МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

 

ПРИКАЗ

 

15 октября 1974 г.

 

N 960

 

ОБ УНИФИКАЦИИ

КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Внедрение в практику унифицированных методов клинических лабораторных исследований, утвержденных приказом Министра здравоохранения СССР N 290 от 11 апреля 1972 года, позволило ввести более прогрессивные диагностические методы, упорядочить работу клинико-диагностических лабораторий, повысить производительность труда, сократить дублирование лабораторных исследований, стало основой для разработки рациональных форм готовых наборов реактивов.

В целях дальнейшей унификации клинических лабораторных методов исследования в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений страны:

I. Утверждаю:

1) Перечень унифицированных методов клинических лабораторных исследований (приложение N 1) в дополнение к приказу N 290 от 11.IV-1972 г.

2) Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований (приложение N 2).

3) Терминологию к унифицированным методам клинических лабораторных исследований (приложение N 3).

II. Приказываю:

1) Министрам здравоохранения союзных и автономных республик, заведующим краевыми, областными, городскими отделами здравоохранения:

а) организовать, начиная с 1975 года, проведение лабораторных исследований во всех клинико-диагностических лабораториях по утвержденным унифицированным методам;

б) обеспечить обучение врачей и лаборантов со средним медицинским образованием на местных базах применению унифицированных методов лабораторной диагностики.

2) Главному управлению учебных заведений (т. Исаков Ю.Ф.) внести изменения в учебные планы и программы циклов специализации и усовершенствования врачей по клинической лабораторной диагностике с учетом применения унифицированных методов лабораторных исследований.

III. Рекомендовать врачебно-санитарному управлению МПС (т. Лежнев Н.Д.), медицинскому управлению МГА (т. Шинкаренко И.П.) и Центральному совету по управлению курортами профсоюзов ВЦСПС (т. Козлов И.И.) ввести в лечебно-профилактических учреждениях, подведомственных этим управлениям, унифицированные методы клинических лабораторных исследований.

IV. Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на Главное управление лечебно-профилактической помощи (т. Сягаев С.А.).

 

Министр

здравоохранения СССР

Б.ПЕТРОВСКИЙ

 

 

 

 

 

Приложение N 1

к приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 15.10.1974 г. N 960

 

ПЕРЕЧЕНЬ

УНИФИЦИРОВАННЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ

МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

1. ОБЩЕКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Исследование секреторной функции желудка

1.1.1. Раздражители желудочной секреции

1.1.2. Фракционный метод извлечения желудочного содержимого с применением тонкого зонда

1.1.3. Определение кислотности желудочного содержимого

1.1.4. Определение активности пепсина в желудочном содержимом с использованием в качестве субстрата сухой плазмы (метод Туголукова)

1.1.5. Определение активности пепсина в желудочном содержимом с использованием в качестве субстрата гемоглобина (метод Ансона в модификации Черникова)

 

2. ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Методы клинической гематологии

2.1.1. Определение гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом с применением ацетонциангидрина

2.1.2. Определение осмотической резистентности эритроцитов

2.2. Методы исследования системы свертывания крови и фибринолиза

2.2.1. Определение времени свертывания крови

2.2.2. Определение времени рекальцификации плазмы

2.2.3. Определение толерантности плазмы к гепарину

Метод I. Определение толерантности к гепарину цитратной плазмы

Метод II. Определение толерантности к гепарину оксалатной плазмы

2.2.4. Определение протромбинового (тромбопластинового) времени

Метод I. Определение протромбинового времени плазмы

Метод II. Определение протромбинового времени разведенной плазмы

Метод III. Определение протромбинового времени в капиллярной крови

2.2.5. Определение фибриногена в плазме весовым методом

2.2.6. Определение фибриногена в плазме колориметрическим методом

2.2.7. Определение фибриногена Б в плазме

2.2.8. Определение содержания фактора VIII в плазме, антигемофильных препаратах

2.2.9. Определение активности фактора XIII в плазме ускоренным методом

2.2.10. Определение фибринолитической активности методом лизиса эуглобулинов плазмы

 

3. БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Методы исследования безбелковых азотистых компонентов

3.1.1. Определение мочевины в сыворотке крови уреазным методом по реакции с фенол-гипохлоритом

3.1.2. Определение мочевины в сыворотке крови экспресс-методом с применением реактивной бумаги "Уреатест"

3.2. Методы исследования углеводного обмена

3.2.1. Определение глюкозы в крови, плазме (сыворотке), спинномозговой жидкости глюкозооксидазным методом

3.3. Методы исследования липидного обмена

3.3.1. Определение общих липидов в сыворотке крови по цветной реакции с сульфофосфорно-ванилиновым реактивом

3.3.2. Определение триглицеридов в сыворотке крови по цветной реакции с хромотроповой кислотой

3.3.3. Определение бета-липопротеидов в сыворотке крови турбидиметрическим методом

3.4. Методы исследования минерального обмена

3.4.1. Определение железа в сыворотке крови по цветной реакции с батофенантролином

3.4.2. Определение магния в сыворотке крови (плазме) по цветной реакции с титановым желтым

3.4.3. Определение магния в сыворотке (плазме) крови и моче по цветной реакции с магоном

3.4.4. Определение калия в биологических жидкостях методом пламенной фотометрии

3.4.5. Определение натрия в биологических жидкостях методом пламенной фотометрии

3.5. Методы исследования активности ферментов

3.5.1. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови, моче и дуоденальном содержимом амидопластическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея)

3.5.2. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по реакции с 2,4 динитрофенилгидразином (метод Севела, Товарек)

3.5.3. Определение активности сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела, Товарек)

3.5.4. Определение активности трипсина в биологических жидкостях с субстратом Nальфа-бензоил-dl-аргинин-p-нитроанилид (метод Эрлангера в модификации Шатерникова)

3.5.5. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови колориметрическим методом по гидролизу ацетилхолинхлорида

3.5.6. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови экспресс-методом с применением индикаторной бумаги (метод Герцфельда и Штрумпфа в модификации Децика и Туркевича)

3.5.7. Обнаружение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов (проба Бернштейна)

 

4. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Изоиммунология (изосерология)

4.1.1. Определение групп крови системы АВО при помощи стандартных сывороток

4.1.2. Определение групп крови системы АВО перекрестным способом при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов

4.1.3. Определение резус-фактора методом агглютинации в солевой среде в пробирках

4.1.4. Определение резус-фактора методом конглютинации с применением желатины

4.1.5. Определение резус-фактора методом конглютинации в сывороточной среде на чашках Петри

4.1.6. Определение резус-фактора на плоскости при комнатной температуре с помощью сывороток, приготовленных на альбумине или полиглюкине (экспресс-метод)

4.1.7. Исследование сыворотки крови на наличие полных резус-антител методом агглютинации в солевой среде в пробирках

4.1.8. Исследование сыворотки крови на наличие неполных резус-антител методом конглютинации с применением желатины

4.1.9. Исследование сыворотки крови на наличие неполных резус-антител непрямой пробой Кумбса

4.1.10. Определение титра полных резус-антител методом агглютинации в солевой среде в пробирках

4.1.11. Определение титра неполных резус-антител методом конглютинации с применением желатины

4.1.12. Определение титра неполных резус-антител непрямой пробой Кумбса

4.1.13. Прямая проба Кумбса

4.1.14. Определение титра антител прямой пробой Кумбса

4.2. Иммунодиагностика первичных гепатом и тератобластом

4.2.1. Определение альфа-фетопротеина человека реакцией микропреципитации в агаре

4.3. Серодиагностика сифилиса

4.3.1. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного антигена и реагина или трепонемального антигена и антитрепонемных антител исследуемой сыворотки (реакция Вассермана, качественный метод)

4.3.2. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного антигена и реагина или трепонемального антигена и антитрепонемных антител исследуемой сыворотки (реакция Вассермана, количественный метод)

4.3.3. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного антигена и реагина с использованием естественного комплемента исследуемой сыворотки (реакция Григорьева-Раппопорта)

4.3.4. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного антигена и реагина с использованием естественного комплемента и гемолизина исследуемой сыворотки (реакция Вайнштейна-Резниковой)

4.3.5. Реакция трехфазного связывания комплемента комплексом липоидного антигена и реагина исследуемой сыворотки (реакция Колмера, качественный метод)

4.3.6. Реакция трехфазного связывания комплемента комплексом липоидного антигена и реагина исследуемой сыворотки (реакция Колмера, количественный метод)

4.3.7. Осадочная реакция с образованием комплекса антигена Кана и реагина исследуемой сыворотки (реакция Кана)

4.3.8. Осадочная реакция с образованием комплекса цитохолевого антигена и реагина исследуемой сыворотки (реакция Закс-Витебского)

4.3.9. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ)

4.3.10. Реакция иммобилизации бледных трепонем меланжерным методом Овчинникова

4.3.11. Микрометод реакции связывания комплемента комплексом антигена патогенных бледных трепонем и противотрепонемных антител

4.3.12. Микрометод реакции трехфазного связывания комплемента (реакция Колмера в 1/5 объема, качественный метод)

4.3.13. Микрометод реакции трехфазного связывания комплемента (реакция Колмера в 1/5 объема, количественный метод)

4.3.14. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

4.4. Ликвородиагностика сифилиса

4.4.1. Подсчет количества форменных элементов

4.4.2. Определение общего белка

4.4.3. Определение глобулинов высаливанием (реакция Нонне-Апельта)

4.4.4. Определение глобулинов осаждением насыщенным раствором карболовой кислоты (реакция Панди)

4.4.5. Коллоидная реакция с хлорным золотом (реакция Ланге)

4.4.6. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного антигена и реагина или трепонемального антигена и антитрепонемных антител исследуемой спинномозговой жидкости (реакция Вассермана, количественный метод)

4.5. Иммунодиагностика гельминтозов

4.5.1. Определение титра антител при эхинококкозе и альвеококкозе реакцией латекс-агглютинации

Метод I. Реакция латекс-агглютинации с эхинококковым диагностикумом

Метод II Реакция латекс-агглютинации с нативным антигеном

4.5.2. Определение титра антител при трихинеллезе реакцией связывания комплемента на холоду

4.5.3. Определение титра антител при цистицеркозе реакцией связывания комплемента на холоду

 

5. КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ПАРАЗИТОЛОГИЯ

5.1. Методы исследования биологического материала на наличие простейших

5.1.1. Обнаружение простейших кишечника в фекалиях методом нативного мазка и мазка с раствором Люголя

5.1.2. Обнаружение простейших кишечника в фекалиях с применением консервантов

5.1.3. Обнаружение простейших кишечника в фекалиях методом формалин-эфирного обогащения

5.1.4. Обнаружение лейшманий в мазке костного мозга

5.1.5. Обнаружение лейшманий в мазке из кожного инфильтрата

5.1.6. Обнаружение лейшманий в соскобе пораженных тканей культуральным методом

5.2. Методы исследования биологического материала на наличие гельминтов, их фрагментов и яиц

5.2.1. Обнаружение гельминтов в фекалиях

5.2.2. Обнаружение яиц гельминтов в фекалиях методом толстого мазка (метод Като)

5.2.3. Обнаружение яиц гельминтов в фекалиях методом обогащения

5.2.4. Обнаружение яиц гельминтов в фекалиях с применением детергентов (метод Красильникова)

Метод I

Метод II

5.2.5. Обнаружение яиц гельминтов в перианально-ректальных соскобах с применением деревянного шпателя

5.2.6. Обнаружение личинок гельминтов в фекалиях (метод Бермана)

5.2.7. Обнаружение личинок гельминтов в фекалиях культивированием их на фильтровальной бумаге (метод Харада и Мори)

5.2.8. Обнаружение яиц гельминтов в дуоденальном содержимом и желчи.

