"Контактная биомикроскопия и микрофлюориметрия кожи в диагностике дерматозов" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

УТВЕРЖДАЮ

Начальник

Главного управления

лечебно-профилактической

помощи Министерства

здравоохранения СССР

В.И.КАЛИНИН

14 октября 1987 г.

КОНТАКТНАЯ БИОМИКРОСКОПИЯ И МИКРОФЛЮОРИМЕТРИЯ КОЖИ

В ДИАГНОСТИКЕ ДЕРМАТОЗОВ

В Методических рекомендациях впервые представлены сведения по методике ранней прижизненной диагностики, изучению микроструктуры и функции кожи при помощи контактной биомикроскопии и микрофлюориметрии эпидермиса и дермы через "кожное окно".

Кратко изложено описание типов контактных микроскопов и принципов работы с ними, применительно к дерматологической практике.

Применение контактной биомикроскопии позволяет производить раннюю диагностику дерматозов при массовых медицинских осмотрах. Сочетанное применение контактной микрофлюориметрии с прижизненной микроскопией кожи позволяет прогнозировать течение аллергических дерматозов по степени нарушения функций кератиноцитов, макрофагов, клеток Лангерганса, биомембран кожи.

Рассчитаны они на врачей дерматовенерологов, клинико-диагностических лабораторий кожно-венерологических диспансеров, дерматологов-профпатологов медико-санитарных частей промышленных предприятий.

1. Прижизненные методы микроскопии

Морфологическое исследование живых тканей и клеток, сохраняющих связь с организмом при помощи прижизненной микроскопии, развивалось в двух направлениях: микроскопии тканей в камерах и контактной микроскопии. Название контактных микроскопов они получили в связи с тем, что при их использовании приходится подводить фронтальную линзу объектива вплотную к изучаемому объекту. Метод, основанный на применении таких приборов, получил название - контактной микроскопии, а проведение прижизненных исследований - контактной биомикроскопии.

Применение контактных микроскопов создает новые перспективы исследования в биологии, медицине, т.к. дает возможность изучать не только тонкую клеточную структуру и ее изменение в живых клетках и тканях, но и позволяет вести наблюдения за физиологическими функциями живых органов, протекающими в них физиологическими, патологическими и транспортными процессами. Контактная биомикроскопия широко используется для изучения прижизненной структуры ткани, особенностей клеточного инфильтрата, нарушений микроциркуляции и транспортных процессов на мембранах при развитии патологических процессов во внутренних органах.

Интерес к контактной биомикроскопии в дерматологии обусловлен стремлением расширить возможности ранней диагностики и осуществления контроля за лечением при ряде дерматозов. Прижизненная микроскопия кожи с помощью операционного микроскопа позволяет выявить детали морфологических элементов, однако предельное 32-кратное увеличение ограничивает его возможности, в то время как контактная биомикроскопия применяется при изучении патогенеза и диагностики некоторых дерматозов и характера воздействия химических веществ на кожу в эксперименте на морских свинках.

2. Контактные микроскопы

Два варианта контактных объективов - люминесцентный и эпивариант были разработаны советскими учеными. Основной особенностью контактных люминесцентных объективов является наличие специальной фронтальной линзы. Объектив рассчитывается так, что его фокальная плоскость находится в толще органа.

Нашей промышленностью выпускаются следующие приборы для контактной микроскопии: ОЛК-1, ОЛК-2, микроскопы МЛ-1, МЛК-1, ЛЮМАМ-КТ, ЛЮМАМ-1, ЛЮМАМ-К-1Ф и другие. Эти приборы, выпускаемые ЛОМО, дают возможность проводить исследования кожи в достаточно широком диапазоне режимов.

Для дерматологических исследований наиболее рационально использование комплекса готовых блоков: ОИ-18, ОИ-30, ФМН-11А, с объективами ЛК 10х0,40, ЛК 60х1,15. Монтирование указанных блоков на штатив позволяет обследовать любой участок кожи больного с увеличением от 50х до 600х (рис. 1, 2 - здесь и далее рисунки не приводятся).

Данная установка разбирается, ее легко транспортировать и, следовательно, можно использовать при проведении массовых медицинских осмотров. При проведении контактной биомикроскопии кожи в любом режиме наиболее оптимальным прибором является микроскоп ЛЮМАМ И-3 (рис. 3, 4), который имеет в комплексе контактные объективы ЛК 10х0,40, ЛК 25х0,75, ЛК 43х1,0, ЛК 60х1,15, а также контактные эпиобъективы 10х0,20, 10х0,30, 20х0,40, 20х0,60, 20х0,80. Применение имеющихся в его комплексе устройств ОЛК-2, ФМН-11 позволяет проводить контактную биомикроскопию и микрофотографирование кожи. Использование микрофлюориметра ФМЭЛ-1А с зондами 0,1 и 0,5 позволяет проводить прижизненные исследования функционального состояния клеток кожи, транспортных процессов, микроциркуляции тканевой жидкости и крови.

