УТВЕРЖДАЮ
Главный врач ФГУЗ "Федеральный
центр гигиены и эпидемиологии",
Председатель Лабораторного совета
Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
А.И.ВЕРЕЩАГИН
8 декабря 2006 г.
СЕРОТИПИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА SALMONELLA
МЕТОДОМ ЛАТЕКСНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
N 02.014-06
1. Разработаны ФГУЗ ФЦГиЭ
Роспотребнадзора при участии ООО "Стай-лаб".
2. Рекомендованы к утверждению
Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека (от 29 сентября 2006 г.).
3. Утверждены и
введены в действие Председателем Лабораторного совета, Главным врачом ФГУЗ
ФЦГиЭ Роспотребнадзора А.И.Верещагиным 08.12.2006.
4. Введены впервые.
1. Область
применения
Методические рекомендации предназначены
для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности,
осуществляющих производственный контроль, а также в лабораториях иных
организаций, аккредитованных на право проведения испытаний, исследований.
Методические рекомендации
распространяются на методы серологической дифференциации бактерий рода Salmonella,
выделенных из проб пищевых продуктов, смывов.
2. Общие положения
Сальмонеллы принадлежат к семейству
Enterobacteriaceae, их биологические характеристики во многом сходны с прочими
энтеробактериями. Энтеробактерии обнаруживаются в почве, в воде, на поверхности
фруктов, овощей, в злаках и других объектах окружающей среды. Многие из этих
микроорганизмов имеют эпидемиологическое значение в связи с их патогенностью
для человека.
В настоящее время сальмонеллы признаны
индикаторными микроорганизмами всей группы патогенных кишечных бактерий.
При использовании иммунохимических
методов определения бактерий рода Salmonella могут быть существенно
оптимизированы, а время исследования сокращено. Метод может быть пригоден для
испытания чистых культур сальмонелл, а также для подтверждения культур,
выделенных при положительном результате ИФА на тест-системе LOCATE(R)
Salmonella.
3. Аппаратура,
материалы, питательные среды и тест-системы
Термостат
электрический с диапазоном измерения от 15 до ТУ 64-1-1382-83
65 град. С с допустимой погрешностью
регулирования
температуры +/-
1 град. С
Стерилизатор
паровой медицинский
ГОСТ 19569
Шкаф
сушильно-стерилизационный, обеспечивающий
поддержание
заданного температурного режима в диапазоне
от 50 до 200
град. С с погрешностью +/- 2 град. С
Гомогенизатор
бактериологический перистальтического типа
Masticator (или
Stomacher) со стерильными
полиэтиленовыми
пакетами
Ротатор с
плоской поверхностью, частота вращения
150 об./мин.
Стандарт
МакФарланда 0,5 единиц или денситометр для
бактериальных
суспензий типа "Densi-La-metr" или
"Десимат"
Облучатель
бактерицидный настенный ОБН-150
ТУ 16-535-84
Весы
лабораторные с наибольшим пределом взвешивания ГОСТ 24104
200 г и
допустимой погрешностью +/- 2 мг
Холодильник
бытовой электрический
ГОСТ 16317
Пипетки градуированные исполнения 1, 2 классов
точности, ГОСТ 29227
вместимостью 1
куб. см, 10 куб. см
Пробирки
бактериологические вместимостью не менее ГОСТ 25336
10 куб. см
Посуда
широкогорлая ГОСТ
25336
Питательные
среды:
Забуференный
бульон для обогащения сальмонелл
Тетратионатный
бульон
Селенитовый
бульон
Висмут-сульфит
агар
XLD-агар
Компоненты
набора SPECTATE(R) Salmonella:
Латексный
реагент 1 1 шт.
Латексный
реагент 2 1 шт.
Положительный
контроль
3 шт.
(термически
дезактивированные сальмонеллы)
Карточки для
постановки реакции агглютинации
15 шт.
Палочки-аппликаторы около
100 шт.
Разовые
пипетки 50
шт.
Разовые
пробирки 50 шт.
Стерильный
физиологический раствор (0,9% NaCl) для
приготовления
бактериальной суспензии
4. Описание и
принцип действия
тест-системы SPECTATE(R) Salmonella
Тест-система SPECTATE(R) Salmonella
предназначена для серологического анализа сальмонелл в культуральных бульонах и
из выделенных чистых культур методом латексной агглютинации, позволяет быстро
дифференцировать их принадлежность к основным серологическим группам.
