аммония, 8,4%-ный.

Амидоловый реагент, 1%-ный, свежеприготовленный.

Спиртовой раствор фосфора, 1,097 г КН2РО4 растворяют в 250 куб. см воды, этот запасной раствор разбавляют водой и получают рабочий раствор, содержащий 10 мкг фосфора в 1 куб. см.

Подготовка проб

Пипеткой отбирают аликвотную часть раствора липидов (содержащую 10-100 мкг фосфора, но не более 2 мг липидов) и переносят ее в толстостенную пирексовую пробирку с делениями, соответствующими 12,5 и 25 куб. см. Растворитель упаривают досуха в токе воздуха при 350 град. C, к остатку прибавляют 2,0 куб. см хлорной кислоты, немного стеклянных шариков и нагревают пробирку на электрической плитке или газовой горелке до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и бесцветным. Охлажденный раствор разбавляют водой по 12,5 куб. см, тщательно перемешивают, добавляют 1,0 куб. см раствора молибдата аммония, перемешивают и оставляют на 20 мин. до появления голубой окраски.

Проведение испытания

Окрашенный раствор разбавляют водой по 25 куб. см, перемешивают. На спектрофотометре типа СФ-46 в парных кюветах 1 см определяют поглощение при 680 нм полученного раствора и р-ра холостого опыта.

Обработка результатов

Расчет производят по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору КН2РО4. Используют аликвотные пробы стандартного раствора, содержащие от 30 до 60 мкг фосфора. Закон Бера соблюдается в интервале 10-100 мкг фосфора.

III. Методы определения углеводов

1. Определение содержания крахмала

с помощью поляриметрического метода

Метод определения массовой доли крахмала в БАД на зерновой основе распространяется на продукты с массовой долей крахмала выше 10%. Содержание крахмала определяют поляриметрическим методом путем его гидролиза раствором соляной кислоты.

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Сахариметр или поляриметр.

Мельница лабораторная, обеспечивающая требуемую крупность размола.

Сито из проволочной сетки N 08 по ТУ 14-4-1374-86.

Соляная кислота по ГОСТу 3118-77, раствор массовой концентрацией 11,24 г/куб. дм, для анализа картофеля - 3,77 г/куб. дм.

Калий железистосинеродистый по ГОСТу 4207-75, раствор массовой концентрацией 150 г/куб. дм.

Цинка сульфат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой концентрацией 150 г/куб. дм.

Аммония молибдат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой концентрацией 100 г/куб. дм.

Натрия молибдат по ГОСТу 10931-74, раствор массовой концентрацией 150 г/куб. дм.

Фосфорно-вольфрамовая кислота, раствор массовой концентрацией 40 г/куб. дм.

Подготовка к испытанию

Пробы, влажность которых превышает 17%, предварительно подсушивают на воздухе или в одном из следующих устройств: сушильном шкафу, термостате, лабораторном сушильном аппарате при температуре воздуха не более 50 град. C. Пробу тщательно перемешивают, измельчают до такой степени, чтобы весь размолотый материал прошел при просеивании через сито из проволочной сетки N 8.

Одновременно со взятием навесок для анализа берут навески для определения влажности. Определение влажности осуществляется по ГОСТам, принятым в соответствующей отрасли.

Проведение испытания

Из аналитической пробы берут навеску массой 5 г с погрешностью не более 0,01 г, помещают в 100 куб. см центрифужный стакан, доливают 18 куб. см 10% раствора этанола (при определении массовой доли крахмала в отрубях - 28 куб. см раствора этанола) и перемешивают стеклянной палочкой. Стеклянную палочку ополаскивают 2 куб. см раствора этанола. Закрывают центрифужный стакан резиновой пробкой и вручную сильно встряхивают в течение 2 мин.

После встряхивания стенки центрифужного стакана и резиновую пробку ополаскивают 25 куб. см этанола. Затем в течение 20 мин. пробу центрифугируют при 4000 об./мин., после чего прозрачный центрифугат сливают. К остатку постепенно добавляют 20 куб. см соляной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой до образования суспензии и переносят в мерную колбу на 100 куб. см. Прилипшие к стенкам центрифужного стакана и к стеклянной палочке остатки пробы многократно ополаскивают раствором соляной кислоты массовой концентрацией 11,24 г/куб. дм в мерную колбу; общее количество раствора соляной кислоты составляет 50 куб. см.

Мерную колбу при постоянном встряхивании погружают в кипящую водяную баню. Из-за погружения мерной колбы не должен нарушаться процесс кипения водяной бани: с помощью специальных уплотнительных колец ее следует держать по возможности закрытой. По секундомеру встряхивают мерную колбу в течение 3 мин., при этом колбу из водяной бани не поднимают. После этого выдерживают колбу без встряхивания для всех крахмалосодержащих БАД 12 мин.

По истечении в общей сложности 15 мин. для всех крахмалосодержащих БАД колбу вынимают из бани и быстро приливают столько холодной воды, чтобы до мерной черты оставался объем не более 10-15 куб. см. Содержимое колбы охлаждают в проточной воде до температуры 20 град. C.

Белковые вещества в растворе осаждают добавлением 2 куб. см раствора калия железистосинеродистого (150 г/куб. дм) и после перемешивания 2 куб. см раствора цинка сульфата (150 г/куб. дм). Затем мерную колбу в течение 10-15 мин. выдерживают при комнатной температуре, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и в течение 5 мин. дают отстояться. Взамен обоих указанных реактивов в случае их отсутствия для осаждения белков и осветления раствора в колбу приливают 5 куб. см раствора аммония молибдата (100 г/куб. дм), или 5 куб. см раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (40 г/куб. дм), или 3 куб. см раствора натрия молибдата (165 г/куб. дм). При использовании молибдатов в качестве осадителей белков рекомендуется избегать попадания солнечных лучей на реактивы. Содержимое колбы через сухой складчатый фильтр фильтруют в сухую коническую колбу, первые несколько капель фильтрата отбрасывают. Прозрачным фильтром заполняют трубку поляриметра и в поляриметре измеряют оптическое вращение. Угол вращения испытуемого раствора в трубке поляриметра измеряют 5 раз.

До начала и после каждого второго измерения производят контроль установки поляриметра на нуль. Средняя величина 5 измерений служит исходной величиной для дальнейших вычислений массовой доли крахмала.

Обработка результатов

Массовую долю крахмала (X) в процентах вычисляют по следующим формулам.

При использовании сахариметра с нормальной шкалой:

Х = К х а

или при использовании поляриметра с круговой шкалой:

K x a

X = ------,

0,3468

где:

К - переводной коэффициент, который при длине трубки 2 дм равен 1,9;

а - показатель сахариметра или поляриметра в градусах шкалы (переводные коэффициенты К для длины трубки 1 дм умножают на 2).

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных определений (r) не должны превышать значений:

r = 0,03 + 0,04 x Х ,

но не более 0,5% абсолютного содержания крахмала в БАД, где X

- среднее арифметическое двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между результатами измерений,

выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать

значений:

R = 0,05 + 0,06 x Х ,

но не более 1,2% абсолютного содержания крахмала в продукте,

где Х - среднее значение результатов измерений, выполненных в

двух разных лабораториях.

2. Определение содержания и состава углеводов

2.1. Определение состава углеводов

с помощью метода ГЖХ

Метод основан на переводе углеводов типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы, сорбита и инозита в БАД в триметилсилильные производные с последующим их газохроматографическим анализом.

Специфические реактивы, материалы и аппаратура

Гексан х.ч.

Гексаметилдисилазан.

Трифторуксусная кислота или триметилхлорсилан.

Пиридин х.ч., безводный.

Ксилит х.ч. или инозит.

Свинец уксуснокислый х.ч.

Неподвижные фазы для ГЖХ SE-30, OV-17, ХЕ-60, СКТФТ-50.

