МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР
ПИСЬМО
12 октября 1989 г.
N 21-08/11-297
О ПОВЫШЕНИИ КАЧЕСТВА ЛЮМИНЕСЦЕНТНО - МИКРОСКОПИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА (МБТ)
Практическими и научно -
исследовательскими учреждениями приобретен достаточно большой положительный
опыт по совершенствованию люминесцентной микроскопии для диагностики
бактериовыделения у больных туберкулезом, позволяющий повысить результативность
указанного анализа, сократить затраты рабочего времени в отдельных моментах
исследования и обезопасить персонал при работе с вирулентной культурой.
Руководителем микробиологической
лаборатории НПО "Фтизиопульмонология" д-р мед.
наук В.М.Должанским, зав. лабораторией Московского
противотуберкулезного диспансера N 4 Н.Ф.Жаком и врачом Е.М.Морель на основании
анализа опыта применения люминесцентной микроскопии в противотуберкулезных
учреждениях подготовлены предложения по совершенствованию существующего метода.
В зависимости от возможностей лабораторий
окраска мазка производится по Хагеманну или по Бою. Последний метод нашел
меньшее число последователей из-за дефицитности и высокой стоимости одного из
основных красителей (родамина), поэтому в настоящем письме акцент сделан на
окраску по Хагеманну, но учтены и особенности окраски по Бою.
Окраска по Бою сложнее окраски по
Хагеманну и много дороже. Ее внедрение во многих лабораториях определяется
большим объемом информации, получаемой микроскопистом при использовании данной
методики: снижается риск выдачи положительного ответа при обнаружении
сапрофитной флоры, появляется возможность дифференцировать возраст
микобактериальных клеток и т.д. Однако тонкая дифференцировка, достигаемая при
окраске по Бою, требует и дополнительных затрат времени. Так, при изготовлении
мазка из осадка материала, подготовленного для посева, необходимо прямо на
предметном стекле проверить рН суспензии и добиться его значения в 6,5-7,0
единиц (проверяется мелкими лакмусовыми бумажками). Для подщелачивания
используют 0,5% раствор NaOH, для подкисления - 0,5% раствор HCl. Для окраски
по Хагеманну эта процедура необязательна.
При всех видах окраски абсолютно
необходима плотная фиксация мазка на стекле. Жидкий материал (мочу, экскрет
после ингаляций, ликвор и т.д.) обязательно наносят на предметные стекла,
предварительно смазанные взбитым яичным белком. В условиях холодильника такие
стекла хранятся неограничено долго и могут заготавливаться впрок.
Не следует спешить с термальной фиксацией
мазка. Вначале мазок подсушивают на воздухе - на нем не должно оставаться
мелких капель - затем фиксируют в сухожаровом шкафу при 90 град. С в течение 30 минут. Отсчет
времени начинают с момента достижения температуры 90 град. При этом происходит
не только хорошая фиксация материала, но и дальнейшая работа с мазком
становится безопасной.
Оригинальный метод окраски разработан в
Московском противотуберкулезном диспансере N 4. В настоящее время этим простым
и надежным методом пользуются практически все лаборатории Москвы.
Реактивы: 1) 10% раствор Na3PO4
2) 5% раствор карболовой кислоты
3) 0,1% раствор аурамина
Для лучшего растворения аурамин в течение
суток выдерживается в термостате. Перед употреблением растворы аурамина и
карболовой кислоты профильтровываются через обеззоленный бумажный фильтр. Эти
растворы готовят из расчета недельной потребности.
4) 3% солянокислый спирт
5)Раствор кислого фуксина: 390 мл
дистиллированной
воды, 1 грамм кислого фуксина и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Перед
употреблением кислый фуксин профильтровать через обеззоленный бумажный фильтр.
Растворы солянокислого спирта и кислого фуксина можно готовить впрок.
Отличием от рутинного метода Хагеманна
нужно считать 2 основных момента:а) раствор аурамина
готовят без добавления карболовой кислоты и б) мазок перед окраской заливают
раствором карболовой кислоты, что выравнивает рН всей поверхности мазка,
улучшает и ускоряет проникновение краски в клетку возбудителя, а это
способствует хорошему свечению клеток по всей просматриваемой площади.
Ход работы (экономный вариант). Материал
обрабатывается 10% раствором Na3PO4 18-24 часа в термостате.
На следующий день из плевательниц
осторожно сливают верхний слой жидкости, горлышко плевательницы фламбируют на
пламени горелки, осторожно перемешивают содержимое плевательницы и разливают по
центрифужным пробиркам. Горлышко центрифужки фламбируют на пламени горелки.
Если материал идет на посев и бактериоскопию, содержимое плевательницы
разливают в две центрифужки.
Приготовление мазков
Центрифугирование - 2000 об/мин. 15
минут. Надосадочную жидкость полностью сливают. Горлышко центрифужки фламбируют
на пламени горелки.
Осадок энергично взбалтывают и 1-2 капли
через край наносят на предметное стекло. Горлышко центрифужки фламбируют на
пламени. Донышком центрифужки на предметном стекле делают не толстый круглый
или овальный мазок.
Окраска: а) мазки раскладывают на рельсы
и заливают 5% раствором карболовой кислоты на 2 минуты. Через 2 минуты р-р
карболовой кислоты с мазков сливают, торец стекла высушить фильтровальной
бумагой;
б) без промывки мазков на них наносят 0,1
р-р аурамина на 2 минуты;
в) мазки промывают с тыльной стороны
проточной водой;
г) обесцвечивание 3% солянокислым спиртом
дважды по 2 минуты;
д) промывка с тыльной стороны струйкой
воды;
е) мазки заливают р-ром кислого фуксина
на 2 минуты;
ж) промывка стекол с мазками с тыльной
стороны. Сушка на воздухе.
Микроскопия
Аналогично можно готовить мазки для
окраски по Цилю - Нильсену взамен исследования флотационного кольца, но при
этом исключается обработка мазков карболовой кислотой.
Метод информативен, прост, позволяет
экономить лабораторную посуду, повысить производительность труда, рекомендуется
к повсеместному внедрению.