 

 

 

 

 

Приложение N 2

к приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 15.10.1974 г. N 960

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ПРИМЕНЕНИЮ УНИФИЦИРОВАННЫХ КЛИНИЧЕСКИХ

ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Введение

 

Настоящим приказом вводятся в действие Методические указания по применению унифицированных методов клинических лабораторных исследований по следующим разделам: общеклинический, гематологический, биохимический, иммунологический и клиническая лабораторная паразитология.

Методические указания, утвержденные приказом Министра здравоохранения СССР N 290 от 11 апреля 1972 года, настоящим приказом не отменяются.

В дополнение к ранее утвержденным методам для ряда показателей (глюкоза, мочевина, амилаза и др.) вводятся в действие также в качестве унифицированных новые, более прогрессивные методы.

Клинико-диагностическая лаборатория может пользоваться любым унифицированным методом, однако рекомендуется постепенный переход на более прогрессивные унифицированные методы.

Общие положения, изложенные в приложении N 2 к приказу Министра здравоохранения СССР N 290 от 11 апреля 1972 года, сохраняют свою силу и для Методических указаний, утверждаемых настоящим приказом.

В настоящих Методических указаниях несколько изменена терминология с учетом решения Комиссии по унификации и контролю качества клинических лабораторных методов исследования (см. приложение N 3 к настоящему приказу).

Работа по унификации клинических лабораторных методов исследования и по составлению настоящих методических указаний проведена сотрудниками следующих учреждений:

    Всесоюзный научно-методический  центр  по  лабораторному  делу

МЗ СССР: Профессор         В.В.Меньшиков - научный руководитель,

         Канд. биол. наук  Л.Н.Делекторская,

                           Н.А.Сентебова,

                           М.Г.Москвитина,

                           С.П.Михайлова,

         Канд. мед. наук   Т.Я.Вайнштейн,

         Канд. мед. наук   Л.М.Пименова,

         Канд. мед. наук   Т.И.Лукичева,

                           Э.Г.Тебиева,

                           Д.Д.Добрянская,

    при техническом содействии Т.С.Уткиной и Н.А.Садыковой;

    Центральный Ордена Ленина институт гематологии  и  переливания

крови МЗ СССР;

    Центр по изучению и стандартизации групп крови:

    Профессор М.А.Умнова;

    Комиссия по   унификации    методов    исследования    системы

свертывания крови секции "Системы свертывания крови и фибринолиза"

при Союзной   проблемной   комиссии   болезней   системы    крови,

переливания крови и кровезаменителей МЗ СССР:

         Профессор         В.П.Балуда - председатель,

         Докт. мед. наук   Р.А.Рутберг - зам. председателя,

         Профессор         Г.В.Андреенко,

         Докт. мед. наук   К.Д.Ломазова,

         Профессор         Е.П.Степанян,

         Профессор         З.Д.Федорова;

    Институт медицинской паразитологии и тропической медицины МЗ

СССР:    Канд. мед. наук   О.Н.Келлина,

         Канд. мед. наук   Л.А.Майорова,

         Канд. биол. наук  М.М.Соловьев;

    Центральный кожно-венерологический институт МЗ СССР:

         Профессор         Н.М.Овчинников,

         Докт. мед. наук   Л.В.Сазонова,

         Докт. мед. наук   В.Н.Беднова;

    III-я кафедра терапии ЦОЛИУ врачей:

         Профессор         Л.И.Идельсон;

    Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН

СССР:    Профессор         Г.И.Абелев,

         Канд. мед. наук   А.И.Гусев,

         Канд. биол. наук  С.Д.Перова,

         Канд. биол. наук  А.К.Язова.

    Работа проводилась  под  руководством Комиссии по унификации и

контролю качества клинических лабораторных методов исследования:

         Профессор         В.В.Меньшиков - председатель,

         Канд. мед.  наук  И.С.Балаховский -  зам. председателя  и

Консультативного совета по лабораторному делу МЗ СССР:

         Профессор         В.Т.Морозова - председатель,

при содействии Всесоюзного научного общества врачей - лаборантов:

         Профессор         А.С.Петрова - председатель,

    В рецензировании   Методических   указаний   приняли   участие

сотрудники:

    Клинических кафедр I ММИ им. И.М.Сеченова;

    кафедры клинической лабораторной диагностики ЦОЛИУ врачей;

    Центрального       научно-исследовательского         института

гастроэнтерологии;

    Московского областного научно-исследовательского  клинического

института им. М.Ф.Владимирского;

    Института кардиологии МЗ Армянской ССР;

    Государственного    научно-исследовательского   института   по

стандартизации и контролю лекарственных средств МЗ СССР;

    Лаборатории гастроэнтерологии    Института    акушерства     и

гинекологии АМН СССР;

    Казахского научно-исследовательского  института  эпидемиологии

и микробиологии МЗ Казахской ССР;

    Научно-исследовательского института медицинской  паразитологии

и тропической медицины им. С.М.Кирова МЗ Азербайджанской ССР;

    Научно-исследовательского института медицинской  паразитологии

и тропической медицины им. С.С.Вирсаладзе МЗ Грузинской ССР;

    Ленинградского научно-исследовательского института гематологии

и переливания крови МЗ РСФСР;

    Научно-исследовательского  института  инфекционных болезней МЗ

УССР.

 

I. ОБЩЕКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

1.1. ИССЛЕДОВАНИЕ СЕКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ЖЕЛУДКА

 

1.1.1. Раздражители желудочной секреции

 

Применяются парэнтеральные и энтеральные раздражители.

Парэнтеральные раздражители. Из парэнтеральных раздражителей желудочной секреции рекомендуется применять гистамин, солянокислый или фосфорнокислый.

Метод субмаксимальной стимуляции гистамином. Солянокислый гистамин вводят подкожно из расчета 0,008 мг/кг веса пациента, фосфорнокислый гистамин - 0,01 мг/кг веса. Секреторный эффект гистамина проявляется через 7-10 минут, достигает максимума через 45-60 минут и продолжается 1-1,5 часа, постепенно убывая в интенсивности.

Метод максимальной стимуляции гистамином по Кею. Солянокислый гистамин вводят из расчета 0,024 мг/кг, фосфорнокислый гистамин - 0,04 мг/кг веса пациента. При применении максимальной стимуляции гистамином обязательно за 30 мин. до введения раздражителя вводят антигистаминные препараты (2 мл 2% раствора супрастина).

 

Энтеральные раздражители. Из энтеральных раздражителей желудочной секреции рекомендуется применять 7% отвар сухой капусты.

Приготовление отвара сухой капусты. 21 г сухой капусты заливают 300 мл воды, кипятят 30-40 мин. до получения общего объема отвара около 300 мл. Отвар фильтруют через 2 слоя марли, разливают в прокипяченую посуду и хранят в холодильнике.

Перед употреблением отвар оттитровывают: к 10 мл отвара прибавляют 1-2 капли фенолфталеина и титруют 0,1М раствором едкого натра до изменения окраски (потемнения). Так как отвар до титрования окрашен, то титруют на белом фоне, сравнивая с первоначальной окраской отвара.

Титр отвара капусты выражают в условных единицах. Одна титрационная единица равна 1 мл 0,1н раствора едкого натра, пошедшему на титрование 100 мл желудочного содержимого, и соответствует концентрации соляной кислоты, равной 1 мэкв/л. Титр капустного отвара не должен превышать 20 единиц (20 мэкв/л). Если титр выше, то отвар разводят кипяченой водой.

 

1.1.2. Фракционный метод извлечения желудочного содержимого

с применением тонкого зонда

 

Тонкий зонд представляет резиновую трубку, толщиной около 5 мм, диаметром просвета - 2-3 мм, длиной 1,2-1,5 м. На расстоянии 1,5-3,5 см от слегка заостренного конца имеются два отверстия, через которые происходит аспирация желудочного содержимого. Для ориентировки места нахождения зонда в желудке зонд имеет две метки: одна - на расстоянии 50-55 см и другая - на расстоянии 70-75 сантиметров от заостренного конца зонда. Введение зонда до 1-й метки свидетельствует о нахождении внутреннего конца в области дна желудка, а продвижение зонда до 2-й метки - о нахождении его в области привратника желудка.

Тонкий зонд стерилизуют кипячением в течение 20 минут.

Метод извлечения. Пациенту натощак, после 14-часового голодания, вводят в желудок тонкий зонд до первой метки. При помощи шприца извлекают все содержимое. Получают "натощаковую" порцию желудочного содержимого. Затем в течение часа, через каждые 15 минут производят забор четырех порций желудочного содержимого ("базальная секреция"). После этого вводят раздражитель.

При применении энтерального раздражителя через 25 минут откачивают все содержимое желудка. После этого в течение часа, через каждые 15 минут производят забор четырех порций желудочного содержимого.

При применении парэнтерального раздражителя, сразу же в течение часа, через каждые 15 минут производят забор четырех порций желудочного содержимого. Это соответствует "часовому напряжению секреции" после раздражителя. Затем зонд извлекают из желудка.

Примечания.

1. При большом контингенте пациентов возникает необходимость в исследовании нескольких человек одновременно. С этой целью удобно использовать аспирационный вакуум-отсос. При применении вакуум-отсоса извлечение желудочного содержимого происходит непрерывно, но порции собирают раздельно, через каждые 15 минут, аналогично вышеописанному способу: в течение часа до введения раздражителя и в течение часа после введения раздражителя.

2. Фракционный метод извлечения желудочного содержимого предусматривает обязательное исследование базальной секреции и секреции после введения раздражителя. Базальная и стимулированная секреция изучаются в течение часа. Это облегчает сопоставление соответствующих показателей секреции, поскольку они получены за равные промежутки времени.

3. В случае отсутствия стимулирующего эффекта на желудочную секрецию при применении капустного отвара целесообразно повторить зондирование с применением субмаксимальных или максимальных доз гистамина.

 

1.1.3. Определение кислотности желудочного содержимого

 

Принцип. Желудочное содержимое титруют 0,1н раствором едкого натра в присутствии индикаторов.

Реактивы.

1. 1% спиртовой раствор фенолфталеина. Интервал перехода окраски в рН - 8,2-10. Стабилен при хранении при комнатной температуре.

2. 0,5% спиртовой раствор 4-диметиламиноазобензола (метиловый желтый, диметиловый желтый). Интервал перехода окраски в рН - 2,9-4,0. Стабилен при хранении при комнатной температуре.

3. 1% водный раствор ализаринсульфоновокислого натрия (ализариновый красный С/S/). Интервал перехода окраски в рН - 4,3-6,3. Стабилен при хранении при комнатной температуре.

4. 0,1н раствор едкого натра.

Специальное оборудование.

Бюретки на 25 мл, 50 мл или 100 мл.

Колбы конические на 50 мл.

Ход определения. В две колбы наливают по 5 мл профильтрованного желудочного содержимого. В первую - добавляют 1-2 капли 1% спиртового раствора фенолфталеина и 1-2 капли 0,5% спиртового раствора диметиламиноазобензола. Во вторую - 1-2 капли ализаринсульфоновокислого натрия. Титруют 0,1н раствором едкого натра при постоянном помешивании.