3. Методы контактной биомикроскопии (КБ) кожи

3.1. Флюоресцентная микроскопия. При биомикроскопии кожи

необходимо применять освещение в падающем свете. Собственная

флюоресценция кожи выражена слабо, поэтому необходимо

подкрашивание исследуемого участка флюорохромами: флюоресцеином,

уранином, акридиновым оранжевым, примулином, риванолом,

хлортетрациклином, родамином. Как правило используются растворы в

-4 -5

концентрациях 1 х 10 М, 1 х 10 М, не оказывающих токсического

действия на живые ткани и клетки. При исследовании морфологии кожи

оптимальным флюорохромом является акридиновый оранжевый (АО)

дифференцированно окрашивающий ядра и цитоплазму кератиноцитов, а

также тучные и плазматические клетки, лимфоциты, фибробласты и

другие клетки.

При флюоресцентной микроскопии после окраски АО используются

фильтры возбуждающие УФС-6, ФС-1, запирающие светофильтры ЖС-18 и

ЖС-19, теплозащитный фильтр СЗС. При проведении микрофлюориметрии

клеток кожи с помощью насадки ФМЭЛ-1А можно использовать

интерференционные фильтры (1 - 18) при зонде 0,1 и 0,5.

3.2. Флюоресцентно-абсорбционный метод. При этом методе

применяется комбинированная окраска кожи флюорохромом и обычным

-4

красителем, например, флюоресцеином (5 х 10 М) и 1% раствором

метиленового синего или нейтрального красного.

3.3. Микроскопия в поляризованном свете. При наблюдении в поляризованном свете освещение участка кожи производится белым светом без светофильтров. Для устранения рефлексов оптики объектива используют поляризатор, вместо запирающих светофильтров - анализатор, при нейтральной светоделительной пластинке.

3.4. Темнопольная микроскопия. При этом режиме микроскопии кожу окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, 0,5% раствором толуидинового синего. Микроскопия проводится с контактными эпиобъективами 10х0,20, 20х0,60, 20х0,80. Они предназначены для работы в области спектров с длиной волны от 272 нм до 650 нм.

4. Подготовка кожи для контактной биомикроскопии (КБ)

При КБ поверхности кожи окраску производят не во всех случаях. При определении структуры поверхности рогового слоя, включений и инородных тел на поверхности кожи (пыль, элементы стекловолокна, частицы металла, красителей), возможна КБ без предварительной обработки кожи красителем. Собственная флюоресценция поверхности рогового слоя позволяет определить особенность его поверхности, треугольные и ромбовидные поля, включения. При необходимости определения отдельных чешуек рогового слоя, выявления феномена паракератоза, микроабсцессов, поверхность рогового слоя обрабатывается АО в концентрации 1:5000.

При КБ более глубоких слоев скарифицируют кожу, при которой снимается роговой (и блестящий) слой. Полученная экскориация обрабатывается красителем, в нее вводится фронтальная линза контактного объектива и проводится КБ по одному из описанных режимов.

При скарификации кожи на поверхности экскориации остается часть клеточного детрита и поврежденных клеток, что затрудняет микроскопию. Для устранения этой помехи нами предложена обработка экскориации 0,3% раствором трипсина в течение 15-20 минут, с последующим промыванием изотоническим раствором хлористого натрия. Известно, что трипсин в данной концентрации разрушает поврежденные клеточные элементы, но не оказывает патологического действия на живые клетки.

5. Контактная биомикроскопия в диагностике дерматозов

у рабочих промышленных предприятий

5.1. Пути применения КБ при профессиональной патологии. Данный метод позволяет не только изучить детали морфологических элементов, но и выяснить особенности их гистологической структуры, проследить в динамике эволюцию патологического процесса в коже. КБ у рабочих промышленных предприятий показана в качестве диагностического метода, в том числе при проведении массовых медицинских осмотров, а также при проведении контроля излеченности дерматозов. Кроме того, данный метод позволяет выявить загрязнение кожи производственными факторами. Сочетание КБ с микроспектрофлюориметрией (прибор ФМЭЛ-1А) дает возможность оценивать функциональное состояние мембран кожи и транспортных процессов на них.

