"Определение массовой концентрации 2-хлорфенола в биосредах (моча) газохроматографическим методом. Методические указания. МУК 4.1.2109-06" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

9 августа 2006 года

Дата введения:

1 сентября 2006 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ 2-ХЛОРФЕНОЛА

В БИОСРЕДАХ (МОЧА) ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.1.2109-06

1. Область применения

Методические указания по определению концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием органических соединений в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации 2-хлорфенола в моче в диапазоне концентраций: от 0,05 до 1,80 мкг/куб. см с погрешностью 23,0% при доверительной вероятности 0,95.

2-Хлорфенол

ClC6H4OH Молекулярная масса 128,56.

2-Хлорфенол - бесцветная жидкость с резким неприятным запахом.

Температура кипения - 175 град. С. Кумулятивные свойства выражены умеренно. Вызывает нарушения функции почек и печени, при периодическом попадании на кожу - новообразования [1].

2. Сущность метода

Методика основана на предварительном концентрировании анализируемого соединения из биологического материала (моча) экстракцией бутилацетатом и последующем газохроматографическом анализе экстракта.

Выполнение измерений массовой концентрации 2-хлорфенола выполняют методом газовой хроматографии с использованием детектора электронного захвата.

Определению не мешают хлороформ, тетрахлорметан и другие хлорфенолы (температура кипения 3-хлорфенола - 214 град. С) в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемой концентрации 2-хлорфенола.

Длительность анализа одной пробы мочи, включая экстракцию, - 40 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,

материалы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

3.1. Средства измерений

Хроматограф газовый с детектором

электронного захвата

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-01

Разновесы Г2-210 ГОСТ 7328-01

Секундомер "Агат" ТУ 25-1894.003-90

Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106-00

Линейка измерительная ГОСТ 427-75

Лупа измерительная ГОСТ 25706-83

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74

Пипетки мерные 5, 10 куб. см ГОСТ 29227-91.

3.2. Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стеклянная длиной

1,5 м и внутренним диаметром 3 мм

Бидистиллятор стеклянный БС ТУ 25-11.1592-81

Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73

Центрифуга СМ-4, 3000 об./мин.

Воронка делительная ГОСТ 23932-90.

3.3. Материалы

Азот газообразный ГОСТ 9293-74.

3.4. Реактивы

3% ХЕ-60 на хроматоне N-супер фракции

0,16-0,20 мм - неподвижная фаза для

заполнения хроматографической колонки

(производство Германии)

2-Хлорфенол, ч ТУ 6-09-2875

Натрия хлорид, хч ГОСТ 4233-77

Соляная кислота, хч ГОСТ 3118-77

Бутилацетат, ч ГОСТ 22300-76

Камфара фарм.

Серная кислота, осч ГОСТ 14262-78

Калия дихромат, чда ГОСТ 4220-75

Ацетон, осч ТУ 2633-039-44493179-00.

3.5. Растворы

Раствор калия дихромата, 3%-й

Раствор камфары, 20%-й

Соляная кислота, раствор (1:3).

4. Требования к безопасности

4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.

4.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87).

4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6. Условия измерений

6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 5) град. С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С.

6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть бидистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.

7.2. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 250 град. С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

7.3. Приготовление растворов и реактивов

7.3.1. Раствор соляной кислоты (1:3). В мерный стакан объемом 100 куб. см, содержащий 75 куб. см бидистиллированной воды, вводят 25 куб. см соляной кислоты (ро = 1,19). Раствор переносят в стеклянную склянку с притертой пробкой.

7.3.2. Раствор камфары 20%-й. Растворяют 2 г кристаллической камфары в 10 куб. см бутилацетата. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой не более 1 месяца.

7.3.3. Реагент для экстракции. К 100 куб. см бутилацетата прибавляют 0,4 куб. см 20%-го раствора камфары.

7.4. Приготовление аттестованных смесей

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую определяемого компонента, и готовят серию аттестованных растворов.

Исходный аттестованный раствор. В мерную колбу объемом 100 куб. см, содержащую 50 куб. см мочи, вводят 2 куб. мм 2-хлорфенола и заполняют колбу до метки мочой. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет (с учетом плотности) 25,27 мкг/куб. см. Срок хранения - 12 ч.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (кв. мм) от массы 2-хлорфенола (мкг) и строится по 5 сериям рабочих аттестованных растворов. Каждую серию, состоящую их 5 рабочих аттестованных растворов, готовят в мерных колбах объемом 50 куб. см. В колбу объемом 50 куб. см, содержащую 30 куб. см мочи, добавляют исходную аттестованную смесь для градуировки в соответствии с табл. 1. Затем объем в колбе доводят мочой до метки.

Таблица 1

РАБОЧИЕ АТТЕСТОВАННЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ

ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ

КОНЦЕНТРАЦИИ 2-ХЛОРФЕНОЛА

Номер смеси для градуировки	1	2	3	4	5
2-Хлорфенол, объем исходного аттестованного раствора (25,27 мкг/куб. см), куб. см	0,1	0,5	1,0	2,0	3,5
Содержание 2-хлорфенола, мкг/куб. см	0,05	0,25	0,5	1,0	1,77

Для построения градуировочной характеристики 2-хлорфенола аттестованный раствор в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 30 г высаливателя (хлорид натрия), подкисляют раствором соляной кислоты (1:3) до pH = 2 и приливают 5 куб. м реагента для экстракции (раствор камфары в бутилацетате). Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин., после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 10 мин.