Инертный носитель для ГЖХ: хромосорб-W DMCS, хроматон-N DMCS.

Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и устройством для программирования температуры.

Стеклянная насадочная колонка длиной 2-3 м и диаметром 3-4 мм или капиллярная колонка длиной 25-30 м с нанесенной фазой.

Микрошприц емкостью 1,0-10 мкл.

Роторный испаритель.

Подготовка образцов

БАД с низким содержанием лимонной кислоты (менее 1,5%)

Содержание лимонной кислоты устанавливается по "Таблицам химического состава". Навеску гомогенизированной пробы БАД с высоким содержанием сухих веществ (более 60%) наносят на полиэтиленовую пластинку в количестве 50-150 мг и взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,0001 г. На этой же пластинке взвешивают 5-10 мг ксилита. Пластинку помещают в круглодонную колбу емкостью 10-25 куб. см и силилируют без обезвоживания с использованием трифторуксусной кислоты. При использовании триметилхлорсилана содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе при 60 град. C под вакуумом. В случае медленного упаривания в колбу добавляют 1 куб. см бензола. После упаривания проводят силилирование.

Жидкие БАД отмеряют пипеткой в количестве 0,5-1,0 куб. см и помещают в круглодонную колбу емкостью 10-25 куб. см, снабженную шлифом. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску 5-10 мг ксилита, взвешенного с точностью до 0,0001 г. Содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе.

БАД с содержанием лимонной кислоты более 1,5%

Для исключения наложения пика ТМС-производного лимонной кислоты на ТМС-производное бета-глюкозы лимонную кислоту осаждают уксуснокислым свинцом. Навеску средней гомогенизированной пробы БАД (содержащие лимонную кислоту как пищевую или консервирующую добавку) в количестве 1-15 г взвешивают с точностью до 0,001 г в конической колбе емкостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см 75-80% раствора этанола и экстрагируют 30 мин. при температуре 60-70 град. C. Используют водяную баню и обратный холодильник. Экстракцию повторяют трижды, экстракты объединяют.

Колбу доводят до метки дистиллированной водой. В центрифужную пробирку на 10 куб. см вносят пипеткой 5 куб. см отфильтрованного экстракта, 0,5 куб. см насыщенного раствора уксуснокислого свинца. Осадок центрифугируется. 1 куб. см надосадочной жидкости переносят в шлифную круглодонную колбу емкостью 10-25 куб. см. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску ксилита 5-10 мг. Содержимое колбы упаривается на роторном испарителе при 60 град. C под вакуумом.

Получение триметилсилильных (ТМС) производных

Способ с использованием трифторуксусной кислоты

В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 куб. см пиридина, 0,9 куб. см гексаметилдисилазана, 0,1 куб. см трифторуксусной кислоты, плотно закрывают и энергично встряхивают в течение 30 с. Вначале наблюдают расслоение жидкости на 2 фазы, при этом нижний слой незначителен. По мере стояния раствора в течение 20-30 мин. это расслоение исчезает и начинает выделяться аммиак, что указывает на успешное протекание реакции силилирования. После прекращения выделения аммиака раствор выдерживают 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 60 град. C. Длительно сохраняющееся расслоение, исчезающее только при нагревании, говорит о том, что реакция силилирования прошла не полностью из-за высокого содержания влаги (более 40%) или повышенного содержания углеводов. В этом случае подготовку пробы повторяют, уменьшив при этом навеску или увеличив время высушивания на роторном испарителе.

Способ с использованием триметилхлорсилана

В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 куб. см пиридина, 0,2 куб. см гексаметилдисилазана и 0,1 куб. см триметилхлорсилана, встряхивают в течение 1 мин. и нагревают в термостате 45 мин. при 60 град. C, затем хроматографируют.

Для упрощения идентификации и количественных расчетов (если не требуется знания аномерного состава сахаров) определение сахаров производят в виде ТМС-производных сахаров. В подготовленную пробу образца добавляют 100 г гидроксиламина солянокислого, приливают 10 куб. см пиридина и выдерживают в термостате при 80 град. C в течение 2 ч. Охлаждают и далее приливают силилирующие реагенты.

Газохроматографический анализ

Подготовка хроматографической колонки

Условия: стеклянная колонка, наполненная сорбентом, с 3-5% неподвижной жидкой фазы, длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм. Температуру колонки программируют от 125 до 270 град. C со скоростью 4 град. C в 1 мин., температура испарителя 250 град. C, расход газа-носителя 40 куб. см/мин., температура пламенно-ионизационного детектора 250 град. C.

Газохроматографическое определение

1,0 мкл пиридинового раствора триметилсилильных производных углеводов вводят в испаритель хроматографа и элюируют из колонки газом-носителем. Идентификацию индивидуальных триметилсилильных производных проводят по времени удерживания триметилсилильных производных сахаров-метчиков и методом добавки.

Приготовление калибровочных растворов

Сахара, имеющие альфа- и бета-аномеры

Навеску ксилита и навеску определяемого сахара, взятую с точностью до 0,0001 г, помещают в коническую колбу и заливают дистиллированной водой до полного растворения углеводов. Раствор выдерживают в течение суток. Аликвотную часть раствора отбирают пипеткой, помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха, после чего проводят силилирование.

Сахара, не имеющие аномеров

Сахара, не имеющие аномеров, силилируют без предварительного растворения.

Обработка результатов

Массовую долю отдельных сахаров (в %) в навеске БАД определяют по формуле:

A x K x C x 100

1 1

C = -----------------,

1 A x Q

где:

С - содержание отдельного сахара в навеске, %;

К - поправочный коэффициент данного сахара;

С - масса навески стандарта, мг;

Q - навеска образца;

А - площадь пика стандарта в относительных единицах;

А - площадь пика данного сахара в относительных единицах.

Расчет площадей хроматографических

пиков сахарозы и альфа-лактозы при их совместном

присутствии в пробе

Ввиду того, что альфа-лактоза и сахароза выходят на хроматограмме одним пиком, площадь пика альфа-лактозы определяют исходя из соотношения площадей альфа- и бета-лактозы в модельном соединении лактозы. За основу берется площадь пика бета-лактозы. Площадь пика сахарозы определяют вычитанием от суммарного пика сахарозы пика альфа-лактозы, рассчитанного из пика бета-лактозы. За окончательный результат принимают среднеарифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Окончательный результат округляют до трехзначной цифры.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) зависят от содержания сахаров в продукте.

При содержании отдельных сахаров типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, рафинозы, инозита и сорбита в продукте в пределах от 1 до 5%:

- значения Rr = 20%, RR = 40% для каждого сахара; при содержании отдельного сахара в продукте свыше 5%;

- значения Rr = 10%, RR = 25% для каждого сахара.

2.2. Определение состава углеводов

с помощью метода ВЭЖХ

Настоящий метод основан на выделении, разделении и количественном определении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии моно-, ди-, олигосахаров, а также сахарных спиртов. Он распространяется на определение глюкозы, фруктозы, арабинозы, фукозы, галактозы, ксилозы, лактозы, лактулозы, мальтозы, мальтотриозы, маннозы, сахарозы, раффинозы, стахиозы, сорбита, инозита, мальтита, ксилита, изомальта, лактитола, добавленных в БАД.

Приборы и реактивы

Прибор для проведения хроматографии методом ВЭЖХ, состоящий из насоса, детектора-рефрактометра, колонки 250 мм х 4 мм Сепарон SGX NH2 или аналогичной.

Компьютер с программным обеспечением по приему и обработке хроматографических данных.

Ротационный испаритель, водяная баня, обратный холодильник, две стеклянные колонки 7-10 см (внутренний диаметр 10 мм).

Ацетонитрил CH3CN для хроматографии.

Этиловый спирт 80%.

Ионообменная смола Дауэкс 50х4, 200-400 меш. (Н -форма).

Ионообменная смола Дауэкс 1 x 8, 200-400 меш. (формиатная форма).