5.2. КБ поверхности рогового слоя у рабочих. При КБ поверхности кожи у рабочих промышленных предприятий обнаруживается среди чешуек рогового слоя частицы металла, текстильной пыли, стекловолокна, абразивной пыли, промышленных пигментов, угля, которые могут быть причиной дерматозов. Проведение КБ в сочетании с обработкой кожи реактивами, гистохимически выявляющими металлы, дает возможность определять их на поверхности рогового слоя и в более глубоких слоях кожи. Определение загрязнения металлами кожи может свидетельствовать о несостоятельных индивидуальных средствах защиты кожи, а также методов ее очистки. При гистохимическом выявлении металлов в качестве реактива, выявляющего никель и хром, применяется раствор рубеано-водородной кислоты, дающей в первом случае синее, во втором - желтое окрашивание. Соединения хрома выявляют насыщенным спиртовым раствором дифенилкарбамида в 70° этиловом спирте, дающем фиолетовое окрашивание. Соединения платины и палладия определяют водным раствором паранитрозодимеланилина, дающего красно-оранжевое и вишнево-красное окрашивание рогового слоя. Нужно отметить, что КБ после обработки соответствующим раствором, как правило, выявляет металл на участках кожи, где визуально окрашивание кожи не отмечалось.

Возможно применение КБ при определении соединений металлов на коже с помощью раствора 8-оксихинолина. Обработка кожи насыщенным водным раствором 8-оксихинолина вызывает реакцию его с металлами. При этом образуются комплексные соединения, флюоресцирующие при освещении их лучами ультрафиолетовой части спектра (фильтр УФС-6). Таким методом на коже определяются соединения алюминия, бериллия, галлия, индия, кадмия, лития, магния, олова, скандия, цинка, циркония. Открываемый минимум в мкг/мл металла и предельные его концентрации, определяемые флюоресцентным методом, представлены в табл. 1.

Таблица 1

ОТКРЫВАЕМЫЙ МИНИМУМ И ПРЕДЕЛЬНЫЕ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕТАЛЛОВ,

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ИХ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 8-ОКСИХИНОЛИНА

┌───────────┬────────────────────────────┬───────────────────────┐

│ Металл │Открываемый минимум в мкг/мл│Предельная концентрация│

├───────────┼────────────────────────────┼───────────────────────┤

│ │ │ 6 │

│Магний │0,025 │1:2 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 7 │

│Бериллий │0,012 │1:8 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 5 │

│Цинк │0,1 │1:5 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 5 │

│Кадмий │0,1 │1:5 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 5 │

│Скандий │1,2 │1:8 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 7 │

│Алюминий │0,004 │1:2 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 4 │

│Галлий │1,0 │1:1 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 5 │

│Индий │0,05 │1:5 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 5 │

│Цирконий │2,5 │1:2 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 6 │

│Олово │3,0 │1:1 х 10 │

│ │ │ │

│ │ │ 4 │

│Литий │1,0 │1:5 х 10 │

└───────────┴────────────────────────────┴───────────────────────┘

Эти данные свидетельствуют о высокой чувствительности флюоресцентного метода определения металлов на коже с помощью 8-оксихинолина. Использование микрофлюориметра ФМЭЛ-1А в комбинации с аппаратом Щ-4300 позволяет определить концентрацию металла на поверхности и динамику ее изменения в глубоких слоях кожи, путем количественного определения степени флюоресценции.

5.3. КБ при диагностике дерматитов. КБ кожи рабочих промышленных предприятий может быть применена при диагностике дерматитов. При контактных дерматитах, вызванных облигатными раздражителями (кислоты, щелочи), отмечается большое количество клеточного детрита. Роговой слой теряет структуру, не определяются отдельные роговые чешуйки, а также треугольные и ромбовидные поля. Среди клеточного детрита просматриваются участки с разрушенными кератиноцитами. Наблюдается инфильтрация эпидермиса и дермы преимущественно сегментоядерными лейкоцитами. При контактном аллергическом дерматите обнаруживается усиление десквамации в роговом слое при сохранении, как правило, его структуры и преимущественно лимфоцитарная инфильтрация эпидермиса и дермы. Изменения кератиноцитов на эрозивных участках не достигают большой степени и представляют неравномерным свечением ядер, увеличением числа клеток с желто-оранжевым свечением цитоплазмы.

При проведении кожных проб существует возможность получения ложноположительных результатов при использовании химических веществ в концентрациях, оказывающих первично-раздражающее действие.