В процессе титрования желудочное содержимое меняет окраску.

В первой порции отмечают:

1) количество щелочи, пошедшей на титрование до перехода первоначального красного цвета в желто-розовый ("цвет семги"). Это соответствует количеству свободной соляной кислоты и выявляется индикатором диметиламиноазобензолом.

2) общее количество щелочи, пошедшее на титрование до перехода окраски в стойкий красный цвет. Это соответствует общей кислотности и выявляется индикатором фенолфталеином.

Во второй порции отмечают количество щелочи, пошедшей на титрование от перехода первоначальной желтой окраски в фиолетовую. Это соответствует сумме всех кисло реагирующих веществ, кроме связанной соляной кислоты, и выявляется индикатором ализаринсульфоновокислым натрием.

В каждой порции извлеченного желудочного содержимого определяют свободную соляную кислоту, общую кислотность и - в случае необходимости - связанную соляную кислоту.

Расчет. Кислотность желудочного содержимого определяют по количеству миллилитров 0,1н раствора едкого натра, пошедшему на титрование 100 мл желудочного содержимого (условные титрационные единицы). Так как для титрования берут 5 мл желудочного содержимого, а расчет ведут на 100 мл, то количество потраченной щелочи умножают на 20. Одна титрационная единица соответствует концентрации соляной кислоты, равной 1 мэкв/л.

Пример расчета. Первая порция:

1. 1,5 мл 0,1 н NaOH (желто-розовый цвет) - 1,5х20 = 30 титр. ед. (30 мэкв/л). Свободная соляная кислота.

2. 2,6 мл 0,1 н NaOH (красный цвет) - 2,6х20 = 52 титр. ед. (52 мэкв/л). Общая кислотность.

 

Вторая порция:

2,0 мл 0,1 н NaOH (фиолетовый цвет) - 2,0х20 = 40 титр. ед. (40 мэкв/л). Все кисло реагирующие вещества, кроме связанной соляной кислоты.

52 - 40 = 12 титр. ед. (12 мэкв/л). Связанная соляная кислота.

Для более объективной оценки кислотообразующей функции желудка введено понятие "дебит-час". Дебит - час характеризует количество соляной кислоты, выделившееся за час и выраженное в миллиэквивалентах. Дебит-час соляной кислоты в миллиэквивалентах рассчитывают по формуле:

Д = V1 х E1 х 0,001 + V2 х E2 х 0,001 + V3 х E3 х 0,001 +

где V - объем порции желудочного содержимого в миллилитрах,

E - концентрация соляной кислоты в титрационных единицах в той же порции,

0,001 - количество миллиэквивалентов соляной кислоты в 1 мл желудочного содержимого при концентрации ее, равной одной титрационной единице.

Число слагаемых в формуле определяется тем, сколько порций желудочного содержимого получено за время исследования. Если рассчитывают "дебит-час", то число слагаемых - 4.

Поскольку величина дебит-часа зависит от часового напряжения секреции и величины кислотности, то следует стремиться к наиболее полному извлечению желудочного содержимого.

Нормальные величины базальной секреции.

    Часовой объем желудочного сока        - от 50 до 100 мл

    Общая кислотность                     - от 40 до 60 титр. ед.

                                            (40-60 мэкв/л)

    Свободная соляная кислота             - от 20 до 40 титр. ед.

                                            (20-40 мэкв/л)

    Дебит-час соляной кислоты             - от 1,5 до 5,5 мэкв

    Дебит-час свободной соляной кислоты   - от 1,0 до 4 мэкв

 

    Нормальные величины  секреторной  реакции  желудка  на пищевые

пробные раздражители

    Часовой объем желудочного сока        - от 50 до 110 мл

    Общая кислотность                     - от 40 до 60 титр. ед.

                                            (40-60 мэкв/л)

    Свободная соляная кислота             - от 20 до 40 титр. ед.

                                            (20-40 мэкв/л)

    Дебит-час соляной кислоты             - от 1,5 до 6 мэкв

    Дебит-час свободной соляной кислоты   - от 1,0 до 4,5 мэкв

 

    Нормальные величины    секреторной    реакции    желудка    на

субмаксимальную гистаминовую стимуляцию

    Часовой объем желудочного сока        - от 100 до 140 мл

    Общая кислотность                     - от 80 до 100 титр. ед.

                                            (80-100 мэкв/л)

    Свободная соляная кислота             - от 65 до 85 титр. ед.

                                            (65-85 мэкв/л)

    Дебит-час соляной кислоты             - от 8 до 14 мэкв

    Дебит-час свободной соляной кислоты   - от 6,5 до 12 мэкв

 

1.1.4. Определение активности пепсина в желудочном

содержимом с использованием в качестве

субстрата сухой плазмы

(метод Туголукова)

 

Принцип. Сухая плазма человека расщепляется пепсином. Об активности фермента судят по количеству субстрата, не подвергшегося ферментативной реакции.

Реактивы.

1. 2% раствор сухой плазмы на 0,1н растворе соляной кислоты (сухую плазму можно получить на станциях переливания крови).

2. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.

 

Специальное оборудование.

Центрифужные пробирки с оттянутым и градуированным нижним концом.

Ход определения. Опытная проба. 1 мл профильтрованного и предварительно разведенного 1:100 дистиллированной водой желудочного содержимого вносят в специальную центрифужную пробирку. Добавляют 2 мл 2% раствора плазмы. Инкубируют 20 час при 37 град. С. После инкубации добавляют 2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Тщательно перемешивают до получения однородной суспензии. Центрифугируют 10 мин. при 1.500 об/мин. Измеряют величину осадка в пробирке.

Холостую пробу ставят как опытную, но используют предварительно прокипяченое желудочное содержимое.

Расчет. Активность пепсина выражают в мг%. Расчет производят следующим образом:

                                           40

    Показатель переваривания   = (А - В) х --,

    субстрата (М)                          А

 

    где: А - величина осадка в холостой пробе,

         В - величина осадка в опытной пробе,

         40 - постоянная  величина,  выведенная  экспериментальным

              путем.

 

Таблица

 

Пересчет показателей переваривания белкового субстрата

(раствора сухой плазмы)

на содержание пепсина в желудочном содержимом

 

┌─────────────────┬─────────────┬────────────────┬───────────────┐

│    Показатель   │  Содержание │   Показатель   │  Содержание   │

│   переваривания │   пепсина   │  переваривания │    пепсина    │

│       (М)       │   (в мг%)   │       (М)      │    (в мг%)    │

├─────────────────┼─────────────┼────────────────┼───────────────┤

│       1         │   0,5       │      20        │     8,0       │

│       2         │   0,8       │      21,5      │     9,0       │

│       3         │   1,0       │      22,5      │    10         │

│       4         │   1,5       │      23        │    12         │

│       5         │   1,7       │      24        │    16         │

│       6         │   2,0       │      25        │    20         │

│       7         │   2,5       │      26        │    27         │

│       8         │   2,7       │      27        │    34         │

│       9         │   3,0       │      28        │    42         │

│      10         │   3,5       │      29        │    50         │

│      11         │   3,7       │      30        │    59         │

│      12         │   4,0       │      31        │    68         │

│      13         │   4,5       │      32        │    77         │

│      14         │   4,7       │      33        │    86         │

│      15         │   5,0       │      34        │    96         │

│      16         │   5,5       │      35        │   106         │

│      17         │   6,2       │      36        │   120         │

│      18         │   6,7       │      37        │   150         │

│      19         │   7,5       │                │               │

└─────────────────┴─────────────┴────────────────┴───────────────┘

 

    Нормальные величины:   концентрация   пепсина   в   содержимом

желудка,

                         полученном натощак         - 0-21 мг%

                         после раздражителя         - 20-40 мг%

    Дебит-час пепсина в базальной секреции          - 10-40 мг

    Дебит-час пепсина в субмаксимальной гистаминовой

           стимуляции                               - 50-90 мг

 

1.1.5. Определение активности пепсина в желудочном содержимом

с использованием в качестве субстрата гемоглобина

(метод Ансона в модификации Черникова)

 

Принцип. Гемоглобин гидролизуется пепсином. Об активности фермента судят по концентрации образовавшихся в процессе ферментативной реакции продуктов гидролиза, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой.

Реактивы.

1. 0,1М глициновый буфер, рН-1,5. 7,505 г глицина и 6,85 г хлористого натрия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем дистиллированной водой до метки. 33 мл этого раствора смешивают с 67 мл 0,1н раствора соляной кислоты, проверяют рН. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

2. 0,1н раствор соляной кислоты.

3. 1% раствор гемоглобина в 0,1М глициновом буфере. Хранят в холодильнике. Годен в течение недели.

4. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.

5. Кристаллический пепсин.

Калибровочные растворы пепсина. Основной раствор: 7,5 мг пепсина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят дистиллированной водой до метки. Получается раствор, содержащий 7,5 мкг/мл пепсина. Рабочие растворы готовят разведением основного раствора дистиллированной водой в 2, 4, 8 раз и получают растворы с содержимым пепсина 3,75 мкг/мл, 1,87 мкг/мл и 0,94 мкг/мл.

Специальное оборудование.

Спектрофотометр.

Секундомер.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытные пробы. В центрифужные пробирки наливают 1 мл раствора гемоглобина и 1 мл разведенного в 10 или 100 раз желудочного содержимого. Инкубируют 10 мин. (точно по секундомеру) при 37 град. С. Затем добавляют 3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре на 1 час. Центрифугируют в течение 10 минут при 1.500 об/мин. Измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 280 нм против дистиллированной воды.

Холостую пробу ставят как опытную, но трихлоруксусную кислоту добавляют до инкубации.

Расчет ведут по калибровочному графику. Активность пепсина выражают в мкг на 1 мл желудочного содержимого.

Построение калибровочного графика. Калибровочные пробы ставят как опытные, но вместо желудочного содержимого добавляют по 1 мл соответствующего раствора пепсина.

Из экстинкции калибровочных проб вычитают экстинкцию холостой пробы. На оси ординат откладывают полученную разницу экстинкции, на оси абсцисс - содержание пепсина в мкг/мл.

Для вычисления активности пепсина в желудочном содержимом значения, полученные по калибровочному графику, умножают на разведение желудочного содержимого.

Нормальные величины активности пепсина должны быть выведены на донорах в каждой лаборатории, так как они зависят от активности кристаллического пепсина, используемого для построения калибровочного графика.

 

Литература.

1. Бокуняева Н.И., Золотницкая Р.П. В кн.: Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е.А.Кост. М., 1968, 29-295.

2. Методическое письмо: Исследование желудочной секреции у гастроэнтерологических больных в поликлинических условиях. Всесоюзный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии МЗ СССР, Калужская городская больница им. Красного Креста. Калуга, 1972.

3. Покровский А.А. - В кн.: Биохимические методы исследования в клинике. М., 1969, 197.

4. Туголуков В.Н. - Современные методы функциональной диагностики состояния слизистой оболочки желудка и их клиническое значение. М., 1965, 108.

5. Фишзон-Рысс Ю.И. - Современные методы исследования желудочной секреции. Л., 1972.