2Н NaOH, 3Н HCl, 3Н формиат натрия, бидистиллированная вода.

0,1%-ный раствор азотнокислого серебра.

Изопропиловый спирт.

Экстракция

Углеводы извлекают из БАД 80% этиловым спиртом с учетом естественной влаги. Навеску БАД заливают в колбе в соотношении 1:4 по сухим веществам 96% этанолом и необходимым количеством воды с расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах 80-82%. Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане при 70-80 град. C в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку отфильтровывают. К остатку приливают опять раствор 80%-ного спирта и экстракцию повторяют в тех же условиях. Всего углеводы экстрагируют из продукта 3-4 раза.

Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на ротационном испарителе при температуре не выше 40 град. C.

Очистка экстракта

Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и др.). Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей, экстракты пропускают через колонку с дауэксом 50х4, непосредственно соединенную с колонкой, содержащей дауэкс 1 x 8.

Подготовка дауэкс 50х4, 200-400 меш.

Смолу последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2н NaOH, дистиллированной водой, 3н HCl и опять водой. Избыток воды удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения колонки.

Ионообменная способность для дауэкса 50х4 в сухом виде составляет 5,1 мэкв/куб. см и во влажном 1,7 мэкв/куб. см соответственно.

Подготовка дауэкс 1 x 8, 200-400 меш.

Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из

дауэкса 1 x 8 (CI -форма), пропуская через смолу на бюхнеровской

воронке 3н формиат натрия до тех пор, пока проба на CI не станет

отрицательной (проба с азотнокислым серебром). После этого смолу

промывают большими объемами дистиллированной воды и заполняют

колонку. Ионообменная способность для дауэкса 1х8 в сухом виде

составляет 3,2 мэкв/куб. см и во влажном виде 1,4 мэкв/куб. см.

С двух колонок собирают элюент и, если необходимо, его концентрируют в роторном испарителе. Чтобы упарить воду и не поднимать температуру, к образцу добавляют этанол. Упаренный образец переносят в мерную посуду и замеряют объем и хроматографируют.

Анализ ВЭЖХ

Подготовка колонки

Для этого колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Условия ВЭЖХ

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (77:23). Смесь дегазируют на роторном испарителе. Подвижная фаза для мальтотриозы, стахиозы и рафинозы: ацетонитрил - вода (60:40).

Детектирование - рефрактометр. Скорость потока 2,5 куб. см /мин. Стандартный раствор углевода 10 мг/куб. см предварительно высушивают в сушильном шкафу при 105 град. C до постоянного веса в стеклянных бюксах. Обработка хроматографических данных по программе МультиХром для Windows или аналогичной. Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +/- 5%.колонку.

Определение содержания глюкозы в смеси с сорбитом

При описанных выше условиях хроматографирования время удерживания глюкозы и сорбита одинаковое и на хроматограмме они выходят единым пиком. В таких случаях количество глюкозы определяют глюкозооксидазным методом с использованием соответствующего ферментативного набора. Проведение анализа описано в соответствующем наборе. Количество сорбита определяют расчетным способом как разницу суммарного содержания глюкозы и сорбита (по хроматограмме) и глюкозы (полученной ферментативным методом). В связи с разницей рефрактометрического индекса глюкозы и сорбита в расчетную формулу вводят поправочный коэффициент:

С = (С - С ) х К / К ,

сорбита суммарное глюкозы сорбита глюкозы

где К - коэффициент пропорциональности, взятый из программы МультиХром.

3. Определение содержания пектина

Образец измельчают, взвешивают около от 1 до 5 г (в зависимости от того, сколько содержится пектина в образце), переносят в стеклянную колбу, заливают кипящей водой, в которую добавлена концентрированная соляная кислота из расчета 0,8 куб. см на 250 куб. см дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании в течение 30 мин. при 95-100 град. C. Охлаждают до температуры ниже 25 град. C, чтобы свести к минимуму тепловое разрушение пектина, и фильтруют на воронке Бюхнера через капроновую ткань с отсасыванием. Если смесь плохо фильтруется, ее центрифугируют при 5000 об./мин. в течение 30 мин. Экстракцию проводят дважды, экстракты и промывную воду объединяют, измеряют количество и к охлажденному раствору пектина прибавляют 1,5 объема этанола (можно использовать изопропиловый спирт или ацетон), содержащего 2 куб. см концентрированной соляной кислоты (уд. вес 1,19) на 1 л. Смесь перемешивают вручную медленно и тщательно и оставляют стоять на 30 мин. с тем, чтобы пектин всплыл на поверхность. Большую часть не содержащего пектина раствора можно отделить сифонированием. Осадок пектина отделяют центрифугированием, промывают спиртом до тех пор, пока реакция с нитратом серебра на ион-хлорид в промывных растворах будет отрицательной. Осадок сушат в термостате при 60 град. C до постоянного веса.

Содержание пектина определяют гравиметрически.

Ошибка метода 5%. Метод не пригоден для БАД, содержащих большие количества (более 30%) сахарозы.

4. Методы определения содержания

редуцирующих веществ, общего сахара и сахарозы

4.1. Колориметрический метод

Метод основан на колориметрировании избытка щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия после реакции с редуцирующими сахарами объекта исследования. При этом гексацианоферрат (III) восстанавливается до гексацианоферрата (II), что ведет к ослаблению окраски, так как K3[Fe(CN)6] окрашен значительно интенсивнее, чем K4[Fe(CN)6].

Специфические реактивы

Глюкоза кристаллическая гидратная, х.ч. по ГОСТу 975-88.

Гексацианоферрат (III) калия, х.ч. по ГОСТу 4206-75.

Гидроксид калия, ч.д.а. по ГОСТу 24363-80 или гидроксид натрия, ч.д.а., по ГОСТу 4328-77, раствор с концентрацией NaOH (или KOH) 2,0 М и 1,25 М.

Кислота хлороводородная, х.ч. по ГОСТу 3118-77, раствор с концентрацией 1 М.

Натрия хлорид, х.ч., по ГОСТу 4233-77.

Метиленовый голубой, индикатор, 1 г растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды и фильтруют.

Сахароза, х.ч. по ГОСТу 5833-75 или сахар-рафинад по ГОСТу 22-78.

Цинка сульфат, х.ч., по ГОСТу 4174-77, раствор с концентрацией 0,5 М.

Внимание! Перед проведением анализа необходимо в обязательном порядке проверить вместимость мерной посуды и пипеток по I классу точности!

Подготовка к анализу

Приготовление раствора гексацианоферрата (III) калия - основной реактив. Взвешивают 8 г K3[Fe(CN)6] и 20 г NaOH (или 28 г KOH). Отдельно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем оба раствора сливают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор готов к использованию через сутки. Раствор можно хранить в склянке из темного стекла в течение 2 мес.

Приготовление стандартного раствора глюкозы

1,6000 г безводной глюкозы взвешивают с точностью до 0,0002 г и растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см. Предварительно глюкозу выдерживают в эксикаторе над свежепрокаленным хлоридом кальция в течение 3 сут. После растворения навески раствор в колбе доводят до метки. Если раствор готовят на месяц, необходимо внести в колбу 150 г хлорида натрия и хранить в холодильнике.

Построение градуировочного графика

В 6 конических колб вместимостью 100 куб. см вносят пипеткой по 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и по 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5 куб. см стандартного раствора глюкозы. Из бюретки соответственно приливают 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0 куб. см дистиллированной воды, тем самым доводят объем жидкости в каждой колбе до 41 куб. см. Содержимое каждой колбы нагревают до кипения за 3 мин. и кипятят в течение 1 мин., закрыв часовым стеклом. Затем охлаждают и измеряют оптическую плотность на ФЭК со светофильтром, имеющим лямбда эф = 440 нм (синий светофильтр). Раствором сравнения служит дистиллированная вода. Кювету подбирают такого размера, чтобы оптическая плотность была в пределах 0,3-0,6 для раствора, содержащего 8,5 куб. см раствора глюкозы (10, 20 или 30 мм). Оптическую плотность определяют в каждом растворе не менее 3-х раз и из полученных данных берут среднее арифметическое значение. Строят график зависимости величины оптической плотности от концентрации глюкозы в растворе. Полученный график используют для определения содержания общего сахара, восстанавливающих сахаров и сахарозы.