Применение КБ после экскориации кожи на месте положительной пробы подтверждает наличие гиперчувствительности при обнаружении типичной лимфоидной инфильтрации дермы. Лучшим методом окраски при этом является обработка экскориации АО в концентрации 1:10000 на изотоническом растворе хлористого натрия.

5.4. КБ при выявлении ранних признаков профессиональных дерматозов. При КБ кожи кистей рабочих с эпидермитами, имеющих контакт с соединениями хрома, никеля, бериллия, выявляются больные, у которых поражение рогового слоя, характерное для эпидермита, сочетается с гистологическими изменениями, свидетельствующими о наличии контактной гиперчувствительности (лимфоидная инфильтрация эпидермиса и дермы, уменьшением количества клеток Лангерганса в эпидермисе и повышение их металлофильности, повышение металлофильности макрофагов дермы, увеличение количества лизосом в кератиноцитах, нарушения гемомикроциркуляции и микроциркуляции тканевой жидкости). При истинных эпидермитах КБ показывает лишь нарушение вторичной структуры рогового слоя эпидермиса при отсутствии патологических изменений в других слоях эпидермиса и дермы.

Сочетание изучения лейкоцитарных иммунологических реакций с промышленными аллергенами и КБ 3-4 участков кожи кистей и предплечий позволяют выявить профессиональные аллергические дерматозы на ранних стадиях формирования. Это влечет за собой оптимизацию диспансеризации и реабилитации рабочих промышленных предприятий. Выявление рабочих с ранними проявлениями профессиональных дерматозов позволяет в преморбидном периоде начинать иммунокорригирующую терапию, лазерную рефлексотерапию, применение адаптогенов.

5.5. КБ при диагностике псориаза. При КБ после окрашивания АО кожи хорошо выявляется феномен паракератоза, при этом на поверхности элементов обнаруживаются клетки рогового слоя с тускло-зеленой цитоплазмой и интенсивно-светящимся изумрудным ядром. По выраженности паракератоза (единичные корнеоциты с ядрами, ограниченные или обширные участки) можно судить о степени нарушения созревания клеток эпидермиса, что в определенной степени характеризовало активность псориатического процесса. Среди клеток рогового слоя встречаются сегментоядерные лейкоциты с зеленым свечением ядра и красным свечением цитоплазмы, нередко образовавшие скопления (псевдоабсцессы Мунро).

При лечении больных псориазом метотрексатом проведение КБ в динамике позволяет определить оптимальное время отмены препарата.

Исчезновение ядер в корнеоцитах служит показанием для отмены цитостатиков. После I курса лечения метотрексатом ядра клеток рогового слоя приобретают дегенеративные формы (уменьшение объема, фрагментация, ядра палочковидные или в виде зернистости), что, как правило, совпадает с началом клинического регресса.

5.6. КБ при диагностике пузырных дерматозов. При обследовании рабочих промышленных предприятий нередко возникает необходимость проведения дифференциального диагноза при наличии пузырных элементов на коже. КБ помогает выяснить характер расположения пузырей в коже (субкорнеальный, интраэпидермальный, субэпидермальный). В некоторых случаях при отсутствии выраженного вторичного инфицирования, КБ позволяет выявить на поверхности эрозий акантолитические клетки или эозинофилы, лимфоциты, сегментоядерные лейкоциты, плазматические клетки. Акантолитические клетки имеют крупное ядро и интенсивно светящуюся красную цитоплазму. При касании фронтальной линзы объектива дна эрозий отмечается легкая дезинтеграция клеток эпидермиса. При КБ герпетических эрозий хорошо различаются многоядерные крупные клетки с интенсивно окрашенной АО красной цитоплазмой.

5.7. КБ при диагностике чесотки. Необходимость нахождения чесоточного клеща важна при атипичной и осложненной чесотке, особенно при поражении кожи у детей, когда возникают диагностические трудности. Опыт показал, что КБ является более рациональным и простым методом обнаружения чесоточного клеща, чем извлечение его иглой из чесоточного хода или срезание бритвой рогового слоя с последующей микроскопией. При КБ кожи на участке высыпаний при чесотке хорошо определяются на поверхности рогового слоя извитые "траншееподобные" поверхностные ходы, в которых находятся клещи с хорошо различимой структурой, чаще их отдельные фрагменты, членики. В поверхностных "траншееподобных" ходах зачастую видны фекалии, яйца клещей, клеточный дейтрит.

