"Определение массовой концентрации фенола в биосредах (моча) газохроматографическим методом. Методические указания. МУК 4.1.2107-06" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

9 августа 2006 года

Дата введения:

1 сентября 2006 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕНОЛА

В БИОСРЕДАХ (МОЧА) ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.1.2107-06

1. Область применения

Методические указания по определению концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием органических соединений в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92. "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации фенола в моче в диапазоне концентраций: от 0,04 до 0,4 мкг/куб. см с погрешностью 10,0% при доверительной вероятности 0,95.

Фенол Молекулярная масса 128,56.

C6H5OH

Фенол - бесцветные кристаллы с характерным запахом, Т - 181,75

кип.

град. С. Растворим в воде и органических растворителях. Является сильным

нейротоксином, поражает печень, почки, проникает через кожу [1].

2. Сущность метода

Методика основана на предварительном переводе фенола в фенилацетат с помощью уксусного ангидрида в щелочной среде, концентрировании продукта дериватизации из биологического материала (моча) экстракцией метиленхлоридом и последующем газохроматографическом анализе экстракта. Необходимость превращения фенола в производные вызвана тем, что прямой газохроматографический анализ фенолов, особенно следовых количеств, осложнен высокой полярностью фенольных соединений и низким давлением их паров. Улучшить газохроматографические свойства фенола можно путем превращения их в менее полярные соединения.

Выполнение измерений массовой концентрации фенола проводят методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора. Определению не мешают о-, м-, п-крезолы, ксиленолы, хлорфенолы в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемых концентраций фенола. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 20 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные

устройства, материалы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

3.1. Средства измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным

детектором

Секундомер "Агат" ТУ 25-1894.003-90

Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106-00

Весы аналитические ВЛР-200 ГОСТ 24104-01

Разновесы Г2-210 ГОСТ 7328-01

Линейка измерительная ГОСТ 427-75

Лупа измерительная ГОСТ 25706-83

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74

Пипетки вместимостью 5, 10 куб. см ГОСТ 29227-91.

3.2. Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стеклянная длиной 3 м и

внутренним диаметром 3 мм

Бидистиллятор стеклянный БС ТУ 25-11.1592-81

Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73

Центрифуга СМ-4, 3000 об./мин.

Бюксы стеклянные ГОСТ 25336-82

Воронка делительная ГОСТ 23932-90.

3.3. Материалы

Гелий в баллоне ТУ 51-940-80

Водород технический ГОСТ 3022-80

Воздух в баллоне ГОСТ 17433-80.

3.4. Реактивы

3% OV-1 на хроматоне N-супер фракции

0,16-0,20 мм - неподвижная фаза для

заполнениях роматографической колонки

Фенол, чда ТУ 6-09-5303-86

Нафталин, хч ТУ 6-09-2200-77

Натрия карбонат, чда ГОСТ 83-79

Уксусный ангидрид, ч МРТУ 6-09-5708-68

Ацетон, осч ТУ 2633-004-11291058-94

Метиленхлорид, хч ТУ 6-09-2662-77

Серная кислота, осч ГОСТ 14262-78

Калия дихромат, чда ГОСТ 4220-75.

3.5. Растворы

Раствор калия дихромата, 3%-й.

4. Требования к безопасности

4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.

4.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87).

4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6. Условия измерений

6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 5) град. С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С.

6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть бидистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.

7.2. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелий) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 250 град. С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

7.3. Приготовление аттестованных смесей

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую исследуемого компонента, и готовят серию рабочих аттестованных растворов.

Исходный аттестованный раствор фенола. В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг фенола и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения - 5 ч.

Исходный аттестованный раствор нафталина. В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг нафталина и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения - 3 дня.

7.4. Определение градуировочных коэффициентов

фенола по отношению к внутреннему стандарту

Рабочий аттестованный раствор. В мерную колбу объемом 50 куб. см, содержащую 30 куб. см мочи, вносят объемы исходных аттестованных растворов фенола и нафталина согласно табл. 1. Содержимое колбы доводят до метки мочой.