6. Anson M.L. - Y.Gen. Physiol., 1939, 22, 79.

 

2. ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

2.1. МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ

 

2.1.1. Определение гемоглобина крови гемиглобинцианидным

методом с применением ацетонциангидрина <*>

--------------------------------

<*> На период соответствующего технического обеспечения лабораторий допустимо использование ранее применявшегося метода Сали.

 

Принцип. Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид), интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина.

 

    Реактивы.

    1. Трансформирующий раствор:

    ацетонциангидрин            - 0,5 мл

    калий железосинеродистый    - 200 мг

    (красная кровяная соль)

    натрий двууглекислый

    (бикарбонат натрия)         - 1 г

    дистиллированная вода       - до 1,0 л

 

Стабилен при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При появлении осадка или обесцвечивании раствор не пригоден для употребления.

2. Калибровочный раствор гемиглобинцианида. В качестве калибровочного раствора могут применяться стандартные растворы гемиглобинцианида производства фирм "ИМУНА" (ЧССР) и "РЕАНАЛ" (ВНР). Концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе производства фирмы "РЕАНАЛ" - 59,75 мк%, фирмы "ИМУНА" - 61,28 мг%. Это соответствует концентрации гемоглобина в крови - 15 г% и 15,? г% при разведении крови в 251 раз. Указанные стандартные растворы соответствуют международному эталонному раствору гемиглобинцианида. Стандартные растворы хранят в холодильнике при +4 град. С в защищенном от света месте (предостерегать от замерзания). Применяют в нет разбавленном виде.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр или

Гемоглобинометр.

Пипетка на 0,02 мл

Колба мерная на 1,0 л

Ход определения. Опытная проба. 0,02 мл крови приливают к 5,0 мл трансформирующего раствора (разведение в 251 раз), хорошо перемешивают, оставляют стоять 10 минут, после чего измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.

Холостая проба - трансформирующий раствор или вода.

Стандартный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида, или по формуле:

 

               Еоп

    Hb  в г% - ---- х С х К х 0,001,

               Ест

 

    где: Еоп - экстинкция опытной пробы,

         Ест - экстинкция стандартного раствора,

         С - концентрация     геминглобинцианида   в   стандартном

             растворе в мг%,

         К - коэффициент разведения крови,

         0,001 - коэффициент для пересчета мг% в г%.

 

Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице:

 

┌────────┬────────────────┬───────────────────┬──────────────────┐

│   NN   │   Стандартный  │  Трансформирующий │    Концентрация  │

│   п/п  │    раствор     │     раствор       │ гемоглобина крови│

│        │     (мл)       │       (мл)        │       (г%)       │

├────────┼────────────────┼───────────────────┼──────────────────┤

│   1    │      -         │        6          │ "холостая" проба │

│   2    │      2         │        4          │         5        │

│   3    │      4         │        2          │        10        │

│   4    │      6         │        -          │        15        │

└────────┴────────────────┴───────────────────┴──────────────────┘

 

Измеряют против холостой пробы.

Нормальные величины гемоглобина крови:

у женщин - 12,0-14,0 г%.

у мужчин - 13,0-16,0 г%.

 

Примечания.

1. Международным комитетом по стандартизации в гематологии предложен в качестве стандартного гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина с использованием трансформирующего раствора, содержащего цианистый калий. Результаты, полученные при определении гемоглобина унифицированным методом и методом, принятым Международным комитетом, совпадают (коэффициент корреляции - 0,96).

2. Измерение можно проводить на спектрофотометре при длине волны 540 нм или на гемоглобинометре.

 

Литература.

1. Кушековский М.С. - Клинические формы повреждения гемоглобина. Л., 1968.

2. Пименова Л.М., Дервиз Г.В. - В кн. "Унифицированные методы

клинических лабораторных исследований", под ред. В.В.Меньшикова, вып. 6, 1975.

 

2.1.2. Определение осмотической резистентности эритроцитов

 

Принцип. Измерение степени гемолиза эритроцитов в забуференных гипотонических растворах хлористого натрия определенной концентрации.

Реактивы.

Основной раствор (по своей осмотической концентрации соответствует 10% раствору хлористого натрия):

двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na2HPO4) - 27,31 г (или Na2HPO4 х 2H2O - 34,23 г)

однозамещенный фосфорнокислый натрий (NaH2PO4 х 2H20) - 4,86 г

хлористый натрий - 180 г

дистиллированная вода - до 2 л. рН раствора - 7,4.

Основной раствор разводят в 10 раз, получают раствор, соответствующий по осмотической концентрации 1% раствору хлористого натрия, из которого затем готовят следующие разведения: 0,85%, 0,75%, 0,70%, 0,65%, 0,60%, 0,55%, 0,50%, 0,45%, 0,40%, 0,35%, 0,30%, 0,20% 0,1% хлористого натрия. Можно готовить сразу по 100 мл рабочих растворов разных концентраций и хранить их в течение 2 недель в холодильнике.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Термостат на 37 град. С.

Пипетка на 0,02 мл.

Ход определения. В две стерильные пробирки, содержащие по 2 капли гепарина, берут по 1,5 мл крови. Одну пробирку помещают на сутки в термостат; вторую - используют в день взятия крови.

В серию центрифужных пробирок (14) разливают по 5,0 мл рабочих растворов с концентрациями от 1,0% до 0,1%. В каждую пробирку прибавляют по 0,02 мл хорошо перемешанной гепаринизированной крови, перемешивают и оставляют стоять не менее 30 мин. при комнатной температуре (20 град. С). Центрифугируют при 2.000 об/мин. в течение 5 минут. Сливают надосадочную жидкость из каждой пробирки и измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы.

Холостая проба - надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1% раствор хлористого натрия.

Расчет. За 100%-й гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1% раствор хлористого натрия. Сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости остальных пробирок с экстинкцией, принятой за 100%, вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке:

 

                             Ех х 100

                            ---------,

                                Е1

 

    где: Е1 - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке  с  0,1%

              раствором хлористого натрия,

         Ех - экстинкция исследуемой пробы,

         100 - процент  гемолиза  в  пробирке  с  0,1%   раствором

               хлористого натрия.

 

На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 часа в термостате при 37 град. С.

Нормальные величины.

 

┌──────────────────────┬─────────────────────────────────────────┐

│   Концентрация       │              %% гемолиза                │

│   хлористого натрия  ├──────────────────┬──────────────────────┤

│   (в %)              │   В свежей крови │В крови инкубированной│

│                      │                  │   в течение суток    │

├──────────────────────┼──────────────────┼──────────────────────┤

│      0,20            │      98-100      │       95-100         │

│      0,30            │      97-100      │       85-100         │

│      0,35            │      90-100      │       75-100         │

│      0,40            │      50-100      │       65-100         │

│      0,45            │       5-45       │       55-100         │

│      0,50            │       0-6        │       40-85          │

│      0,55            │        0         │       15-70          │

│      0,60            │        0         │        0-40          │

│      0,65            │        0         │        0-10          │

│      0,70            │        0         │        0-5           │

│      0,75            │        0         │         0            │

│      0,85            │        0         │         0            │

└──────────────────────┴──────────────────┴──────────────────────┘

 

Примечание. Исследуют осмотическую резистентность не только свежей крови, но и инкубированной в течение 24 часов при 37 град. С, так как в ряде случаев при микросфероцитарной гемолитической анемии понижение осмотической резистентности выявляется только в инкубированной крови.

 

Литература.

1. Идельсон Л.И. - В кн.: Справочник по функциональной диагностике. Под ред. И.А.Кассирского. М., 1970, 401.

2. Dacie Y.V. - The Haemolytic Anamias. London, 1954.

 

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ И

ФИБРИНОЛИЗА

 

2.2.1. Определение времени свертывания крови

 

Принцип. Определение времени образования сгустка венозной крови.

Реактивы. Не требуются.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Пробирки, высотой 10 см с внутренним диаметром 1 см.

Секундомер.

Ход определения. Сухой иглой, без шприца, из локтевой вены, выпустив первые капли на ватный тампон, берут кровь в 2 сухие стеклянные пробирки по 1 мл в каждую. Секундомер включают сразу же при соприкосновении крови с пробирками. Пробирки с кровью ставят в водяную баню при 37 град. С. Через 2 минуты после взятия крови, а затем через каждые 30 сек. пробирки наклоняют на 45-60 град. При этом, если кровь не свернулась, то она растекается по стенке пробирки.

Свертывание считается законченным, когда кровь не выливается при переворачивании пробирок вверх дном. В этот момент секундомер выключается.

Время свертывания выражается в минутах (среднее значение из двух определений).

Нормальные величины. Пределы колебаний времени свертывания крови в стеклянных пробирках, у здоровых людей - 5-10 минут.

 

Литература.

Lee P.Y., White P.D. - Amer. Y.Med.Sci.,1913, 145, 495.

 

2.2.2. Определение времени рекальцификации плазмы

 

Принцип. Определение времени свертывания плазмы при добавлении к ней оптимального количества хлористого кальция.

Реактивы.

1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия (оксалата натрия).

2. 0,025М раствор хлористого кальция.

3. 0,85% раствор хлористого натрия.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Секундомер.

Ход определения. Исследование проводят с плазмой, содержащей тромбоциты. Кровь у больного или донора берут в центрифужные пробирки с 1,34% раствором оксалата натрия в соотношении 9:1. Пробирки с кровью сразу же помещают в баню со льдом, затем центрифугируют 10 минут при 1.200-1.500 об/мин.

В пробирку, установленную на водяной бане при 37 град. С, наливают 0,2 мл раствора хлористого кальция и 0,1 мл 0,85% раствора хлористого натрия. Через 60 сек. в пробирку вводят 0,1 мл плазмы и включают секундомер. Определяют время свертывания плазмы. Определение повторяют 2-3 раза.

Нормальные величины. Плазма здорового человека при добавлении к ней оптимального количества раствора хлористого кальция свертывается в течение 60-120 секунд.

Укорочение времени рекальцификации плазмы указывает на повышение свертываемости крови, увеличение - на замедление.

 

Литература.

Berqerhof H.D., Roka L. - Z. Vitamin, Hormon u. Fermentforsch, 1954, 6, 1, 25.

 

2.2.3. Определение толерантности плазмы к гепарину

 

Принцип. Толерантность - это устойчивость крови к действию гепарина, понятие, обратное чувствительности. При внесении в плазму определенной концентрации гепарина время ее рекальцификации изменяется в зависимости от коагуляционной и антикоагуляционной активности крови. Если введение гепарина резко увеличивает время образования сгустка, это говорит о понижении толерантности плазмы к гепарину. Наоборот, когда внесение в исследуемую плазму гепарина не замедляет свертывания (или изменяет мало), говорят о повышенной толерантности плазмы к гепарину.

Определение толерантности плазмы к гепарину можно проводить цитратной плазмой и оксалатной плазмой.

Метод 1. Определение толерантности к гепарину цитратной плазмы.

Реактивы.

1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия (цитрата натрия).

2. Раствор гепарина "Гедеон Рихтер" (ВНР), 5.000МЕ в 1 мл.

3. 0,025 М раствор хлористого кальция.

Приготовление гепарин-кальциевой смеси. 0,05 мл раствора гепарина добавляют к 250 мл 0,025 М раствора хлористого кальция. Активность смеси меняется первые сутки, а затем в течение 14 дней остается устойчивой. Раствор готовят каждые 14 дней, хранят в холодильнике. При данной концентрации гепарина нормальное время свертывания плазмы составляет 11-16 минут.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Пробирки, высотой 12 см с внутренним диаметром 8 мм.