5.8. КБ при диагностике дерматомикозов. Преимущество КБ состоит в том, что она позволяет обследовать большие площади кожи, требует затраты малого количества времени (1-3 минуты) на одно исследование, что ценно при массовых медицинских осмотрах рабочих промышленных предприятий. При КБ очагов дерматомикозов поверхность кожи (или экскориации) обрабатывают 3-5 минут растворами акридинового оранжевого (АО) или желтого (АЖ) в концентрации 1:5000 в разведении на изотоническом растворе хлористого натрия. Гашение собственной флюоресценции ткани достигается обработкой ткани 2% растворами нейтрального красного, метиленового синего, прочного черного (флюоресцентно-абсорбционный метод). Выявление дрожжеподобных грибов проводится без окрашивания по методу микроскопии в поляризованном свете.

При прижизненной микроскопии у больных разноцветным лишаем отмечается разрыхление рогового слоя, исчезновение упорядоченной структуры в виде ромбовидных и треугольных полей. При окраске АО, АЖ определяются нити мицелия и споры с желто-оранжевой флюоресценцией. При микозах стоп в роговом слое определяются (часто на фоне очагов паракератоза) споры и нити гриба, имевшие желто-оранжевую флюоресценцию. При дисгидротической форме микоза на эрозированных участках мицелий часто имеют желто-оранжевый спектр свечения. При КБ эрозивных участков в эпидермисе и дерме выявляются: клеточный детрит, лимфоидные клетки, ПМЯ-лейкоциты, единичные плазматические клетки, макрофаги. При онихомикозах КБ позволяет уточнить состояние ногтевой пластинки, окружающих ее мягких тканей, капилляров, ногтевого ложа. Мицелий гриба определяют в глубоких слоях ногтевой пластинки. Гифы гриба с желто-оранжевой флюоресценцией различной толщины располагаются в ногтевой пластинке в разных направлениях. При КБ очагов микроспории в эпидермисе отмечаются элементы гриба в виде фрагментов тонкого светящегося мицелия. Вокруг основания волос определяются мелкие споры с изумрудным свечением.

5.9. Применение КБ при генодерматозах. При изучении наследственных дерматозов и дермадромов большое значение придается подсчету потовых пор на гребешках, анализу деталей гребней (лиснуций), их толщине, гребневой ширине, анализу сгибательных складок, которые часто изменены при врожденных аномалиях ороговения. КБ при объективе 10х0,40, 25х0,75 и окулярах 5х, 7х позволяет с большой точностью описывать особенности микротопографии: наличие дисплазии гребней, их разрывы и деформации узоров капиллярных линий, нарушения линейной ориентации. При обработке кожи флюорохромом (АО - 1:5000) на поверхности гребней обнаруживаются отверстия выводных протоков потовых желез, которые четко выделяются из-за отсутствия флюоресценции. КБ позволяет не только изучить количество потовых желез на различных участках кожи, но и установить особенности их функций.

5.10. Применение КБ при диагностике поражений слизистой полости рта и красной каймы губ. Поражения слизистой полости рта (особенно изолированные) нередко представляют диагностические трудности, особенно при отсутствии типичных высыпаний на коже. Исследование биоптатов не всегда разрешает диагностические трудности из-за большого количества артефактов, обусловленных малым размером фрагментов тканевого материала.

Применение контактной биомикроскопии позволяет выявить участки патологически измененной слизистой, уточнить характер морфологических элементов, обнаружить рубцы, очаги лейкокератоза, уточнить характер эрозий, особенности клеточного инфильтрата.

6. Прижизненная микрофлюориметрия в диагностике дерматозов

6.1. Диагностические возможности прижизненного люминесцентного анализа. В последние годы люминесцентный анализ стал широко использоваться в диагностике заболеваний. Это обусловлено его высокой информативностью, возможностью проводить прижизненное исследование морфофункциональных изменений органов и систем в норме и патологии.

Важной предпосылкой использования люминесцентного анализа живых тканей для количественной оценки их дыхания служит неодинаковое свечение пиридиннуклеотидов и флавопротеидов в восстановительной и окисленной формах. Выраженной флюоресценцией обладает восстановительная форма НАД.Н и окисленная форма флавопротеидов (ФП), причем максимальное свечение НАД.Н приходится на порядок 455-460 нм (синяя область спектра), а ФП - на 530 нм (желто-зеленая область спектра).