Таблица 1

РАБОЧИЕ АТТЕСТОВАННЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ

ГРАДУИРОВОЧНЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ ФЕНОЛА ПО ОТНОШЕНИЮ

К ВНУТРЕННЕМУ СТАНДАРТУ

Номер смеси	1	2	3	4	5	6
Фенол, объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/куб. см), куб. см	0,005	0,01	0,02	0,025	0,04	0,05
Концентрация фенола, мкг/куб. см	0,04	0,08	0,16	0,20	0,32	0,40
Нафталин, объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/куб. см), куб. см	0,10	0,09	0,07	0,05	0,03	0,02
Концентрация нафталина, мкг/куб. см	0,80	0,72	0,56	0,40	0,24	0,16

Для определения градуировочных коэффициентов в делительную воронку объемом 250 куб. см вносят 50 куб. см рабочего аттестованного раствора и добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см уксусного ангидрида и встряхивают в течение 0,5 мин. для перевода фенола в уксуснокислый эфир.

Продукт ацилирования дважды экстрагируют метиленхлоридом порциями по 2,5 куб. см в течение 2 мин. Экстракты центрифугируют в течение 10 мин. После удаления белка объединенные органические вытяжки помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см.

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 мм каждого экстракта рабочего аттестованного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок - 110 град. С;

температура испарителя - 170 град. С;

температура детектора - 170 град. С;

расход газа-носителя (гелий) - 30 куб. см/мин.;

скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч;

время удерживания ацетата фенола - 3 мин. 20 с;

нафталина - 6 мин.

На полученной хроматограмме определяют высоты или площади пиков

определяемого компонента и внутреннего стандарта и по средним результатам

из 6 серий рассчитывают градуировочные коэффициенты.

Значение градуировочного коэффициента К вычисляют по формуле:

i/ст

S х Q

ст i

К = --------,

i/ст S х Q

i ст

где:

S , S - площади пиков исследуемого компонента (фенилацетата) и

i ст

внутреннего стандарта (нафталина), кв. мм;

Q , Q - количество исследуемого компонента (фенилацетата) и

i ст

внутреннего стандарта (нафталина), мкг.

По результатам 7 измерений определяется среднее значение

градуировочного коэффициента К и строится градуировочный график в

i/ст

координатах градуировочный коэффициент - отношение площадей пиков S / S .

i ст

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5. Отбор проб

Отбор проб мочи в объеме не менее 200 куб. см производят в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

8. Выполнение измерений

Пробу мочи в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют внутренний стандарт - нафталин 0,1 куб. см (исходный аттестованный раствор 400 мкг/куб. см) и 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см уксусного ангидрида и встряхивают в течение 0,5 мин. для перевода фенола в уксуснокислый эфир. Продукт ацилирования дважды экстрагируют метиленхлоридом порциями по 2,5 куб. см в течение 2 мин. Экстракты объединяют и центрифугируют в течение 10 мин. После удаления белка объединенные органические вытяжки помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см. Полученный экстракт хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе методом внутреннего стандарта. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 7.4.).

9. Вычисление результатов измерений

На хроматограмме рассчитывают площади пиков фенилацетата и внутреннего

стандарта (нафталина).

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух

параллельных измерений Х , Х , расхождение между которыми не должно

max min

превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).

Расчет концентрации фенола (мкг/куб. см) в биопробе вычисляют по

формуле:

S х m х К

i ст i/ст

Х = ----------------,

S х V

ст

где:

X - концентрация фенола в биопробе, мкг/куб. см;

S , S - площади пиков фенилацетата и нафталина, кв. мм;

i ст

К - градуировочный коэффициент (устанавливается по градуировочному

i/ст

графику - К - S / S );

i/ст i ст

m - навеска нафталина, мкг;

ст

V - объем пробы, куб. см.