Приготовление исследуемого раствора

Объект исследования тщательно измельчают в ступке. Затем готовят водную вытяжку объекта исследования. Массу навески М в граммах рассчитывают по формуле:

C x V

М = -----,

где:

V - вместимость колбы, куб. см;

Р - предполагаемое содержание общего сахара в объекте исследования, %;

С - оптимальная для данного метода концентрация сахаров в водной вытяжке на 100 куб. см (принимают равной 0,16 г).

Растворение навески и осаждение несахаров проводят следующим образом. Образец измельченного исследуемого БАД взвешивают с погрешностью не более 0,01 г из такого расчета, чтобы в 100 куб. см полученного раствора содержалось 0,3-0,4 г редуцирующих веществ. Массу навески М в граммах вычисляют по формуле:

С х V

М = -----,

где:

С - оптимальное содержание редуцирующих веществ в 100 куб. см раствора навески, г;

V - вместимость мерной колбы, куб. см;

Р - предполагаемая массовая доля редуцирующих веществ в исследуемом изделии, %.

Навеску растворяют в стакане в дистиллированной воде, нагретой до 60-70 град. C. Если БАД растворяется без остатка, то полученный в стакане раствор охлаждают и переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и хорошо перемешивают. Если БАД в своем составе имеет вещества, нерастворимые в воде (мешающие несахара - белки, жиры, пектины, крахмал и т.д.), то навеску в стакане переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, смывая нерастворимые частицы в колбу дистиллированной водой примерно до половины объема колбы. Органические кислоты, содержащиеся в навеске, нейтрализуют раствором углекислого натрия до pH 7,0, применяя для контроля универсальную индикаторную или лакмусовую бумагу. Колбу помещают в водяную баню, нагретую до 60 град. C, при этой температуре, временами взбалтывая, выдерживают в течение 15 мин. Охладив раствор до комнатной температуры, осаждают мешающие несахара, прибавляя к раствору в колбе 10 куб. см 1 М раствора сульфата цинка, если масса навески была менее 5 г, и 15 куб. см, если масса навески была более 5 г, и такой объем 1 М раствора гидроксида натрия, который установлен отдельным опытом при титровании соответствующего объема раствора сульфата цинка с фенолфталеином.

Содержимое колбы взбалтывают, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют в сухую колбу, которую предварительно ополаскивают 1-2 раза небольшой порцией фильтрата.

Допускается осаждение несахаров другими осадителями: растворами ацетата свинца и фосфата (или сульфата) натрия и растворами гексацианоферрата (II) калия и ацетата цинка. При осаждении несахаров ацетатом свинца к охлажденному до комнатной температуры раствору прибавляют мерным цилиндром 7 куб. см раствора ацетата свинца, хорошо перемешивают и оставляют стоять 5 мин. Появление прозрачного слоя жидкости над осадком указывает на полноту осаждения, в противном случае вносят дополнительно по каплям раствор ацетата свинца до появления прозрачного слоя жидкости. Затем в эту же колбу для удаления избытка ацетата свинца вносят 18-20 куб. см раствора фосфата (или сульфата) натрия.

Содержимое колбы взбалтывают, осадку дают отстояться. Для осаждения избытка ацетата свинца фосфатом натрия достаточно 10 мин. При осаждении сульфатом натрия при мутном растворе жидкость отстаивается 24 ч. После отстаивания проверяют полноту осаждения, приливая по стенке горлышка колбы несколько капель раствора фосфата или сульфата натрия. При помутнении жидкости прибавляют дополнительно один из указанных выше растворов (1-2 куб. см), затем содержимое колбы взбалтывают, дают отстояться и снова проверяют полноту осаждения. При отсутствии помутнения в месте соприкосновения жидкостей содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют в сухую колбу.

При осаждении несахаров раствором гексацианоферрата (II) калия к охлажденному до комнатной температуры раствору прибавляют пипеткой 2 куб. см раствора гексацианоферрата (II) калия, взбалтывают, добавляют 2 куб. см раствора ацетата цинка, снова взбалтывают и дают отстояться 5 мин. Если раствор над осадком остается мутным, добавляют большее количество указанных растворов в равных объемах. Содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют в сухую колбу. Во всех случаях фильтрат должен быть прозрачным.

При анализе окрашенных БАД (сокосодержащих и т.п.) необходимо связать красящие вещества и нейтрализовать органические кислоты раствором 1 М гидроксида натрия или 1 М гидроксида калия и связать дубильные вещества ацетатом свинца. Для этого добавляют к пробе по капле раствор карбоната натрия или 1 М раствор гидроксида натрия до слабокислой или нейтральной реакции и 30%-ный раствор ацетата свинца. После тщательного перемешивания и отстаивания добавляют по каплям раствор сульфата натрия до прекращения образования осадка, для связывания избытка ацетата свинца. Доводят водой до метки, отстаивают и фильтруют.

Проведение анализа

Определение восстанавливающих сахаров

В коническую колбу вместимостью 100-150 куб. см вносят 10 куб. см раствора пробы, 6 куб. см дистиллированной воды и затем 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до кипения за 3 мин., кипятят 1 мин., охлаждают и измеряют оптическую плотность при лямбда = 440 нм. Раствор сравнения - дистиллированная вода. Кювету берут размером, аналогичным взятому для построения градуировочного графика. Если оптическая плотность раствора не попадает в интервал 0,3-0,6, необходимо взять меньшую аликвоту пробы или поменять разведение, сохраняя постоянный объем жидкости в реакционной колбе равным 41 куб. см. Результаты вычисляют, пользуясь градуировочным графиком и нижеприведенной формулой.

Определение общего сахара

Для определения общего сахара проводят гидролиз сахарозы. В реакционную коническую колбу вместимостью 100-150 куб. см отмеривают пипеткой 10 куб. см приготовленной вытяжки объекта и 4 куб. см 1 М раствора хлороводородной кислоты. Колбу ставят на электроплитку, жидкость доводят до кипения и кипятят 1 мин., охлаждают до комнатной температуры. Затем в колбу вносят 2 куб. см 2 М раствора гидроксида натрия (или калия) для нейтрализации кислоты и затем 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия. Содержимое колбы доводят до кипения и кипятят 1 мин. После охлаждения заполняют полученным раствором кювету и определяют оптическую плотность так же, как и при снятии градуировочного графика. Так как при значении оптической плотности в интервале 0,3-0,6 получаются более точные результаты, то при других значениях оптической плотности анализ повторяют, соответственно изменив объем вводимой водной вытяжки объекта исследования, добавив в воду так, чтобы общий объем оставался равным 10 куб. см.

Обработка результатов

Расчет содержания сахара

Содержание сахара Х (в %), выраженное в глюкозе, вычисляют

рс

по формуле:

M x V x 100

X = -----------,

рс V x m

где:

М - количество глюкозы, найденное по градуировочному графику,

мг;

V - объем исследуемого раствора, приготовленного из навески,

куб. м;

V - объем раствора, взятый для реакции с гексацианоферратом

калия, куб. см;

m - масса навески объекта исследования, мг.

Для определения содержания общего сахара, выраженного в

сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если

калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной

сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета

содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в

глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих

сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат

измерения принимают среднее арифметическое значение результатов

двух параллельных определений (X ) и выражают целым числом с одним

десятичным знаком.