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 2 куб. м каждого экстракта аттестованного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок - 110 град. С;

температура испарителя - 170 град. С;

температура детектора - 250 град. С;

расход газа-носителя (азот) - 30 куб. см/мин.;

скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч;

время удерживания 2-хлорфенола - 1 мин.

На полученной хроматограмме определяют площади пиков 2-хлорфенола и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.6. Отбор проб

Отбор проб мочи в объеме не менее 200 куб. см производится в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

8. Выполнение измерений

Для определения 2-хлорфенола мочу в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 30 г высаливателя (хлорид натрия), подкисляют раствором соляной кислоты (1:3) до pH = 2 и приливают 5 куб. см реагента для экстракции (раствор камфары в бутилацетате). Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин., после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 10 мин.

Полученный центрифугат хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе по калибровочному графику. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 7.5.).

9. Вычисление результатов измерений

На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют концентрацию 2-хлорфенола в моче.

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух

параллельных определений Х , Х , расхождение между которыми не должно

max min

превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).

Расчет концентраций 2-хлорфенола ведут по формуле:

А х V

экст.

Ч = ----------,

V х V

1 2

где:

А - количество компонента, найденное по калибровочному графику, мкг;

V - объем экстрагента, куб. см;

экст.

V - объем экстрагируемой мочи, куб. см;

V - объем хроматографируемой пробы, куб. см.

Результат измерений представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см,

где:

Х - средний результат анализа, мкг/куб. см:

Х + Х

_ max min

Х = -----------,

при условии:

r Х + Х

n max min

Х - Х <= --- х -----------,

max min 100 2

где:

Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений;

max

Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений;

min

r - значение предела повторяемости, %;

ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная:

дельта х Х

ДЕЛЬТА = ----------,

100

где дельта - относительное значение характеристики погрешности, %.

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,

ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

┌─────────────────┬──────────────────┬────────────────────┬───────────────┐

│ Наименование │Показатель повто- │Показатель воспроиз-│Показатель точ-│

│ определяемого │ряемости (относи- │водимости (относи- │ности (границы │

│ компонента и │тельное среднеква-│тельное среднеквад- │относительной │

│ диапазон │дратическое откло-│ратическое отклоне- │погрешности при│

│ измерений, │нение повторяемо- │ние воспроизводимо- │вероятности │

│ мкг/куб. см │сти), сигма , % │сти), сигма │Р = 0,95), │

│ │ r │ R , % │+/- дельта, % │

│ │ │ _ │ │

│ │ │ Xl │ │

├─────────────────┼──────────────────┼────────────────────┼───────────────┤

│2-Хлорфенол, от │ 11,7 │ 12,3 │ 23,0 │

│0,05 до 1,80 вкл.│ │ │ │

└─────────────────┴──────────────────┴────────────────────┴───────────────┘

Таблица 3

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95

┌──────────────────────────┬───────────────────┬──────────────────────────┐

│Наименование определяемого│Предел повторяемос-│Предел внутрилабораторной │

│ компонента и диапазон │ти (относительное │воспроизводимости (относи-│

│ измерений, мкг/куб. см │значение допускае- │тельное значение допускае-│

│ │мого расхождения │мого расхождения между │

│ │между двумя резуль-│двумя результатами измере-│

│ │параллельных опре- │ний, полученными в одной │

│ │делений), r , % │лаборатории, но в разных │

│ │ n │условиях), R , % │

│ │ │ _ │

│ │ │ Xl │

├──────────────────────────┼───────────────────┼──────────────────────────┤

│2-Хлорфенол, │ 22,3 │ 28,4 │

│от 0,05 до 1,80 вкл. │ │ │

└──────────────────────────┴───────────────────┴──────────────────────────┘

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочного графика проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений, определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений,

выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении

образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же

средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала,

не должно превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).

Повторяемость результатов параллельных измерений признают

удовлетворительной, если:

r Х + Х

n max min

Х - Х <= --- х -----------,

max min 100 2

где:

r - значение предела повторяемости, %;

Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений;

max

Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений.

min

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

R _ _

_ Х + Х

_ _ Xl 1 2

|Х - Х | <= --- х -------,

1 2 100 2

где:

Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных

измерений, мкг/куб. см;

Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных

измерений, полученный в других условиях, мкг/куб. см;

R - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, %

(табл. 3).

_ _

Расхождение между результатами измерений Х и Х , полученных в разных

1 2

условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R при

доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 3.

10.4. Оперативный контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении

результата контрольной процедуры, равного разности между результатом

контрольного измерения содержания 2-хлорфенола в пробе с известной добавкой

_1 _

(Х ), в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С (добавка

должна составлять не менее 40% от содержания 2-хлорфенола в рабочей пробе)

с нормативом точности К.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется

условие:

_1 _

|Х - Х - С | = К ,

д k

где:

Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных

измерений, мкг/куб. см;

Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого

компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см;

С - величина добавки к пробе, мкг/куб. см;

______________________________

/дельта _ 2 дельта _1 2

К = 0,84 х /(------ х Х) + (------ х Х ) .

\/ 100 100

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительным при

выполнении условия: К <= К.

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют.

Периодичность ВКК регламентируется в Руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов. Справ. изд./Под ред. В.А.Филова и др. Л.: "Химия", 1990.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.В.Нурисламова, Н.А.Попова).