Секундомер.

Ход определения. Кровь у больного или у донора берут в центрифужные пробирки с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Пробирки с кровью сразу же помещают в баню со льдом, затем центрифугируют в течение 3 минут при комнатной температуре при 1.200-1.500 об/мин. 0,2 мл цитратной плазмы наливают в пробирку и помещают в водяную баню при температуре 37 град. С. Через 1 минуту инкубации добавляют 0,2 мл гепарин-кальциевой смеси, предварительно подогретой до той же температуры, и перемешивают встряхиванием. Через каждые 2-3 минуты, а в конце реакции и чаще, пробирки медленно наклоняют и отмечают время, когда смесь больше не стекает при наклоне пробирки. Обычно через 5-6 минут прозрачность плазмы изменяется, что вызывает начало свертывания пробы. Момент образования сгустка фиксируют секундомером.

Результаты выражают в минутах времени образования сгустка фибрина.

Нормальные величины для здорового человека составляют 10-16 минут (у 75% людей - 11-14 мин., у 90% - 10-16 минут).

Метод II. Определение толерантности к гепарину оксалатной плазмы.

Реактивы.

1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия (оксалата натрия).

2. Раствор гепарина "Гедеон Рихтер" (ВНР) 5000 МЕ в 1 мл.

3. 0,025 М раствор хлористого кальция.

Приготовление гепарин-кальциевой смеси. К 0,1 мл исходного раствора гепарина добавляют 9,9 мл 0,025 М раствора хлористого кальция. Затем к 2,5 мл этой смеси добавляют раствор хлористого кальция до 100 мл. Рабочий раствор гепарина готовят смешиванием равных объемов гепарин-кальциевой смеси и 0,025 М раствора хлористого кальция. Полученный раствор хранят при 4 град. С.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Секундомер.

Ход определения. Кровь у больного или у донора берут в центрифужные пробирки с 1,34% раствором оксалата натрия в соотношении 9:1. Пробирки с кровью сразу же помещают в баню со льдом, затем центрифугируют 10-15 минут при 1.500 об/мин.

В пробирку с 0,2 мл исследуемой плазмы, которая установлена на водяной бане при 37 град. С, добавляют 0,2 мл гепарин-кальциевой смеси и одновременно включают секундомер. Через 2 минуты, а затем через каждые 30 секунд, пробирку осторожно наклоняют, не встряхивая ее, приблизительно на 50-60 град. и отмечают время появления сгустка фибрина.

Результаты выражают в минутах времени образования сгустка фибрина.

Нормальные величины для здорового человека составляют от 7 до 13 минут.

Примечания.

1. Реакцию на толерантность плазмы к гепарину одновременно с кровью донора и больного производят для сравнения не реже 1 раза в неделю, а также при смене раствора гепарина.

2. Соблюдают однородность техники взятия крови.

3. Центрифугирование проб крови, взятых от больного и от донора, производят одновременно при одном и том же числе оборотов.

4. Плазму не отсасывают, а используют для реакции из пробирки с осажденными форменными элементами.

5. Определение толерантности плазмы к гепарину производят не позднее, чем через 4-6 часов после взятия крови, по методу, и 2-3 часов по методу, так как в противном случае получаются повышенные показатели толерантности плазмы к гепарину.

 

Литература.

1. Gormaen I. - Brit. Y.Hematot., 1959, 3, 257.

2. Sigg B. - Klin. Wsehr., 1952, 9/10, 205.

 

2.2.4. Определение протромбинового (тромбопластинового)

времени

 

Принцип. При избытке тромбопластина и оптимальном содержании кальция время образования сгустка в плазме зависит от активности факторов протромбинового комплекса, II, VII, IX, X.

На этом основании в реакционную смесь вводят тканевый тромбопластин и хлористый кальций. Источником фактора протромбинового комплекса является исследуемая плазма. Если в ней снижена активность одного или нескольких факторов протромбинового комплекса, то время образования сгустка в плазме будет замедлено. При достаточном содержании факторов протромбинового комплекса переходу протромбина в тромбин и действию последнего на фибриноген могут препятствовать антикоагулянты (антитромбины), в основном - гепарин, и очень низкое содержание фибриногена в плазме (ниже, чем 100 мг%). Это определяется дополнительными тестами.

Метод 1. Определение протромбинового времени плазмы.

Реактивы.

1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия или 1,34% раствор щавелевокислого натрия.

2. 0,025 М раствор хлористого кальция.

3. 1% раствор тромбопластина. При недостаточно активном тромбопластине (удлиненное протромбиновое время плазмы крови донора) используют 2% суспензию.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Секундомер.

Ход определения. Кровь у больного или донора берут в центрифужные пробирки с 1,34% раствором щавелевокислого натрия или с 3,8% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 9:1. Пробирки с кровью сразу же помещают в баню со льдом, затем центрифугируют 10 минут при 1.200-1.500 об/мин. В пробирку с 0,1 мл цитратной или оксалатной плазмы добавляют 0,1 мл раствора тромбопластина и инкубируют 1 мин на водяной бане при 37 град. С. Затем добавляют 0,1 мл 0,025 М раствора хлористого кальция в тотчас же включают секундомер. Время от момента добавления раствора хлористого кальция до образования плотного сгустка фибрина соответствует протромбиновому времени и выражается в секундах.

Метод II. Определение протромбинового времени разведенной (1:1) плазмы.

Реактивы.

1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия.

2. 0,025 М раствор хлористого кальция.

3. 1% раствор тромбопластина.

4. 0,85% раствор хлористого натрия.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Секундомер.

Ход определения. Оксалатную плазму разводят 0,85% раствором хлористого натрия 1:1. В тонкостенные пробирки наливают 0,2 мл раствора хлористого кальция и 0,1 мл суспензии тромбопластина. Смесь инкубируют 30 сек. на водяной бане при 37 град. С, затем в тромбопластин-кальциевую смесь вводят 0,1 мл исследуемой плазмы, разведенной 1:1. При введении плазмы включают секундомер. Пробирку с реагентами через каждые 12-15 секунд наклоняют на 45 град. и отмечают на секундомере время появления нитей или сгустка фибрина. Определение повторяют не менее двух раз. Разница времени в параллельных исследованиях не должна превышать 1 секунды.

Результат выражают в виде протромбиновой активности (индекса). Протромбиновую активность плазмы (ПАП) по методам I и II определяют по формуле:

 

                                А

                   ПАП (в %) = --- х 100, где:

                                В

 

А - протромбиновое время плазмы здорового человека,

В - протромбиновое время исследуемой плазмы.

Нормальные величины. Протромбиновая активность (индекс) плазмы здорового человека в среднем равна 100+/-5%. (Протромбиновое время здорового человека определяют каждый раз при работе с новой серией тромбопластина).

Метод III. Определение протромбинового времени в капиллярной крови.

Реактивы.

1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия (цитрата натрия).

2. 0,5% раствор хлористого кальция.

3. Раствор тромбопластина.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Пробирки высотой 10 см, с внутренним диаметром 1 см.

Ход определения. В микропипетку, емкостью 0,1 мл, набирают 0,02 мл раствора цитрата натрия. Мякоть пальца протирают спиртом, после высыхания спирта стерильным скарификатором делают прокол. В микропипетку набирают 0,08 мл свободно выступающей крови и немедленно выдувают в пробирки и перемешивают. Точно так же набирают цитратную кровь еще в две пробирки.

Пробирки с кровью устанавливают на водяной бане при температуре 37 град. С; через 60 сек. в пробирки добавляют по 0,1 мл раствора хлористого кальция и 0,1 мл тромбопластина. Определяют время свертывания крови.

Протромбиновую активность крови (ПАК) определяют по формуле:

 

                                А

                   ПАК (в %) = --- х 100, где:

                                В

 

А - протромбиновое время крови здорового человека,

В - протромбиновое время исследуемой крови.

Протромбиновое время крови здорового человека определяют каждый раз при работе с новой серией тромбопластина.

Нормальные величины. Протромбиновая активность крови здоровых людей равна 93-107%.

 

Литература.

1. Quick A.T. - Amer Y.Physiol., 1943, 2, 140, 212.

2. Туголуков В.Н. - О способах определения протромбина крови и применения их в клинике. Автореферат дисс. канд., Л., 1952.

3. Балуда В.П. и др. - Лабораторные методы исследования свертывающей системы крови. М., 1962, 93.

 

2.2.5. Определение фибриногена в плазме весовым методом

 

Принцип. Свертывание фибриногена плазмы хлористым кальцием, быстрое высушивание и взвешивание сгустка фибрина. Для ускорения процесса свертывания или в тех случаях, когда время рекальцификации резко изменено, используют раствор тромбина или смесь тромбопластина с хлористым кальцием.

Реактивы.

1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия (цитрата натрия).

2. 5% раствор хлористого кальция. Готовят из высушенного до постоянного веса хлористого кальция.

3. Раствор тромбопластина.

4. Раствор тромбина (активность 10 сек).

Указанные растворы тромбопластина и тромбина не должны содержать взвешенных частичек, так как это может привести к увеличению веса фибрина. Удаление мельчайших примесей из раствора тромбопластина достигают центрифугированием в течение 5 минут при 2.000 об/мин.

5. 3% раствор хлористого кальция.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Торсионные весы.

Секундомер.

Пробирки, высотой 10 см, с внутренним диаметром 1 см.

Палочки стеклянные.

Фильтры беззольные.

Ход определения. В мерную центрифужную пробирку вносят 0,3-0,5 мл раствора цитрата натрия и проколом вены набирают кровь, соответственно до 3-5 мл. Центрифугируют при 2.000 об/мин 10 мин. Плазму отсасывают и переносят в чистую сухую пробирку. Если плазма содержит даже незначительную примесь форменных элементов, ее подвергают повторному центрифугированию.

К 1 мл прозрачной плазмы добавляют 0,1 мл 5% раствора хлористого кальция, смесь перемешивают, тотчас же включают секундомер и устанавливают время свертывания. Образовавшийся фибрин наматывают на палочку, которую вынимают из пробирки только после того, как в ней закончится полностью появление даже мельчайших сгустков или нитей фибрина. Фибрин снимают с палочки с помощью беззольного фильтра. Сжатием беззольного фильтра, внутри которого находится сгусток фибрина, достигается удаление из последнего сыворотки. Сгусток последовательно перемещают по фильтру и подвергают сжатию до тех пор, пока на бумаге в проходящем свете не будет заметно следов влаги. Высушенный таким образом фибрин тотчас взвешивают на заранее уравновешенных торсионных весах (точность - до 1 мг).

В том случае, если при свертывании образуется плотный сгусток, не наматывающийся на палочку, содержимое пробирки переносят в чашку Петри или в тарелку и затем уже фибрин высушивают на бумажном фильтре, как указано выше.

Использование беззольного фильтра предотвращает попадание на фибрин бумажных волокон, что возможно при применении обычной фильтровальной бумаги.

Время свертывания плазмы 5% хлористым кальцием при комнатной температуре составляет в среднем 11,0 сек.

В тех случаях, когда требуется ускорить определение фибриногена, или когда в исследуемой плазме время рекальцификации резко замедлено, следует вместо 5% хлористого кальция пользоваться раствором тромбина или смесью тромбопластина с 3% раствором (1:1) хлористого кальция и помещать пробирку с плазмой в водяную баню при 37 град. С.