В основе работы тест-системы SPECTATE(R)
Salmonella лежит взаимодействие латексных частиц, покрытых специфическими
антителами к сальмонеллам групп A, B, C, D, E, и антигенов сальмонелл,
содержащихся в бульоне или суспензии, на специальных слайдах.
В комплект тест-системы SPECTATE(R)
Salmonella входят два иммунореагента, представляющие собой смеси латексных
суспензий красного, голубого и зеленого цветов. Каждая цветная латексная
суспензия сенсибилизирована антителами к определенной группе сальмонелл. В ходе
анализа цветные латексные частицы образуют агрегаты со специфическими
антигенами сальмонелл, что сказывается в изменении вида и цвета растворов на
слайде. Исследование с помощью тест-системы SPECTATE(R) Salmonella имеет
продолжительность 4 минуты и используется в качестве дополнительного
подтверждающего теста в комбинации с иммуноферментным методом анализа
(например, с помощью тест-системы LOCATE(R) Salmonella), с методами
классической микробиологии или с импедансным методом (например, с системами БАКТРАК,
Мальтус и т.д.).
5. Сущность метода
Метод серотипирования бактерий рода
Salmonella при исследовании микробной взвеси или обогащенного бульона основан
на визуальном определении наличия агглютинации, цвет которой соответствует
конкретной серологической группе бактерий.
6. Ход исследования
чистой культуры
6.1. Внести 200 мкл стерильного
физиологического раствора в пробирку из комплекта поставки.
6.2. С помощью аппликатора отобрать одну
или две характерные колонии с чашки Петри таким образом, чтобы отобранные
колонии закрыли плоский конец аппликатора.
6.3. Осторожно внести колонии в пробирку
с физиологическим раствором, суспензировать колонии (суспензия должна
соответствовать стандарту мутности 0,5 единиц по МакФарланду) и далее выполнять
исследование при помощи метода латексной агглютинации.
Примечание:
В соответствии с действующими
методическими документами рекомендуется отобрать для исследования, по крайней
мере, не менее 5 колоний с чашки Петри.
6.4. Пример: использование метода
латексной агглютинации агаровых и бульонных культур бактерий рода Salmonella в
комплексе с классическими бактериальными методами и методом иммуноферментного
анализа.
Таблица 1
ПРОВЕДЕНИЕ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ
(SPECTATE(R) SALMONELLA)
В КОМБИНАЦИИ С СИСТЕМОЙ LOCATE(R) SALMONELLA
┌──────────────────────────┬─────────────────────────────────────┐
│ Методология LOCATE(R) │
Рекомендуемое использование │
│ │ латекс-агглютинации │
├──────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ Исследуемая проба │ │
│ │ │ │
│ \/ │ │
│ Предобогащение │ │
│ │ │ │
│ \/ │ │
│ Селективный бульон │ │
│ │ │ │
│ \/ │ │
│Модифицированный
GN-бульон│ ---->
SPECTATE(R) │
│ │ │ Salmonella │
│ \/ │ │
│Положительный
результат на│ │
│ LOCATE(R) │ │
│ │ │ │
│ \/ │ │
│Селективные
плотные среды │Подозрительные ----> SPECTATE(R) │
│ │ колонии Salmonella │
└──────────────────────────┴─────────────────────────────────────┘
7. Исследование
культуральной жидкости,
полученной при анализе импедансного метода
7.1. Отобрать 1 мл бульона с вероятным
ростом бактерий из импедансной системы в соответствующую пробирку.
7.2. Перенести пробирку в кипящую водяную
баню и оставить на 15 минут.
Примечание:
Исследуемые пробы нужно обязательно
инкубировать в кипящей водяной бане для того, чтобы снизить нежелательное
влияние компонентов бульона.
7.3. Охладить пробы и далее выполнять
исследование на латексную агглютинацию.
Примечание:
Следует отметить, что интенсивно
окрашенные бульоны, использующиеся в импедансных системах, при постановке
реакции латексной агглютинации могут быть помехой для интерпретации
результатов. В этих случаях рекомендуется выполнять дополнительную инокуляцию
культуральной суспензии в питательный бульон с последующей инкубацией (24 часа)
для увеличения количества бактерий до детектируемого уровня.