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных

(r) определений не должны превышать:

r = 0,02 + 0,03 x X ,

но не более 0,5% абсолютного содержания сахара в БАД, где X -

среднее арифметическое значение двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между результатами измерений,

выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:

R = 0,04 + 0,05 x X ,

но не более 1,0% абсолютного значения содержания сахара в

продукте, где Х - среднее значение результатов измерений,

проведенных в двух разных лабораториях.

4.2. Титрометрический метод

Метод основан на титровании избытка гексацианоферрата калия стандартным раствором глюкозы в присутствии метиленового голубого до полного обесцвечивания.

Подготовку к анализу проводят так же, как и в колориметрическом методе.

Проведение анализа

Определение восстанавливающих сахаров

В коническую колбу вместимостью 100-150 куб. см вносят 10 куб. см раствора пробы, 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до кипения за 3 мин., кипятят ровно 3 мин. и вводят 2 капли метиленового голубого, дотитровывают без прекращения кипячения раствором глюкозы до исчезновения синей окраски. Содержание сахаров определяют по формуле, представленной выше.

Холостой опыт проводят в тех же условиях, отбирая вместо 10 куб. см раствора пробы 10 куб. см стандартного раствора глюкозы.

Количество стандартного раствора глюкозы V , пошедшее на

титрование 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III)

калия, суммируется как 10 куб. см глюкозы, взятых на анализ, и

объем глюкозы, который пошел на дотитровывание.

Определение общего сахара

Проводят предварительный гидролиз сахарозы. Затем вносят 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и далее проводят кипячение и титрование как и для определения восстанавливающих сахаров.

Расчет общего сахара

Содержание общего сахара (Х ) в %, выраженное в глюкозе,

ос

вычисляют по формуле:

1,6 (V - V ) V 100

1 2 к

X = --------------------,

ос V M

где:

V - количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на

титрование 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III)

калия в холостом опыте, куб. см;

V - количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на

дотитровывание, куб. см;

1,6 - количество глюкозы в 1 куб. см раствора, мг;

V - вместимость мерной колбы, используемой для приготовления

водной вытяжки, куб. см;

М - масса навески объекта исследования, мг.

Для получения содержания общего сахара, выраженного в

сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если

калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной

сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета

содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в

глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих

сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат

измерения принимают среднее арифметическое значение результатов

двух параллельных определений (Х ) и выражают целым числом с одним

десятичным знаком.

Метрологические характеристики фотометрического

и титрометрического методов

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных

(r) определений не должны превышать:

r = 0,03 + 0,035 x X ,

но не более 0,5% абсолютного содержания сахара в БАД, где X -

среднее арифметическое значение двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между результатами измерений,

выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:

r = 0,04 + 0,05 x X ,

но не более 1,0% абсолютного содержания сахара в БАД, где Х -

среднее значение результатов измерений, проведенных в двух разных

лабораториях.

5. Определение содержания нерастворимых

и растворимых пищевых волокон (ферментативный метод)

Сущность метода заключается в гидролизе и удалении белковых и крахмалистых веществ ферментами, аналогичными ферментам пищеварительного тракта человека из БАД на растительной основе. Метод позволяет определять растворимые (в этиловом спирте) и нерастворимые пищевые волокна, отличающиеся физиологическим действием.

Специфическая аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г второго класса точности по ГОСТ 24104-80.

Шкаф сушильный лабораторный.

Спектрофотометр СФ-26 или другой с аналогичными характеристиками.

Водяная баня любого типа, обеспечивающая температуру нагрева 37 +/- 0,2 град. C, 40 +/- 0,2 град. C, 60 +/- 0,2 град. C, 100 град. C, или термостат.

Прибор для определения pH среды с диапазоном измерений 0-14 с погрешностью измерения +/- 0,1 ед. pH.

Воронки стеклянные с пористым фильтром N 40, N 100 по ГОСТ 25336-82.

Спирт этиловый по ГОСТ 5962-67 или ГОСТ 18300-72 и раствор с массовой долей этилового спирта 700 г/куб. дм.

Панкреатин, фармзавод Лейрас, А/О Хухтамяки, медицинский препарат, активность которого гарантирована в пределах установленных сроков хранения.

Глюкоамилаза очищенная по ТУ 64-13-18-88.

Гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный МБ по ТУ 6-09-10-656-77.

Протеаза N Р-3910, Sigma Chemical Co. (хранится только в холодильнике), или другой протеолитический ферментный препарат аналогичной активности, например пепсин А из слизистой оболочки желудка свиньи, активность которого устанавливают следующим образом. Сначала готовят 2%-ный раствор гемоглобина. Для этого 300 мг гемоглобина растворяют в 12,9 куб. см дистиллированной воды (до полного растворения), приливают 2,1 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 0,3 М.

Определение активности проводят следующим образом: 68,5 мг пепсина растворяют в 10 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 0,03 М; 0,2 куб. см полученного раствора пепсина приливают к 1 куб. см субстрата гемоглобина, предварительно нагретого на водяной бане в течение 5 мин. при температуре 37 град. C. Инкубируют смесь при той же температуре в течение 10 мин. (по секундомеру). Реакцию останавливают путем приливания 5 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 100 г/куб. дм. Смесь выдерживают на водяной бане еще 5 мин. Фильтруют через плотный бумажный фильтр (фильтраты должны быть абсолютно прозрачными). Одновременно с опытными готовят контрольную пробу. Для этого к 1 куб. см субстрата гемоглобина приливают 0,2 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 0,03 М и 5 куб. см 10% раствора трихлоруксусной кислоты, затем инкубируют смесь и фильтруют по предложенной выше схеме. Содержание пепсина определяют спектрофотометрически: оптическую плотность опытных и контрольных фильтратов измеряют против дистиллированной воды при длине волны 280 нм в кюветах 1 см на СФ-26 или другом с подобными характеристиками.

Построение калибровочного графика: готовят ряд растворителей рабочего стандарта пепсина с концентрацией фермента 50, 100, 150, 200, 250 мкг/куб. см. Для этого пользуются следующими данными, приведенными в табл. 9.

Таблица 9

КОЛИЧЕСТВО ФЕРМЕНТОВ

Концентрация фермента, мкг/куб. см	50	100	150	200	250
Количество раствора рабочего стандарта пепсина, куб. см	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5
Количество раствора соляной кислоты с концентрацией 0,03 М, куб. см	9,9	9,8	9,7	9,6	9,5

Во всех растворах, приготовленных по таблице, определяют

содержание пепсина, как описано выше, и строят график, откладывая

на оси ординат величины оптической плотности, а на оси абсцисс -

концентрацию пепсина в мкг. По калибровочному графику определяют

количество активного пепсина в исследуемом препарате. Результаты

измерений выражают в протеиназных единицах (по гемоглобину), ПЕ .

нв

За протеиназную единицу принимают действие такого количества

фермента, которое в данных условиях опыта и измерений за 1 мин.

приводит к увеличению оптической плотности фильтрата на единицу.

Например, по предложенному калибровочному графику 250 мкг пепсина

увеличивают оптическую плотность фильтрата на 0,5 за 10 мин.,

следовательно, 5000 мкг пепсина приводит к увеличению оптической

плотности на единицу за 1 мин. (1 ПЕ = 5000 мкг, или 1 мкг = 5 х

нв

-3

10 ПЕ ).

нв

Подготовка к испытанию

Приготовление фосфатного буферного раствора панкреатина

Готовят 0,05 М фосфатный буфер, pH 6,0 (0,875 г дигидрофосфата и 6,05 г натрия гидрофосфата растворяют в примерно 700 куб. см дистиллированной воды в колбе на 1 куб. дм, затем доводят до метки дистиллированной водой).

Готовят раствор панкреатина с концентрацией панкреатина в 0,05 М фосфатном буфере 5 мг/куб. см.

Приготовление 0,5%-ного водного раствора глюкоамилазы

Растворяют 500 мг глюкоамилазы в 100 куб. см дистиллированной воды.