При применении раствора тромбина с активностью 10 сек. время свертывания плазмы составляет в среднем 9,6 сек.

При применении раствора тромбопластина с активностью 14-15 секунд и 3% раствора хлористого кальция время свертывания плазмы составляет в среднем 35,5 сек.

Для пересчета концентрации фибриногена в миллиграмм - проценты по сухому веществу, с учетом разведения плазмы раствором цитрата натрия, полученный вес фибрина в миллиграммах умножают на коэффициент 22,2. Коэффициент 22,2 выведен экспериментальным путем и применим только для плазмы человеческой крови.

Нормальные величины. У здоровых людей концентрация фибриногена в плазме крови колеблется в пределах 200-400 мг%.

 

Литература.

Рутберг Р.А. - Лабор. дело, 1961, 6, 6.

 

2.2.6. Определение фибриногена в плазме колориметрическим

методом

 

Принцип. Свертывание фибриногена тромбином с последующим растворением его в щелочи и определением по биуретовой реакции.

Реактивы.

1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия.

2. Тромбин, очищенный от плазминогена (активность - 7-10 секунд). НИИ эпидемиологии, микробиологии гигиены (Каунас).

3. Биуретовый реактив. В мерную колбу на 1 л к 1,5 г сернокислой меди (CuSO4 х 5H2O) добавляют 6 г сегнетовой соли (KNaC4H4O6 х 4H2O) и 500 мл дистиллированной воды. К этому раствору добавляют при постоянном помешивании 300 мл 10% раствора едкого натра и доводят дистиллированной водой до метки. Реактив хранят в парафинированной посуде при комнатной температуре.

4. Фибриноген для построения калибровочного графика.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Фотоэлектроколориметр.

Ход определения. Кровь для определения берут либо венепункцией, либо после прокола мякоти пальца. В качестве стабилизатора используют 1,34% раствор щавелевокислого натрия (I часть оксалата натрия на 9 частей крови). Кровь центрифугируют в течение 10 минут при 2.000 об/мин. Плазму отсасывают в чистую пробирку и разливают по 0,2 мл в две пробирки (для параллельных исследований). К 0,2 мл плазмы добавляют 0,1 мл раствора тромбина и инкубируют при 37 град. С в течение часа. Образовавшийся сгусток трижды промывают охлажденным физиологическим раствором, сушат на фильтровальной бумаге, помещают в пробирку, где приготовлен 1 мл 1н раствора едкого натра, прогревают для полного растворения в течение 5 минут в водяной бане при 60 град. С. Пробы охлаждают. К каждой пробе добавляют 4 мл биуретового реактива. Через 30 минут пробу колориметрируют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против дистиллированной воды.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Для определения количества фибриногена в миллиграммпроцентах предварительно строится график соотношения показателей ФЭКа и концентрации фибриногена в физиологическом растворе. Для этого используются калибровочные растворы фибриногена, начиная от 50 и до 1.000 мг%. Растворы фибриногена обрабатывают как опытные пробы, но вместо плазмы берут растворы фибриногена.

Полученные в опыте показания ФЭКа сопоставляют с калибровочным графиком и определяют таким образом содержание фибриногена в исследуемой плазме в миллиграммпроцентах.

Нормальные величины. У здоровых людей содержание фибриногена колеблется в пределах от 250 до 300 мг%.

 

Литература.

Горшкова Т.Н., Ломазова Х.Д. - Лабор. дело, 1965, 3, 167.

 

2.2.7. Определение фибриногена Б в плазме

 

Принцип. Тромбин, добавленный к плазме, переводит весь фибриноген в фибрин (проба 1); если же к плазме добавить бета-нафтол, то фибриноген Б выпадает хлопьями в осадок, а оставшийся фибриноген можно перевести в фибрин с помощью тромбина (проба 2). Разница в содержании фибрина в обеих пробах составит содержание фибриногена Б.

Реактивы.

1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия (оксалата натрия).

2. Раствор тромбина без плазминогена. 25 мг тромбина растворяют в 1 мл 0,85% раствора хлористого натрия.

3. Раствор бета-нафтола. 2 г нафтола растворяют в 100 мл 50% этилового спирта.

Специальное оборудование. Не требуется.

Ход определения. 9 частей крови смешивают с 1 частью оксалата натрия. Центрифугируют 3 минуты при 2.000 об/мин. Оксалатную плазму разливают в 2 пробирки: в первую - 0,2 мл для определения содержания общего фибриногена биуретовым методом; во вторую - помещают 0,5 мл плазмы, к которой добавляют 0,1 мл раствора бета-нафтола. Через 15 минут, когда выпадают хлопья фибриногена Б, центрифугируют 1 минуту при 1.000 об/мин. Из надосадочной жидкости (плазмы) забирают 0,2 мл и помещают в сухую пробирку для определения содержания фибриногена тем же способом, что и в первой пробе.

Расчет. Разница в содержании фибриногена в первой и во второй пробирке соответствует выпавшему в осадок фибриногену Б. Содержание фибриногена Б можно выразить либо в мг% (по разности между количеством фибриногена в первой и второй пробирке), либо в %% по отношению ко всему фибриногену по формуле:

 

                         А - В

                        ------- х 100, где

                           А

 

А - содержание фибриногена в первой пробе,

В - содержание фибриногена во второй пробе.

В норме фибриноген Б не обнаруживается, появляется при тромботических состояниях.

 

Литература.

1. Commine H.,Lyons A. - Brit.Y.Surg., - 1948, 35, 338.

2. Ломазова Х.Д. - Лабор. дело, 1971, 12.

3. Перлик Э. - Антикоагулянты. Л., 1965, 332.

 

2.2.8. Определение содержания фактора VIII

в плазме и антигемофильных препаратах

 

Принцип. Предлагаемая модификация количественного определения содержания фактора VIII основана на одноступенчатом коалин-кефалиновом методе. В качестве реагентов используют субстрат плазмы с резким дефицитом антигемофильного глобулина, но с нормальным содержанием всех остальных факторов свертывания. Для получения оптимальной среды, в которой определяют количество антигемофильного глобулина, помимо субстрат-плазмы, вводят заменитель 3-го фактора пластинок и коалин (активатор фактора контакта). Расчет концентрации искомого фактора ведут по данным, полученным при титровании различных разведений стандартной плазмы с известным содержанием антигемофильного глобулина.

Реагенты.

1. Субстрат-плазма.

2. Стандартная плазма (или исследуемая).

3. Взвесь каолина в эритрофосфатиде (заменитель 3 фактора пластинок) (С.С.Харамоненко, Минский институт переливания крови).

4. Барбиталово-солевой буфер, рН-7,5.

5. 0,033 М раствор хлористого кальция.

6. 0,9% раствор хлористого натрия.

7. 2% раствор двузамещенного лимоннокислого натрия (гидроцитрат натрия).

8. 3,8% раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия (цитрат натрия).

 

1. Получение субстрат-плазмы из крови больного гемофилией.

Субстрат-плазму получают из крови больного тяжелой формой гемофилии А, в которой содержание фактора VIII колеблется в пределах 1-3%. При подборе субстрат-плазмы показанием ее пригодности служат данные времени свертывания, полученные в тех же условиях опыта, которые применяются для определения содержания фактора VIII, за исключением того, что разведенную плазму заменяют равным количеством (0,1 мл) барбиталового буфера. Время свертывания плазмы больного гемофилией в пределах 120-135 секунд указывает на пригодность ее для использования в качестве субстрат-плазмы. Кровь стабилизируют 2% раствором гидроцитрата натрия в разведении 1:4. Центрифугируют при +2 град. С в течение 20 минут при 2.500 об/мин. Плазму отсасывают и повторно центрифугируют при тех же условиях для полного удаления клеток крови, затем отсасывают и разливают по 3-4 мл в пенициллиновые флаконы. Флаконы закупоривают и сохраняют при -30 град. С.

Для получения больших количеств субстрат-плазмы целесообразно произвести больному гемофилией с резким дефицитом АГГ в период ремиссии плазмаферез. При этом методе получают 250 мл плазмы из 500 мл консервированной крови больного. Изменений в морфологическом составе крови больного не происходит, так как форменные элементы возвращаются в кровоток в физиологически полноценном состоянии спустя 50 минут после взятия крови (400 мл цельной крови). Если нет необходимости в получении такого большого количества субстрат-плазмы, плазмаферез может быть осуществлен при изъятии любого заданного объема крови. Полученную плазму центрифугируют повторно, как указано выше, разливают по 3-4 мл в пенициллиновые флаконы, которые после укупорки сохраняют при -30 град. С.

Субстрат - плазма пригодна для определения содержания фактора VIII при хранении в течение 2-3 месяцев.

2. а) Приготовление стандартной плазмы. Кровь от 5-7 доноров стабилизируют цитратом натрия (3,8%) в разведении 1:10. От каждого донора получают по 5 мл крови и центрифугируют ее 20 минут при 2.500 об/мин. при +2 град. С. Плазму, полностью лишенную примеси клеток, отсасывают, смешивают в равных объемах, разливают по 0,5 мл в пенициллиновые флаконы, которые после укупорки хранят при -30 град. С. Стандартная плазма пригодна для использования в течение 5-7 дней.

б) Приготовление исследуемой плазмы. Кровь донора или больного с неизвестным содержанием фактора VIII стабилизируют цитратом (3,8%) в разведении 1:10 и центрифугируют в тех же условиях, что и стандартную плазму. Если нет возможности сразу произвести определение фактора VIII в исследуемой плазме, ее следует поместить в холодильник при -30 град. С.

3. Получение взвеси каолина в эритрофосфатиде. В качестве активного заменителя бета фактора пластинок применяют эритрофосфатид, полученный из эритроцитов. Он представляет собой сиропообразную вязкую эмульсию желтого цвета. Различные серии препарата содержат примерно 2,5-3,0 г эритрофосфатида в 100 мл физиологического раствора. Концентрированный препарат хранят в запаянных ампулах при +4 град. С. Из этого препарата готовят 0,1% раствор эритрофосфатида в хлористом натрии (0,9%), разливают по 1 мл в пенициллиновые флаконы и после укупорки хранят при +4 град. С. Препарат сохраняется без потери активности в течение нескольких месяцев.

Приготовление взвеси каолина в эритрофосфатиде. К 4,5 мл 0,?% раствора хлористого натрия добавляют 25 мг каолина и 0,5 мл и 0,1% раствора эритрофосфатида, смесь перемешивают в течение 10 минут на магнитной мешалке (или вручную) при комнатной температуре. Таким образом получают равномерную взвесь, содержащую 5 мг/мл каолина и 0,1 мг/мл эритрофосфатида. Во время опыта взвесь сохраняют в бане с тающим льдом. Реагент пригоден для использования в течение нескольких часов.

4. Барбиталово-солевой буфер, рН - 7,4-7,5. Хлористый натрий - 7,3 г. Веронал - 2,76 г. Мединал - 2,06 г. Бидистиллированная вода - до 1 литра.

5. 0,033М раствор хлористого кальция. 370 мг безводного хлористого кальция растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Определение содержания фактора VIII в плазме и в антигемофильных препаратах. Взвесь каолина в эритрофосфатиде, стандартную, исследуемую, субстрат-плазму и антигемофильные препараты сохраняют во время опыта в бане со льдом. Раствор хлористого кальция, 0,37%, - в бане при +37 град. С.