8. Порядок
проведения испытания
8.1. Положить слайд на чистую горизонтальную
поверхность. Убедиться, что слайд не перевернут, поверхность гладкая и ровная.
Не касаться очерченных на слайде реакционных зон.
8.2. Ресуспензировать латексные и
контрольные реагенты, встряхивая флаконы в течение 5-10 с. Нанести по 30 мкл
реагента 1 в первую зону слайда и реагента 2 - в смежную зону.
8.3. С помощью разовой пипетки, держа ее
под углом 45 град. , внести по 40 мкл исследуемой
жидкости в каждую зону слайда.
8.4. С помощью разового аппликатора
смешать капли на слайде и распределить равномерно по поверхности очерченной
зоны. При исследовании одной пробы можно использовать один аппликатор для обеих
зон.
8.5. Поместить карточку на платформу
ротатора. Убедиться в том, что слайд расположен ровно и не соскользнет при
включении ротатора. При необходимости, для фиксации слайда на платформе
ротатора можно использовать двухстороннюю липкую ленту. Установить скорость
вращения - 150 об./мин.,
включить ротатор. Через 4 мин. остановить ротатор и наблюдать агглютинацию на
слайде.
Не использовать увеличительное стекло.
9. Учет и оценка
результатов испытаний
9.1. Наблюдаемая цветная латексная
агглютинация свидетельствует о наличии бактерий рода Salmonella в исследуемых
пробах и позволяет идентифицировать их серологическую группу (или присутствие в
пробе Vi-антигена). При положительной реакции цвет агглютинации красный, синий,
зеленый.
9.2. При отрицательной реакции фон
остается бесцветным или становится зелено-пурпурным, на что необходимо обращать
внимание. Отрицательный результат определения свидетельствует о том, что
исследуемые бактерии не принадлежат к определяемым серологическим группам
бактерий рода Salmonella. При необходимости дальнейшей идентификации бактерий
могут быть использованы традиционные микробиологические методы.
9.3. Неспецифические реакции с трудно
интерпретируемым результатом агглютинации возможны при исследовании бульонов с
высоким содержанием конкурирующих микроорганизмов. В таких случаях следует
использовать классические процедуры идентификации с последующим выделением
чистой культуры и повторной агглютинацией.
Учет результатов испытания в зависимости
от цвета агглютинации представлен в таблице 2.
Таблица 2
|
Комбинация
реагентов реакции
|
Цвет агглютинации
|
|
1
|
2
|
|
B
|
Vi
|
Красный
|
|
C
|
E или G
|
Синий
|
|
D
|
A
|
Зеленый
|
|
Без окраски
|
отрицательный
|
|
Зелено-пурпурный
|
отрицательный
(неспецифический)
|
Примечание:
1. На слайде может наблюдаться взвесь,
появление которой связано не с агглютинацией, а со свойствами жидкостей, в
которых при тестировании бактерии распределены неоднородно. Эти результаты не
следует рассматривать как положительные, так как агглютинированные цветные
латексные частицы можно легко отличить от взвесей на фоне красного, синего или
зеленого цвета капли.
2. Если результат исследования показал
присутствие Vi-антигена (красная агглютинация с иммунореагентом 2), исследуемую
суспензию необходимо перенести в пробирку, поместить в кипящую водяную баню на
5 минут и провести испытание повторно с двумя иммунореагентами (в наборе).
Данная процедура необходима для удаления внешней Vi-капсулы микроорганизма, что
поможет установить серотип сальмонеллы при агглютинации.
Если Vi-антиген обнаруживается после
кипячения пробы, выделенные культуры, подозрительные на род Salmonella,
необходимо отправить для дальнейшей идентификации в учреждения Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
10. Требования к
помещениям и технике безопасности
Работа по проведению серотипирования
сальмонелл методом латексной агглютинации должна осуществляться в соответствии
с требованиями СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV
групп патогенности и гельминтами", ГОСТ Р 51446
"Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических
исследований".
11. Ограничения
метода
11.1.
Нижний предел обнаружения
сальмонелл с помощью
латексных
7
иммунореагентов SPECTATE(R) Salmonella составляет около
10 КОЕ/мл бульона
или микробной
суспензии (при исследовании без выделения чистой культуры).
11.2. Тест-система SPECTATE(R) Salmonella
позволяет дифференцировать 97% видов сальмонелл, за исключением таких видов,
как S. typhi, S. pararyhi C.