Усиление клеточного дыхания сопровождается изменением соотношения компонентов дыхательной цепи в сторону преобладания окисленных форм. Поэтому, при усилении дыхания клетки в ней нарастает желто-зеленая и затухает синяя флюоресценция. При этом флюоресцентный анализ окислительно-восстановительных процессов в живых клетках выявляет ранние признаки развития патологических изменений.

Кроме изучения собственной флюоресценции живых тканей в диагностике нашли применение флюоресцентные зонды. Флюоресцентные зонды не нарушают нормального хода биохимических процессов в органах. В биологии и медицине нашли применение зонды на ДНК и РНК - акридиновый оранжевый (АО), на липиды - 3,4-бензпирен, на кальций мембран митохондрий - хлортетрациклин (ХТЦ). В последнее время для целей диагностики используется изучение динамики распространения флюоресцеина в тканях, сосудах и органах человека.

6.2. Люминесцентный анализ в дерматологии. Люминесцентный анализ основывается на свойстве кожи менять характер люминесценции при патологических процессах (псориаз, красная волчанка, сифилис). Вместе с тем, метод макроскопического исследования люминесценции с визуальной оценкой изменений малоинформативен, носит ориентировочный характер.

В диагностических целях можно использовать контактную биомикроскопию в сочетании с микрофлюориметрией кожи. При этом используется микроскоп ЛЮМАМ И-3 с микрофлюориметром ФМЭЛ-1А и насадкой ОЛК-2. Для количественной оценки флюоресценции применяется прибор Щ-4300. Режим микроскопии и микрофлюориметрии зависит от подбора фильтров. При изучении собственной флюоресценции кожи (НАД.Н) применяются фильтры УФС 6(4) и ЖЭС (1). Для изучения флавопротеидов (ФП) - ФС 1(4) и ЗС 8(4). При изучении тетрациклиновой флюоресценции: СС 15(4), ЖС 18(2), ЖЭС 19(0,5). При микрофлюориметрии клеток Лангерганса: УФС 6 и ЖС 18, ЖС 19. Режимы микроскопии представлены в табл. 2.

Таблица 2

РЕЖИМЫ БИОМИКРОСКОПИИ КОЖИ

Оптический режим		Объект исследования
Оптический режим		капилляры кожи	НАД.Н керати- ноцитов	ФП керати- ноцитов	Клетки Лангер- ганса	ХТЦ
Флюо- рес- центная микро- скопия	Фильтры возбуж- дающие		УФС 6(4)	ФС 1(4)	УФС 6(3)	СС 15(4)
Флюо- рес- центная микро- скопия	Фильтры запи- рающие		СС 15(3) ЖС 3(1)	ЗС 8(4)	ЖС 18(2) ЖС 19(0,5)	ЖС 18(2) ЖС 19(0,5)
Микроскопия в поляризованном свете		Поляриза- тор, ана- лизатор, объективы ЛК 10х 0,40 ЛК 25х 0,75

6.3. Микрофлюориметрия в диагностике дерматозов. При контактном аллергическом дерматите уже на ранних стадиях его формирования выявляется снижение в эпидермисе окисленной формы никотинамидаденилдинуклеотида и увеличение НАД.Н, а также уменьшение окисленной формы флавопротеидов. При этом отмечается увеличение показателей флюоресценции НАД.Н (лямбда 460 - 470 нм) с 1,79 +/- 0,06 до 2,96 +/- 0,09 и уменьшение показателя ФП с 2,12 +/- 0,06 до 1,02 +/- 0,04 (лямбда 520-530 нм). У больных экземой показатель отношения ФП/НАД.Н (отношение интенсивности флюоресценции ФП и НАД.Н в максимумах спектральных кривых их свечения) на 27,2% ниже, чем у больных контактным аллергическим дерматитом.

У больных контактным аллергическим дерматитом и экземой показатель ФП/НАД.Н имеет прогностическое значение, его увеличение свидетельствует о нормализации клеточного дыхания в кератиноцитах, уменьшении в митохондриях окисленных форм НАД и увеличении окисленных форм ФП, т.е. об усилении репаративных процессов в коже. Эта стадия характеризуется уменьшением флюоресценции эпидермиса с зондом ХТЦ.

Исследование вторичной флюоресценции кожи путем сочетания контактной биомикроскопии и микрофлюориметрии после обработки кожи АО показывает снижение флюоресценции ядер кератиноцитов у больных аллергическим дерматитом на 35,6 +/- 2,7%, и увеличение флюоресценции цитоплазмы на 17,2 +/- 3,8%. Одновременно интенсивность флюоресценции макрофагов дермы повышается на 26,3 +/- 2,8%. Вторичная флюоресценция кератиноцитов и макрофагов дермы имеет прогностическое значение; по мере регресса клинических проявлений отмечаются увеличение флюоресценции кератиноцитов, снижение свечения макрофагов, параллельно увеличение флюоресценции фибробластов дермы на 22,7%.