Подготовка реагентов. Непосредственно перед определением флаконы с плазмой или препаратами погружают для оттаивания на 1-2 минуты в баню при +37 град. С. После оттаивания они должны быть абсолютно прозрачными. Затем приступают к разведению стандартной, исследуемой плазмы и антигемофильных препаратов с помощью барбиталового раствора.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят последовательно: 0,1 мл тщательно перемешанной взвеси каолина в эритрофосфатиде, 0,1 мл субстрат-плазмы и 0,1 мл стандартной либо исследуемой плазмы, либо антигемофильного препарата соответствующих разведений. Пробирку помещают в баню при 37 град. С для инкубации в течение 6 минут. Точно в конце 6-ой минуты добавляют 0,1 мл раствора хлористого кальция (находящегося в бане при 37 град. С), перемешивают, тотчас же включают секундомер и определяют время образования плотного сгустка. Точно так же проводят определение еще в двух параллельных пробах. Для максимального сокращения времени целесообразно добавлять реагенты в каждую следующую пробу с интервалом в 90 секунд.

Расчет концентрации искомого фактора ведется по таблице, которая составлена на основании данных, полученных при титровании различных разведений стандартной плазмы с известным содержанием фактора VIII.

По условиям, принятым для данной модификации метода, время свертывания стандартной плазмы в разведении 1:10 должно быть постоянным и равняться 65 секундам, что достигается за счет изменения концентрации эритрофосфатида.

При определении стандартной точки (65 сек.) требуется совпадение значений трех параллельных проб.

Аналогичным образом проводят определение содержания фактора VIII для всех последующих разведений стандартной плазмы. Для этого готовят следующий ряд разведений стандартной плазмы с помощью барбиталового буфера:

 

NN проб	1	2	3	4	5	6	7
Разведение	1:5	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320

 

Каждое последующее разведение готовят из предыдущего непосредственно перед употреблением. При правильном определении полученные экспериментальные значения для каждого разведения стандартной плазмы наклеиваются на теоретически рассчитанную прямую (отклонения в пределах 0-3,8%).

Экстраполируя данные времени свертывания с интервалом в 1 сек. на прямую, полученную на двойной логарифмической шкале, определяют соответствующие им концентрации фактора VIII в %%, которые представлены в таблице:

 

Зависимость времени свертывания от содержания

фактора VIII в %%

 

┌─────────┬───────────┬─────────┬───────────┬─────────┬───────────┐

│Время    │           │Время    │           │Время    │           │

│свертыва-│Фактор VIII│свертыва-│Фактор VIII│свертыва-│Фактор VIII│

│ния в се-│    в %    │ния в се-│    в %    │ния в се-│    в %    │

│кундах   │           │кундах   │           │кундах   │           │

├─────────┼───────────┼─────────┼───────────┼─────────┼───────────┤

│   55    │   255     │    83   │    27     │   111   │    3,9    │

│   56    │   235     │    84   │    25     │   112   │    3,67   │

│   57    │   215     │    85   │    23     │   113   │    3,47   │

│   58    │   200     │    86   │    22     │   114   │    3,28   │

│   59    │   177     │    87   │    21     │   115   │    3,11   │

│   60    │   160     │    88   │    19     │   116   │    2,94   │

│   61    │   146     │    89   │    17,5   │   117   │    2,8    │

│   62    │   136     │    90   │    16     │   118   │    2,64   │

│   63    │   124     │    91   │    15     │   119   │    2,5    │

│   64    │   115     │    92   │    14     │   120   │    2,38   │

│   65    │   100     │    93   │    12,5   │   121   │    2,25   │

│   66    │    96     │    94   │    11,5   │   122   │    2,14   │

│   67    │    90     │    95   │    10,5   │   123   │    2,04   │

│   68    │    81     │    96   │    10     │   124   │    1,98   │

│   69    │    74     │    97   │     9     │   125   │    1,84   │

│   70    │    68     │    98   │     8,25  │   126   │    1,75   │

│   71    │    64     │    99   │     7,75  │   127   │    1,66   │

│   72    │    59     │   100   │     7,5   │   128   │    1,58   │

│   73    │    55     │   101   │     6,75  │   129   │    1,5    │

│   74    │    52     │   102   │     6,5   │   130   │    1,44   │

│   75    │    50     │   103   │     6,25  │   131   │    1,37   │

│   76    │    44     │   104   │     5,86  │   132   │    1,3    │

│   77    │    42     │   105   │     5,5   │   133   │    1,24   │

│   78    │    38     │   106   │     5,2   │   134   │    1,19   │

│   79    │    35     │   107   │     4,9   │   135   │    1,13   │

│   80    │    33     │   108   │     4,62  │   136   │    1,08   │

│   81    │    30     │   109   │     4,35  │   137   │    1,03   │

│   82    │    29     │   110   │     4,1   │   137,7 │    1,0    │

└─────────┴───────────┴─────────┴───────────┴─────────┴───────────┘

 

Контроль реагентов. Контроль реагентов необходим для создания стандартных условий при определении концентрации фактора VIII и, как показал опыт, чрезвычайно важен для получения правильного значения этого фактора в исследуемых пробах и для использования данных таблицы при вычислении процентного содержания в них антигемофильного глобулина.

Ежедневно, перед началом титрования фактора VIII, необходимо проверять соответствие реагентов требованиям метода. Для этого определяют время свертывания стандартной плазмы в разведении 1:10. Если оно равно 65 сек., готовят еще одно разведение стандартной плазмы (1:60 или 1:80). В том случае, когда для разведения стандартной плазмы 1:10 полученные значения несколько больше или меньше 65 сек., подбирают необходимую концентрацию эритрофосфатида, изменяя его содержание во взвеси с каолином, в пределах 0,2-0,075 мг/мл. Совпадение полученных значений для двух разведений стандартной плазмы (1:10 и 1:80 или 1:60) позволяет приступить к определению содержания фактора VIII в исследуемой плазме или в антигемофильных препаратах.

Для титрования плазмы крови доноров или при определении содержания фактора VIII больных гемофилией пользуются разведением 1:10 и по времени свертывания определяют по таблице соответствующее им содержание фактора VIII в %. Концентраты АГГ (криопреципитат и др.) обычно разводят 1:100 или 1:200. Поэтому полученные по таблице значения умножают соответственно на 10 или на 20 и определяют таким образом содержание в них фактора VIII в %.

Содержание АГГ в плазме и ее препаратах можно рассчитать не только в %, но и в единицах активности по следующей формуле:

 

                        Содержание           Объем исследуемой

    Содержание          фактора VIII в %  х  плазмы или препарата

    фактора VIII в   = -------------------------------------------

    един. активности                      100

 

За 1 ед активности АГГ принимают количество фактора VIII в плазме 100% активности.

Нормальные величины составляют 50-200%, в среднем - 100%.

 

Литература.

1. Breckenridge R.T., Rathoff O.D. - Blood, 1962, 15, 637.

2. Рутберг Р.А. - Лабор. дело, 1972, 11, 658.

3. Инструкция по применению плазмафереза, 1972.

 

2.2.9. Определение активности фактора XIII в плазме

ускоренным методом

 

Принцип. Фактор XIII в процессе свертывания крови превращает растворимый фибрин (S) в окончательный нерастворимый фибрин (i). Принцип основан на определении времени растворения сгустка фибрина в растворе кислой щавелевокислой мочевины при добавлении к реагирующей смеси монойодуксусной кислоты, которая блокирует активность фактора XIII. Время растворения сгустка зависит от активности фактора XIII исследуемой плазмы. Применение в качестве растворителя кислой щавелевокислой мочевины позволяет в течение короткого времени (30-40 мин. с момента взятия крови) определить активность фактора XIII.

Реактивы.

1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия.

2. 0,5% раствор монойодуксусной кислоты.

3. 0,025М раствор хлористого кальция.

4. 0,12% раствор кислой щавелевокислой мочевины.

Специальное оборудование. Не требуется.

Ход определения. К 0,2 мл оксалатной плазмы добавляют 0,1 мл раствора монойодуксусной кислоты и 0,4 мл раствора хлористого кальция. Перемешивают встряхиванием и оставляют на 20 минут при комнатной температуре. К образовавшемуся сгустку добавляют 2,0 мл раствора кислой щавелевокислой мочевины. Определяют время полного растворения фибринового сгустка при постоянном встряхивании. Определение проводят параллельно в двух пробирках для каждой пробы и вычисляют среднее время.

Расчет. Активность фактора XIII исследуемой плазмы определяют по формуле

 

                   А

             АФ = --- х 100, где:

                   В

 

А - время лизиса фибрина исследуемой плазмы,

В - время лизиса фибрина здоровых людей.

Нормальные величины. Лизис сгустка происходит в течение 70,6+/-15 секунд, что равно 100%.

Примечание. При резком нарушении первой фазы процесса свертывания крови (гемофилии) для образования сгустка необходимо добавить кроме хлористого кальция 0,1 мл тромбина (активность - 20 сек).

 

Литература.

Балуда В.П., Жукова Н.А., Руказенкова Ж.Н. - Лабор. дело, 1965, 7, 417.

 

2.2.10. Определение фибринолитической активности

методом лизиса эуглобулинов плазмы

 

Принцип. Время лизиса сгустка, полученного из эуглобулиновой фракции плазмы, характеризует фибринолитическую активность плазмы, освобожденную от ингибиторов.

Реактивы.

1. 1,42% раствор щавелевокислого аммония или 1,34% раствор щавелевокислого натрия.

2. 1% раствор уксусной кислоты.

3. Боратный раствор. 9 г хлористого натрия и 1 г бората натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

4. 0,025М раствор хлористого кальция.

Специальное оборудование.

Водяная баня.

Ход определения. Кровь, взятую из вены (без жгута), смешивают с антикоагулянтом в соотношении 9:1, центрифугируют 10 мин. при 1.500 об/мин. Кровь до центрифугирования хранят в бане со льдом.

В пробирку наливают 0,5 мл плазмы, 8 мл дистиллированной воды, смешивают, добавляют 0,15 мл 1% раствора уксусной кислоты (рН смеси при этом - 5,3), оставляют на 30 мин. при 4 град. С; центрифугируют при 1.500 об/мин. в течение 5 минут, сливают надосадочную жидкость и удаляют остатки жидкости, опрокинув пробирку на фильтровальную бумагу.

Осадок эуглобулинов растворяют в 0,5 мл боратного раствора. Две пробы раствора по 0,2 мл переносят в пробирки, диаметром 10 мм, и опускают в баню при 37 град. С. Через 1 минуту к каждой пробе добавляют по 0,2 мл раствора хлористого кальция. Через несколько минут образуется сгусток. Время лизиса определяется как момент полного исчезновения (растворения) сгустка.

Нормальные величины - составляют 183-263 минуты.

 

Литература.

Kovalski E., Koper M., Niewiarowski S. - Y.Clin. Pathol., 1959, 12, 215.

 

3. БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

3.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЗБЕЛКОВЫХ АЗОТИСТЫХ КОМПОНЕНТОВ

 

3.1.1. Определение мочевины в сыворотке крови

уреазным методом по реакции с фенол-гипохлоритом

 

Принцип. Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак. Аммиак определяют колориметрически по образованию окрашенных продуктов с гипохлоритом и фенолом.