Подготовка образцов к испытанию

Исследуемый сухой материал измельчают на лабораторной мельнице, просеивают через сито, собирая фракцию с размером частиц не более 1 мм; влажный материал гомогенизируют в гомогенизаторе или микроизмельчителе тканей.

При содержании жира в образцах более 5% проводят обезжиривание. Для этого навеску образца, предназначенную для определения пищевых волокон, заливают трехкратным объемом петролейного эфира (к массе образца), перемешивают в течение 15 мин. периодически и затем отстаивают не менее 1 мин. Прозрачный раствор петролейного эфира декантируют и повторяют экстракцию с тем же количеством эфира 2 раза. Обезжиренный образец высушивают на воздухе.

Ориентировочное содержание крахмала в образце устанавливают по справочным таблицам или другим любым приемлемым методом.

Проведение испытания

0,5 г тонкоизмельченного образца, взвешенного с точностью до 0,0001 г, помещают в химический стакан и суспендируют в 30 куб. см дистиллированной воды при 40 град. C в течение 1,5 ч.

Полученную суспензию после настаивания нагревают на кипящей водяной бане для клейстеризации крахмала 30 мин. при условии, что температура суспензии достигает 90 град. C.

После охлаждения смеси до комнатной температуры устанавливают

pH 1,5 +/- 0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5 М,

-3

добавляют 100 мг пепсина (активность 1 мкг эквивалентна 5 х 10

ПЕ )и ставят на инкубацию при температуре 40 град. C в течение 1-

нв

1,5 ч при периодическом помешивании. При недостаточной активности

пепсина необходимо скорректировать его количество по вышеописанной

методике при проведении ферментолиза.

Смесь охлаждают до комнатной температуры, затем устанавливают pH 6,8 +/- 0,1 раствором гидроксида натрия концентрацией 3 М и приливают 10 куб. см 0,05 молярного буферного раствора панкреатина. Смесь инкубируют в течение 1-1,5 ч при помешивании при температуре 40 град. C. Охлаждают полученную смесь до комнатной температуры, приливают 1,0 куб. см водного раствора глюкоамилазы концентрацией 50 мг/куб. см (рекомендуется использовать 100 единиц активности глюкоамилазы на расщепление 1 г крахмала), устанавливают pH 4,8 +/- 0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5 М и инкубируют при температуре 40 град. C в течение 12 ч.

Полноту гидролиза крахмала определяют йодной пробой. Для этого несколько капель смеси помещают на стекло, добавляют каплю йода в водном растворе йодида калия. О присутствии крахмала в препарате пищевых волокон судят по наличию окрашенных в синий цвет крахмальных зерен. В случае положительной реакции на крахмал проводят обработку смеси дополнительным количеством глюкоамилазы (приливают к смеси 5 куб. см водного раствора глюкоамилазы концентрацией 5 мг/куб. см и инкубируют 1 ч при аналогичных условиях: pH 4,8 +/- 0,1, температура 60 град. C).

Полученную смесь фильтруют через предварительно доведенный до постоянной массы фильтр N 100 или предварительно высушенный и взвешенный обеззоленный фильтр. Нерастворимые пищевые волокна, оставшиеся на фильтре, промывают последовательно 25 куб. см 70%-ного раствора этилового спирта (в 2 приема) и 25 куб. см ацетона (в 2 приема). Фильтрат должен быть прозрачным.

Фильтр помещают в сушильный шкаф при температуре 105 +/- 1 град. C и высушивают до постоянной массы. Фильтрат делят на 2 равные части. В одной части фильтрата осаждают растворимые пищевые волокна 4-кратным количеством 96%-ного этилового спирта, взятого к объему фильтрата. Смесь оставляют для осаждения на 10-12 ч, затем фильтруют через доведенный до постоянной массы стеклянный пористый фильтр N 40 (при необходимости используют слабый вакуум) до получения прозрачного фильтрата. Остаток на фильтре промывают последовательно 25 куб. см 70%-ного раствора этилового спирта и 25 куб. см ацетона, затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 105 +/- 1 град. C до постоянной массы.

В полученных препаратах нерастворимых пищевых волокон определяют содержание непереваренного белка по методу Кьельдаля и золы по ГОСТу 10847-74. Для корректировки данных по содержанию пищевых волокон от возможного осаждения остатка ферментов на растворимые и нерастворимые пищевые волокна параллельно проводят холостой опыт по вышеизложенной схеме, но без навески образца. Холостой опыт важно проводить при использовании новых партий ферментов.

Обработка результатов

Содержание пищевых волокон в БАД определяют по следующим формулам.

Для нерастворимых пищевых волокон:

M - (B + C) - M

1 2

X = ----------------- x 100.

1 M

Для растворимых пищевых волокон:

М - М

3 2

X = ------- x 100 x 2,

2 М

где:

X - содержание нерастворимых пищевых волокон, %;

Х - содержание растворимых пищевых волокон, %;

М - навеска образца, г;

M и М - масса остатка нерастворимых или растворимых пищевых

1 3

волокон после высушивания соответственно, г;

M - масса остатка в холостом опыте после высушивания, г;

В - содержание белка в препарате пищевых волокон, г;

С - содержание золы в препарате пищевых волокон, г.

Общее содержание пищевых волокон (X) вычисляют суммированием

величин X и Х .

1 2

За окончательный результат определения массовой доли нерастворимых или растворимых пищевых волокон принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Вычисление проводят до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.

Метрологические характеристики

Таблица 10

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)

И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

┌─────────────────────────┬──────────────────┬───────────────────┐

│ Вид пищевых волокон │ Rr, % │ RR, % │

├─────────────────────────┼──────────────────┼───────────────────┤

│Растворимые │ 15 │ 20 │

│ │ │ │

│Нерастворимые │ 10 │ 30 │

└─────────────────────────┴──────────────────┴───────────────────┘

Глава 2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТОВ

I. Методы определения витаминов

1. Одновременное определение витаминов А, Е

и каротиноидов в БАД методом высокоэффективной

жидкостной хроматографии

Сущность метода

Метод определения витаминов А, Е и каротиноидов, включая бета-каротин, альфа-каротин, ликопин, криптоксантин, лютеин, зеаксантин, при совместном присутствии в биологически активных добавках (витаминное драже, таблетки, порошки и кристаллические витаминные препараты, их растворы или суспензии в жирах) основан на экстракции микронутриентов органическим растворителем после щелочного омыления субстрата (1) или непосредственного растворения, упаривании полученного экстракта и переводе сухого остатка в другой растворитель, введении экстракта на ВЭЖХ колонку для хроматографического разделения и последующего определения с помощью флуоресцентного и спектрофотометрического детекторов (2). Определение массовой концентрации витаминов и каротиноидов основано на измерении площади (или высоты) пика при соответствующей каждому соединению длине волны детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации жирорастворимых витаминов А, Е и каротиноидов в биологически активных добавках с вероятностью Р = 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +/- 15% во всем диапазоне измерений.

Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

Спектрофотометр, например, "СФ-46" с диапазоном измерения от 190 нм до 700 нм с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1% по ТУ 3-3.1841-84; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.

Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско 870-UV", Япония) с проточной кюветой объемом 8 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более 2% с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра (от 190 до 600 нм).

Спектрофлуориметрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско" 821-FP) с проточной кварцевой кюветой объемом 16 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения интенсивности флуоресценции не более 2%, с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра возбуждения и эмиссии (от 220 до 650 нм).

Насос для ВЭЖХ (типа "Джаско" 880-PU), позволяющий осуществлять расход элюента 0,5-1,0 куб. см/мин. с возможностью работы при давлении не менее 300 кг/кв. см, погрешностью поддержания скорости подачи растворителя 0,6 куб. см/мин. не более 2,5%.

Микрошприц (типа "Гамильтон", США) вместимостью 100 куб. мм для ввода проб в жидкостный хроматограф.