Клетки Лангерганса играют важную роль в развитии замедленной гиперчувствительности кожи. Для прижизненного определения их количества и активности используется флюоресцентный метод, основанный на взаимодействии поглощенного клетками металла (азотнокислого серебра) с 8-оксихинолином. Образующиеся комплексы выявляются путем контактной микроскопии в ультрафиолетовых лучах (фильтры УФС 6, ЖЗ 18, ЖС 19). Функциональная активность клеток определяется микрофлюориметрией (ФМЭЛ-1А при зонде 0,1).

При контактном аллергическом дерматите установлено уменьшение количества клеток Лангерганса на месте клинических проявлений дерматоза с 639,2 +/- 25,7 (в норме) до 378,3 +/- 21,6 на 1 кв. мм. При этом, интенсивность флюоресценции клеток Лангерганса (обусловленное абсорбцией металла) увеличивается до 2,13 +/- 0,09 (у здоровых лиц 1,08 +/- 0,03, р < 0,001).

6.4. Контактная биомикроскопия и микрофлюориметрия кожи в комплексной оценке микроциркуляторных нарушений кожи у больных дерматозами. Тканевая микроциркуляция в коже - это сложный процесс, включающий микрогемоциркуляцию (МГЦ), реализующую транскапиллярный обмен, а также периваскулярный транспорт, и микроциркуляцию тканевой жидкости, осуществляющей внесосудистый перенос вещества между эпидермисом и дермой.

Контактная биомикроскопия и микрофлюориметрия позволяют не только оценить состояние капилляров кожи на любом участке кожи, но, используя в качестве зонда флюоресцеин, судить о микроциркуляции тканевой жидкости.

Для оценки состояния МГЦ используется контактная биомикроскопия в поляризованном свете (микроскоп на основе блоков ОИ-30, ОИ-21, ОЛК-2, рис. 4). Вместо фильтров в оптическую схему включают поляризатор, анализатор, нейтральную светоделительную пластинку, контактные объективы ЛК 10х0,40, ЛК 25 х 0,75, микрометр МОВ-1.

Состояние микроциркуляции тканевой жидкости определяется путем

-4

нанесения флюоресцеина в концентрации 5 х 10 М на экскориацию

0,3х0,3 см в очаге поражения. В экскориацию вводится контактный

объектив и проводится прижизненная микрофлюориметрия с помощью

насадки МФЭЛ 1А (при зонде 0,5) и прибора Щ-4300 (рис. 3).

У лиц контрольной группы сосочковые капилляры определяются в виде петель с утолщением отводящего отдела. Диаметр артериальной ветви составляет в среднем 9,4 +/- 0,6 мкм, переходной - 14,4 +/- 2,7 мкм, венозной - 17,2 +/- 2,4 мкм. Сосуды ориентируются перпендикулярно поверхности кожи. Контуры капилляров четко просматриваются на глубине 15-20 мкм. Количество их в поле зрения при объективе ЛК 10х0,40 составляет 12-15. В капиллярах отмечается кровоток. На глубине 20-30 мкм отмечается сетевидное сплетение (поверхностное венулярное сплетение). На слизистых, в складках кожи иногда просматриваются на глубине 40-45 мкм расположенные линейно сосуды, среди которых можно дифференцировать артериолы и венулы. Существуют некоторые топографические особенности сосудов. Наибольшая плотность сосочковых капилляров в 1 кв. мм наблюдается в коже верхних конечностей (кисти - 52,6, предплечья - 47,6); наименьшая - в коже бедер - 22,4; голеней - 20,2, коже лица - 17,4.

У больных экземой отмечается в период обострения сужение артериальной и расширение венозной ветви капилляров, резкая извилистость капилляров, снижение числа функционирующих капилляров с 27,9 +/- 3,7 на 1 кв. мм до 20,9 +/- 1,9 на 1 кв. мм. У больных с распространенными формами экземы, экзематозной эритродермией выявляются внутрисосудистые изменения.

Флюоресцентная проба (ФП) позволяет изучать проницаемость

капилляров в направлении из ткани в сосуды, при этом определяется

лишь конечный результат - время эвакуации флюоресцеина из кожи.

Дополнив ФП КБ, возможно прижизненно изучать микроциркуляцию

тканевой жидкости и происходящие при этом транспортные процессы.