Результат измерения представляют в виде:

(Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см,

где:

Х + Х

_ _ max min

Х - средний результат анализа, мкг/куб. см, Х = -----------,

при условии:

r Х + Х

n max min

Х - Х <= --- х -----------,

max min 100 2

где:

Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений;

max

Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений;

min

r - значение предела повторяемости, %;

ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная:

дельта х Х

ДЕЛЬТА = ----------,

100

где:

дельта - относительное значение характеристики погрешности, %

(табл. 2).

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа". Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

ТОЧНОСТИ, ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

┌─────────────┬─────────────────┬────────────────────┬────────────────────┐

│Наименование │Показатель │ Показатель │ Показатель точности│

│определяемого│повторяемости │ воспроизводимости │ (границы │

│компонента и │(относительное │ (относительное │ относительной │

│ диапазон │среднеквадратиче-│среднеквадратическое│ погрешности при │

│ измерений, │ское отклонение │ отклонение │ вероятности │

│ мкг/куб. см │повторяемости), │воспроизводимости), │ Р = 0,95), │

│ │дельта , % │ дельта , % │ +/- дельта, % │

│ │ r │ R_ │ │

│ │ │ Хl │ │

├─────────────┼─────────────────┼────────────────────┼────────────────────┤

│Фенол, │ 6,9 │ 2,9 │ 10,0 │

│от 0,04 │ │ │ │

│до 0,40 вкл. │ │ │ │

└─────────────┴─────────────────┴────────────────────┴────────────────────┘

Таблица 3

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95

┌─────────────────────┬─────────────────────┬─────────────────────────────┐

│ Наименование │Предел повторяемости │ Предел внутрилабораторной │

│ определяемого │ (относительное │ воспроизводимости │

│ компонента и │значение допускаемого│ (относительное значение │

│ диапазон измерений, │ расхождения между │ допускаемого расхождения │

│ мкг/куб. см │ двумя результатами │ между двумя результатами │

│ │ параллельных │ измерений, полученными в │

│ │ определений), │ одной лаборатории, но в │

│ │ r , % │ разных условиях), │

│ │ n │ R_ , % │

│ │ │ Хl │

├─────────────────────┼─────────────────────┼─────────────────────────────┤

│Фенол, │ 10,3 │ 8,0 │

│от 0,04 до 0,40 вкл. │ │ │

└─────────────────────┴─────────────────────┴─────────────────────────────┘

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержания исследуемых соединений в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений,

выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении

образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же

средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала

времени, не должно превышать значения предела повторяемости r , (табл. 3).

Повторяемость результатов параллельных измерений признают

удовлетворительной, если:

r Х + Х

n max min

Х - Х <= --- х -----------,

max min 100 2

где:

r - значение предела повторяемости, %;

Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений;

max

Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений.

min

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

_ _

R_ Х + Х

_ _ Хl 1 2

|Х - Х | <= --- х -------,

1 2 100 2

где:

Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных

измерений, мкг/куб. см;

Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных

измерений, полученный в других условиях, мкг/куб. см;

R_ - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, %

Хl

(табл. 3).

_ _

Расхождение между результатами измерений Х , и Х , полученными в разных

1 2

условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R_ ,

Хl

при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 3.

10.4. Контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении

результата контрольной процедуры, равного разности между результатом

контрольного измерения содержания фенола в пробе с известной добавкой (Х )

в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С (добавка должна

составлять не менее 40% от содержания фенола в рабочей пробе) с нормативом

точности К.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется

условие:

_1 _

|Х - Х - С | = К ,

д k

где:

Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных

измерений, мкг/куб. см;

Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см;

С - величина добавки к пробе, мкг/куб. см.

_____________________________

/дельта _ 2 дельта _1 2

К = 0,84 х /(------ х Х) + (------ х Х ) .

\/ 100 100

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительной при

выполнении условия: К <= К.

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют.

Периодичность контроля исполнения процедуры ВКК регламентируют в руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов: Справ. изд./Под ред. В.А.Филова и др. Л.: "Химия", 1990.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.В.Нурисламова, Н.А.Попова).