Регистрирующее устройство: интегратор (типа "Шимадзу C-R6A", Япония) или самописец, позволяющий проводить измерение с погрешностью не более 0,5%.

Дозатор автоматический типа ПЛ-01-200.

Колбы мерные 2-100-2, 2-50-2 по ГОСТ 1770-74Е.

Цилиндры вместимостью 100 куб. см по ГОСТ 1770-74Е.

Пробирки П-4-10-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427-75.

Вспомогательные устройства и материалы

Встряхиватель типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.

Центрифуга ОПн-8-У4.2 по ТУ 5.375-4261-76.

Баллон с газообразным азотом квалификации ос.ч. по ГОСТ 9293-74.

Реактивы

Метанол (СН3ОН) для жидкостной хроматографии ос.ч. по ТУ 6-09-2192-85.

Ацетонитрил (CH3CN) для жидкостной хроматографии ос.ч. по ТУ 6-09-14-2167-84.

Метилен хлористый (CH2Cl2), ос.ч. по ТУ 6-09-14-2149-83.

Гексан (C6H6), х.ч. для хроматографии по ТУ 6-00-4521.

Спирт этиловый (C2H5OH) ректификованный технический по ГОСТ 18300-87.

Полностью транс-ретинол (C20H30O) кристаллический, номер по каталогу 124769 фирмы "Мерк" (Германия).

Ретинола ацетат (C22H32O2) по Госфармакопея, X изд., ст. 578.

Ретинола пальмитат (C26H60O2) по ФС 42-2229-84.

DL-альфа-токоферол (C29H50O2), номер по каталогу Т3251 фирмы "Сигма".

альфа-токоферола ацетат (C31H52O2) по ФС 42-2495-87.

Каротиноиды: лютеин (С40Н56O2), ликопин (C40H56), альфа-каротин (C40H56), бета-каротин (C40H56), соответствующие номера Х6250, L9879, С0251, С9750 по каталогу фирмы "Сигма" (США), зексантин (С40Н56О2), бета-криптоксантин (С40Н56О) фирмы "Рош" (Швейцария).

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч.д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Средства измерения должны быть поверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерения, вспомогательного оборудования и реактивов, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

Условия выполнения измерений

Для предотвращения разрушения витаминов и каротиноидов анализ БАД и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление растворов

1. Приготовление раствора гидроокиси калия с массовой долей 50%

50 г гидроокиси калия растворяют в 50 куб. см дистиллированной воды.

2. Подвижная фаза для хроматографии

В мерную колбу на 500 куб. см помещают 250 куб. см ацетонитрила, 25 куб. см дихлорметана и доводят объем смеси до метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения в темноте при 2-8 град. C - 1 год.

Количественное определение витаминов А, Е и бета-каротина

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, для чего проводят определение градуировочного коэффициента.

Для определения градуировочного коэффициента готовят несколько (не менее 4) калибровочных растворов витамина А (полностью транс-ретинол кристаллический; ретинола ацетат по Госфармакопея, X изд., ст. 578; ретинола пальмитат по ФС 42-2229-84) с концентрацией от 0,3 до 3 мкг/куб. см, витамина Е с концентрацией от 2 до 20 мкг/куб. см (DL-альфа-токоферол; альфа-токоферола ацетат по ФС 42-2495-87), бета-каротина с концентрацией от 0,2 до 1,5 мкг/куб. см.

Приготовление градуировочных растворов витамина А

Для приготовления градуировочных растворов из ретинола 0,01 г витамина А количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см этанола. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов ретинола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 куб. см аликвоты раствора витамина А в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 куб. см) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления калибровочных растворов из ацетата ретинола (пальмитата ретинола) 0,01 г витамина А помещают в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, прибавляют 30 куб. см этанола, 3 куб. см 50% раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63-68 град. C. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 куб. см воды в делительную воронку и извлекают 150 куб. см гексана (3 раза по 50 куб. см) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 куб. см и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 1, 2, 3, 4, 5 куб. см раствора в мерные колбы вместимостью 100 куб. см, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в этаноле и доводят объемы до метки тем же растворителем.

Приготовление градуировочных растворов витамина Е

Для приготовления градуировочных растворов из альфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 2 куб. см дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения токоферола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 куб. см аликвоты раствора витамина Е в этаноле (1, 3, 5, 7, 10 куб. см) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления градуировочных растворов из ацетата альфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 0,2 г аскорбиновой кислоты, 30 куб. см этанола, 3 куб. см 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63-68 град. C. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 куб. см воды в делительную воронку и извлекают 150 куб. см гексана (3 раза по 50 куб. см) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 куб. см и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 2, 4, 6, 8, 10 куб. см раствора в мерные колбы вместимостью 100 куб. см, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в 1 куб. см дихлорметана и доводят объемы до метки этанолом.

Приготовление градуировочных растворов каротиноидов

Для приготовления градуировочных растворов бета-каротина 5 мг кристаллического бета-каротина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 1 мл дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов, после чего объем в колбе доводят до метки этанолом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 куб. см аликвоты раствора бета-каротина в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 куб. см) добавляют растворитель до метки.

Градуировочные растворы других каротиноидов (альфа-каротина, ликопина, бета-криптоксантина, лютеина, зеаксантина) готовят аналогично раствору бета-каротина.

Полученные растворы хранят в холодильнике при 2-8 град. C не более 6 месяцев.

Массовую концентрацию витаминов и каротиноидов в градуировочных растворах (С, мкг/куб. см) уточняют спектрофотометрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность (D) слоя градуировочного раствора толщиной 1 см по отношению к растворителю при длине волны, указанной в таблице, и рассчитывают по формуле:

D x 10

С = ---------,

E x 1

1 см

где:

1% -1 -1

Е - коэффициент светопоглощения, куб. см x мкг x см ;

1 см

1 - толщина слоя раствора, см;

10 - коэффициент пересчета.

Таблица 11

УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ

┌──────────────────┬────────┬──────────────────┬───────┬─────────┐

│ Витамин │Раство- │ЛЯМБДА , ] нм │ 1% │Литера- │

│ (каротиноид) │ритель │ макс. │ Е │турный │

│ │ │ │ 1 см │источник │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│Ретинол │ этанол │ 325 │ 1832 │ [2] │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│альфа-токоферол │ этанол │ 292 │ 75,8 │ [2] │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│бета-каротин │ этанол │ 453 │ 2620 │ [3] │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│альфа-каротин │ гексан │ 445 │ 2710 │ [3] │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│Ликопин │ гексан │ 474 │ 3470 │ [3] │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│бета-криптоксантин│ гексан │ 451 │ 2460 │ [3] │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│Зеаксантин │ этанол │ 452 │ 2480 │ [3] │

├──────────────────┼────────┼──────────────────┼───────┼─────────┤

│Лютеин │ этанол │ 447 │ 2560 │ [3] │

└──────────────────┴────────┴──────────────────┴───────┴─────────┘

Градуировка прибора

Градуировка хроматографической системы проводится с целью убедиться, что область определяемых концентраций лежит в пределах линейного участка градуировочного графика, построенного по площадям (высотам) пиков. Она проводится в следующих случаях:

- на этапе освоения методики;

- при смене колонки и/или предколонки;

- при замене стандартного образца;

- в других случаях, когда есть основания полагать, что изменилась эффективность хроматографической системы или чувствительность детектора.

Градуировку хроматографа проводят строя градуировочный график по серии градуировочных растворов. Аналитический сигнал (площадь, кв. мм, или высота пика, мм) фиксируют на интеграторе или самописце, соблюдая условия и продолжительность хроматографического разделения и детектирования (табл. 12).