Применение КБ дает возможность при увеличении в 420 раз определять

динамику эвакуации флюорохрома из эпидермиса в дерму и из дермы -

-4

в капилляры. Флюоресцеин в концентрации 5 х 10 М наносят на

экскориацию 3х3 мм (у больных в пределах очагов поражения).

Через 10 минут фронтальную линзу объектива ЛК 60х1,15

(окуляр 7х) водят в экскориацию. Освещение проводится в падающем

свете через опак-иллюминатор осветителя ОИ-30. Источником

освещения служит лампа СВД 120 А (ОИ-18), фильтры ФС-1, ЖС-18,

ЖС-19, СЭС. Интенсивность флюоресценции определяется визуально

через 15, 30 минут; 1 и 2 часа, а также измеряется посредством

насадки ФМЭЛ-1 при зонде 0,5.

Контактная биомикроскопия кожи показывает, что у клинически здоровых лиц в течение 15 минут после нанесения флюоресцеина отмечается интенсивная флюоресценция всего микроскопируемого поля, кроме участков дермы и ее сосудов. Через 15 минут в дерме вокруг сосудов концентрация флюоресцеина уменьшается на 69 +/- 7%. Через 60 минут концентрация флюоресцеина падает с 80 +/- 10 до 24 +/- 3% (р < 0,001). В этот период флюоресцеин с тканевой жидкостью эвакуируется из эпидермиса в сосочковый слой дермы, где вокруг сосудов возникают участки повышенной его концентрации.

Концентрация флюоресцеина в эпидермисе продолжает падать и через 2 часа составляет 10 +/- 3%, через 3 часа в эпидермисе остается фоновое свечение, в то время как в дерме интенсивность свечения составляет 22 +/- 4%. Таким образом, флюоресцеиновая проба, дополненная КБ, позволяет дифференцированно оценивать 2 процесса: 1) динамику эвакуации флюоресцеина с тканевой жидкостью из эпидермиса в дерму; 2) динамику эвакуации флюоресцеина из сосочкового слоя дермы в сосуды.

У больных контактным аллергическим дерматитом отмечается замедление эвакуации флюоресцеина из эпидермиса, так на 60 минуте концентрация флюоресцеина составляет 47 +/- 7% (у здоровых лиц 24 + 3%, р < 0,001). Вместе с тем, эвакуация флюоресцеина из дермы ускоряется. Возможно, что ускорение эвакуации химического вещества из дермы в сосуды носит адаптивный характер и отражает приспособительный характер острого аллергического воспаления, направленного на элиминацию аллергена.

У больных экземой замедляется эвакуация флюоресцеина из эпидермиса и из сосочкового слоя дермы. Ко 2 часу концентрация флюоресцеина в эпидермисе составляет 52 +/- 6% (в контрольной группе 10 +/- 3%, р < 0,01), в дерме - 64 +/- 10% (в контрольной группе 35 +/- 5%, р < 0,001). Данная динамика эвакуации флюоресцеина отражает срыв адаптивных реакций при экземе и глубокое нарушение транспортных тканевых и сосудистых реакций.

У 1/3 обследованных рабочих со скрытой сенсибилизацией отмечается замедление эвакуации флюоресцеина из эпидермиса, что сочетается с лимфоидной инфильтрацией эпидермиса и дермы, изменением собственной флюоресценции эпидермиса (увеличения НАД.Н, снижение ФП), снижением вторичной флюоресценции кератиноцитов и возрастание - макрофагов дермы, повышением активности клеток Лангерганса. Данный комплекс морфофункциональных изменений клеток кожи при контактной биомикроскопии и прижизненном люминесцентном анализе позволяет в сочетании с иммунологическими лейкоцитарными реакциями выявлять группу больных с начальными проявлениями аллергических дерматозов. Выявление ранних патологических изменений кожи, особенно в условиях промышленных предприятий, способствует оптимизации проводимых диспансеризации, лечения и реабилитации рабочих.

Таким образом, применение контактной биомикроскопии и прижизненной микрофлюориметрии кожи позволяет диагностировать дерматозы на ранних стадиях, в т.ч. при массовых медицинских осмотрах. Исследование транспортных систем кожи, а также изменения первичной и вторичной флюоресценции клеток кожи дают дополнительную информацию, имеющую диагностическое и прогностическое значение при заболеваниях кожи, т.к. свидетельствуют о степени нарушения функции кератиноцитов, макрофагов дермы, клеток Лангерганса, биомембран кожи.