Таблица 12

УСЛОВИЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ВИТАМИНОВ А, Е И КАРОТИНОИДОВ

┌────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│ Детектор │ Условия детектирования │

│ ├─────────────┬─────────────────────────┬───────────┤

│ │ витамины │ длина волны │продолжи- │

│ │(каротиноиды)│ детектирования │тельность, │

│ │ │ │мин. │

├────────────┼─────────────┼─────────────────────────┼───────────┤

│Флуориметри-│Витамин А │лямбда = 325 нм │ 0-6 │

│ческий │ │ возб. │ │

│ │ │лямбда = 480 нм │ │

│ │ │ эмисс. │ │

│ ├─────────────┼─────────────────────────┼───────────┤

│ │Витамин Е │лямбда = 295 нм │ 6,1-16 │

│ │ │ возб. │ │

│ │ │лямбда = 330 нм │ │

│ │ │ эмисс. │ │

├────────────┼─────────────┼─────────────────────────┼───────────┤

│Спектро- │Каротиноиды │лямбда = 450 нм │ 0-30 │

│фотометри- │ │ │ │

│ческий │ │ │ │

└────────────┴─────────────┴─────────────────────────┴───────────┘

Ориентировочные времена удерживания и последовательность выхода витаминов из хроматографической колонки: ретинол - 4,0-4,5 мин., альфа-токоферол - 10,5-11,0 мин. (флуориметрическое детектирование), бета-каротин > альфа-каротин > ликопин > бета-криптоксантин > лютеин > зеаксантин (спектрофотометрическое детектирование).

Градуировочный график строят в координатах "аналитический

сигнал" - "концентрация витамина в градуировочном растворе,

мкг/куб. см". Для каждого анализируемого раствора проводят два

параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие

между измеренными значениями аналитических сигналов и времен

удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные

участки градуировочного графика должны соответствовать всему

диапазону определяемых концентраций микронутриентов. Коэффициент

градуировочного графика (k ) определяют как среднее

гр

арифметическое значение коэффициентов k , вычисляемых по формуле:

k = --,

i S

где:

С - массовая концентрация микронутриентов в градуировочном

растворе, мкг/куб. см;

S - площадь (высота) аналитического сигнала.

Описание хроматографической системы

Подготовку к работе хроматографической системы, состоящей из последовательно соединенных насоса высокого давления, спектрофотометрического и флуориметрического детекторов и интеграторов, проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.

Используется система для ВЭЖХ следующей конфигурации:

- аналитическая хроматографическая колонка (типа картридж "Элсикарт" фирмы "Элсико", Россия) из нержавеющей стали длиной 150 мм, внутренним диаметром 4 мм, с обращеннофазным сорбентом, например Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим, аналогичным по свойствам, с эффективностью по бета-каротину не ниже 5000 теоретических тарелок;

- предколонка из нержавеющей стали длиной 50 мм, внутренним диаметром 4 мм, с сорбентом типа "Нуклеосил" 100 С18, 7 мкм или аналогичным по свойствам;

- петлевой кран-дозатор (инжектор ввода пробы типа "Реодайн 7125", США) с рабочим объемом петли 50 куб. мм;

- объемная скорость подачи подвижной фазы - 0,6 куб. см/мин.

Подготовка пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед

анализом. Взвешивают не менее 10 таблеток (драже, порошкообразное

содержимое капсул) и определяют вес одной штуки, затем материал

тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке. Точную

навеску анализируемого материала m, г (0,05-0,20 г), помещают в

плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 15 куб. см

воды и нагревают на водяной бане при температуре от 60 град. C до

70 град. C при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют

30 куб. см этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 3 куб.

см 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30

мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре

кипения смеси. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной

температуры, количественно переносят в делительную воронку и

экстрагируют неомыляемые вещества 150 куб. см гексана (3 раза по

50 куб. см) в течение двух минут. Объединенные гексановые

экстракты промывают водой по 50 куб. см до исчезновения щелочной

реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге).

Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу

объемом V (200 куб. см) и доводят объем раствора до метки тем же

растворителем. Аликвоту V (2 куб. см) полученного раствора

переносят в мерную пробирку на 10 куб. см, упаривают в токе

азота, сухой остаток растворяют в точно измеренном объеме V

(1 куб. см) подвижной фазы.

Измерение концентрации витаминов и каротиноидов

в экстракте пробы

Полученный раствор анализируют дважды с помощью хроматографической системы.

Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и спектральные отношения с временами удерживания и спектральными отношениями растворов соответствующих стандартов (табл. 13).

Таблица 13

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ ВИТАМИНОВ И КАРОТИНОИДОВ

┌─────────────┬───────┬───────────────┬────────────────┬─────────┐

│ Витамин │Время │Условия детек- │Условия детек- │Соотноше-│

│ │удержи-│тирования - 1 │тирования - 2 │ния ана- │

│ │вания, │ │ │литичес- │

│ │мин. │ │ │ких сиг- │

│ │ │ │ │налов │

│ │ │ │ │(1:2) │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│Ретинол │4,0-4,5│лямбда = │лямбда = │ 1,2-1,3 │

│ │ │ возб. │ возб. │ │

│ │ │325 нм │340 нм │ │

│ │ │лямбда = │лямбда = │ │

│ │ │ эмисс. │ эмисс. │ │

│ │ │480 нм │95 нм │ │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│альфа- │10,5- │лямбда = │лямбда = │ 1,9-2,0 │

│токоферол │11,0 │ возб. │ возб. │ │

│ │ │295 нм │305 нм │ │

│ │ │лямбда = │лямбда = │ │

│ │ │ эмисс. │ эмисс. │ │

│ │ │330 нм │340 нм │ │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│бета-каротин │ 28-30 │450 нм │470 нм │ 1,1-1,2 │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│альфа-каротин│ 24-26 │450 нм │470 нм │ 1,2-1,3 │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│Ликопин │ 17-18 │450 нм │470 нм │ 0,7-0,8 │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│бета- │ 11-12 │450 нм │480 нм │ 1,0-1,1 │

│криптоксантин│ │ │ │ │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│Лютеин │5,0-5,5│450 нм │480 нм │ 1,2-1,3 │

│ │ │ │ │ │

├─────────────┼───────┼───────────────┼────────────────┼─────────┤

│Зеаксантин │5,6-6,5│450 нм │480 нм │ 1,2-1,3 │

│ │ │ │ │ │

└─────────────┴───────┴───────────────┴────────────────┴─────────┘

Концентрацию витаминов и бета-каротина в растворе пробы (С ,

пр

мкг/куб. см) определяют по формуле:

C = k x S ,

пр гр пр

где:

S - площадь (высота) пика витамина или каротиноида в

пр

растворе пробы;

k - коэффициент градуировочного графика.

гр

За окончательный результат определения концентрации микронутриентов в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Представление результатов

Содержание микронутриентов (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки, рассчитывают по формуле:

0,001 x С x V x V

пр 1 3

Х = ---------------------,

V x m

где С - концентрация витамина или каротиноида в

пр

анализируемом растворе (мкг/куб. см); коэффициент 0,001 учитывает

пересчет содержания витаминов и бета-каротина в мг.

Минимально детектируемое количество ретинола и альфа-токоферола - 0,1 мкг/мл, каротиноидов - 0,05 мкг/мл.

Погрешность измерения вычисляется по формуле:

дельта x X

ДЕЛЬТА = ----------,

100

где дельта - характеристика погрешности измерений (п. 2), %.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации витаминов А, Е и бета-каротина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок.

Производят измерение концентрации витаминов и бета-каротина в

экстракте пробы в соответствии с п. 5.7.(С , мкг/куб. см), а

пр

затем с введенной в него добавкой (С , мкг/куб. см), который также

анализируют (С', мкг/куб. см). Величину добавки выбирают таким

образом, чтобы концентрация микронутриентов в экстракте

увеличилась на 50-150%. Для добавки используют градуировочные

растворы микронутриентов.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если

выполняется условие:

|С' - С - С | <= 0,01 x C x К ,

пр д д д