Реактивы.

1. Раствор ЭДТА - динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон "В"). 1 г ЭДТА растворяют в 90 мл дистиллированной воды, доводят рН до 6,05н раствором едкого натра и доливают водой до 100 мл. Раствор используют для приготовления раствора уреазы.

2. Раствор уреазы, рН-6,0. 0,02 г уреазы растворяют в 50 мл раствора ЭДТА, проверяют рН. Отечественная уреаза выпускается с активностью около 370 ед Sumner на грамм белка. Уреаза с активностью 800-1.000 ед Sumner на грамм белка пригодна для реакции. Уреазу хранят в холодильнике в плотно закрытой упаковке. Раствор уреазы стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике в посуде с плотно закрытой пробкой.

3. Раствор фенола и нитропруссида натрия (цветной реактив). 0,25 г нитропруссида натрия (чда) растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл, или 54 г, фенола (чда), и доливают дистиллированной водой до 2 литров. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

4. Основной раствор гипохлорита натрия (NaOCO). 100 г хлорной извести (CaOCL2) размешивают в течение 15 минут с 170 мл дистиллированной воды, после чего прибавляют, непрерывно помешивая, раствор, состоящий из 170 мл дистиллированной воды и 70 г углекислого натрия (Na2CO3). Масса сначала густеет, затем разжижается. Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый дистиллированной водой фильтр. Хранят в холодильнике, в посуде из темного стекла. Срок годности раствора - 1-2 месяца.

Определение активности хлора. 1 мл основного раствора гипохлорита натрия смешивают с 100 мл дистиллированной воды. К 50 мл этого раствора добавляют 5,0 мл свежеприготовленного 5% раствора йодистого калия (KI) и 10 мл 6н раствора соляной кислоты. Титруют 0,1н раствором тиосульфата натрия. Как только раствор приобретает слабо желтую окраску, добавляют 10 капель 1% раствора крахмала и титруют до обесцвечивания.

Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору:

Концентрация активного хлора

в граммах на 100 мл гипохлорита натрия = а x 0,709

где: а - количество миллилитров тиосульфата натрия, пошедших на титрование,

0,709 - коэффициент пересчета 1,0 мл тиосульфата натрия в граммпроценты хлора.

После установления концентрации активного хлора основной раствор гипохлорита натрия разводят так, чтобы концентрация хлора равнялась 0,5 г на 100 мл. Раствор гипохлорита натрия с концентрацией хлора 0,5 г на 100 мл смешивают с равным объемом 5н раствора едкого натра и используют для реакции. Активность хлора проверяют не реже 1 раза в две недели.

5. 0,1н раствор тиосульфата натрия. 25 г тиосульфата натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. (Na2S2O3 x 5H2O)

6. 5н раствор едкого натра.

7. 6н раствор соляной кислоты.

8. 5% раствор йодистого калия.

9. Калибровочный раствор мочевины. 40 мг высушенной до постоянного веса мочевины растворяют в мерной колбе в 100 мл 0,2% раствора бензойной кислоты. 1 мл раствора мочевины содержит 0,4 мг мочевины. (Мочевину можно растворять в дистиллированной воде, но раствор будет менее стабилен). Раствор хранят в холодильнике.

10. 0,2% раствор бензойной кислоты. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды при интенсивном перемешивании и нагревании до полного растворения кристаллов.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Баня водяная.

Колбы мерные.

Пипетка на 0,02 мл.

Ход определения. Опытная проба. 0,5 мл раствора уреазы вносят в пробирку с притертой пробкой, добавляют 0,02 мл сыворотки. Пробирки закрывают пробками и инкубируют 15 минут при 37 град. С. После инкубации добавляют 10 мл цветного реактива (раствора фенола и нитропруссида натрия) и 1 мл раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и оставляют стоять 20 минут при 37 град. С. Через 10 минут измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Холостую пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки берут дистиллированную воду.

Калибровочную пробу обрабатывают как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях, что и опытную, против холостой пробы.

Расчет ведут по формуле:

 

                                     Е1

                     мг% мочевины = --- х 40,

                                     Е2

 

    где: Е1 - экстинкция опытной пробы,

         Е2 - экстинкция калибровочной пробы,

         40 - концентрация калибровочного раствора мочевины в %.

 

Прямолинейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией мочевины сохраняется от 0 до 200-250 мг% мочевины.

Нормальные величины - сыворотка крови - 20-50 мг% мочевины.

Для пересчета результатов на азот мочевины концентрацию мочевины в мг% делят на 2,14.

Примечания.

1. Построение калибровочного графика не рекомендуется, так как интенсивность окраски проб зависит от условий опыта. Поэтому правильнее обрабатывать калибровочные пробы одновременно с опытными и вести расчет по формуле.

2. Серия проб не должна превышать 10.

3. Если сыворотка мутная или окрашенная, то ставят дополнительную холостую пробу, в которую добавляют сыворотку и все реактивы до инкубации. Экстинкцию этой холостой пробы вычитают из опытной.

 

Литература.

1. Wetler H, - Ro. und Lab.Praxis, 1962, 15, 142.

2. Deutsches Arzneibuch, 7 Ausg. Diaqnostische Laboratoriumsmethoden, Berlin, 1968.

3. Henry R. - Clinical chemistry Principles and technics. New York, 1964, 266.

 

3.1.2. Определение мочевины в сыворотке крови

экспресс-методом с применением реактивной бумаги

"Уреатест"

 

Определение проводится строго по инструкции по применению реактивной бумаги "Уреатест".

Реактивная бумага "Уреатест" применяется для экспресс-определения содержания мочевины в сыворотке крови.

"Уреатест" представляет собой полоски хроматографической бумаги, размером 120х10 мм, пропитанные растворами фермента и индикатора. Зоны их нанесения разделены красной парафиновой полосой. При определении бумажку следует держать за свободный конец.

Метод основан на специфичном действии фермента уреазы расщеплять мочевину с выделением аммиака. Выделившийся аммиак окрашивает индикатор в голубой цвет. Высота окрашенной зоны в мм пропорциональна концентрации мочевины в мг%, что определяется по кривой, приложенной к комплекту.

С помощью реактивной бумаги можно определить от 20 до 250 мг% мочевины в сыворотке крови.

Комплект содержит 20 шт. реактивных бумажек, график и инструкцию.

Ход определения. Сыворотку крови развести дистиллированной водой 1:1.На конец бумажки, пропитанной ферментом, на расстоянии 3 мм от красной парафиновой полосы мерной пипеткой нанести 0,03 мл приготовленной сыворотки крови.

Быстро внести бумажку в чистую сухую пробирку, герметически закрыть пробкой и оставить на 20 минут при 37 град. С в термостате или на 30 минут при 20 град. С.

Затем измерить высоту индикаторной зоны, окрашенной в голубой цвет. По приложенному графику найти содержание мочевины в мг%, соответствующее результатам измерения в мм.

В случае использования крови или неразбавленной сыворотки крови результат надо делить на 2.

Хранить в сухом, темном, прохладном месте.

Срок годности 8 месяцев со дня выпуска.

Реактивная бумага разработана Рижским заводом химических реактивов и новых аналитических форм "Реагент" совместно с Республиканской клинической больницей им. П.Страдиня Латвийской ССР.

 

Литература.

Инструкция по применению реактивной бумаги "Уреатест".

 

3.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА

 

3.2.1. Определение   глюкозы   в  крови,  плазме  (сыворотке),

спинномозговой жидкости глюкозооксидазным методом

 

Принцип. Глюкоза окисляется кислородом воздуха в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода окисляет о-толидин с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы.

Реактивы.

1. Глюкозооксидаза (бета-D-глюкоза: оксидоредуктаза, 1.1.3.4.) Кристаллический препарат. Отечественная глюкозооксидаза выпускается с активностью, в основном 90-120 тыс. глюкозооксидазных единиц на 1 г препарата. Хранят в холодильнике в герметической упаковке.

2. Пероксидаза (перекись водорода: оксидоредуктаза, 1.11.1.7). Кристаллический препарат. Пероксидаза фирмы "Reanal" (ВНР) со степенью очистки 0,6 (R.Z) <*> пригодна для определения глюкозы. Хранят в холодильнике в герметической упаковке.

--------------------------------

<*> Reinheitszahl - число, характеризующее степень чистоты пероксидазы.

 

3. 0,9% раствор хлористого натрия.

4. 0,25М раствор уксуснокислого натрия. 17 г уксуснокислого натрия (NaCH3COO х 3H2O) растворяют в небольшом количестве воды в мерной колбе на 500 мл и доводят дистиллированной водой до метки.

5. 0,25М раствор уксусной кислоты. В мерную колбу на 500 мл наливают небольшое количество воды, добавляют 7,75 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки.

6. 0,25М ацетатный буфер, рН-4,8. 0,25М раствор уксуснокислого натрия смешивают с 0,25М раствором уксусной кислоты в соотношении 6:4. Проверяют рН на рН-метре. Стабилен при хранении в холодильнике в течение месяца.

7. 5% раствор сернокислого цинка. 50 г сернокислого цинка (ZnSO4 х 7H2O) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Стабилен при хранении при комнатной температуре.

8. 0,3н раствор едкого натра. Растворы сернокислого цинка и едкого натра берут для реакции в эквивалентных количествах, т.е. они должны нейтрализовать друг друга. Для этого раствор сернокислого цинка титруют раствором едкого натра до нейтральной реакции по фенолфталеину (слаборозовая окраска). Если на титрование пошло равное количество растворов, то они пригодны для реакции.

9. Орто-толидин (азоамин синий К; 3,3-диметилбензидин), чда. Имеющийся в продаже орто-толидин перекристаллизовывают из горячего абсолютного этилового спирта добавлением дистиллированной воды с последующим быстрым отсасыванием выпавших кристаллов на воронке Бюхнера и высушиванием о-толидина в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием.

10. Абсолютный этиловый спирт (коммерческий).

11. 1% раствор о-толидина в абсолютном этиловом спирте. 1 г о-толидина растворяют в небольшом количестве теплого этилового спирта. После охлаждения доводят объем этиловым спиртом до 100 мл. Стабилен в течение нескольких месяцев при хранении в холодильнике в плотно закрытой посуде из темного стекла.

12. Энзимо-хромогенный реактив. В мерную колбу на 500 мл помещают 300-400 мл 0,25М ацетатного буфера, рН-4,8, добавляют 10 мг глюкозооксидазы (навеска взята из расчета активности глюкозооксидазы - 52.000 ед. на 1 г препарата, при применении препарата с другой активностью фермента соответственно будет меняться величина навески), перемешивают до полного растворения, добавляют 5 мг пероксидазы. Смесь перемешивают до полного растворения. Добавляют 5 мл 1% раствора о-толидина и доводят объем до метки ацетатным буфером, фильтруют. Стабилен в течение 3-4 недель при хранении в холодильнике в плотно закрытой посуде из темного стекла.

Свежеприготовленный реактив бесцветен или окрашен в слабозеленый цвет. Годен к употреблению через 2 часа после приготовления. Если реактив имеет интенсивно зеленый цвет, то это свидетельствует о загрязнении о-толидина. В этом случае о-толидин необходимо перекристаллизовать.

13. 0,2% раствор бензойной кислоты. Раствор готовят при нагревании.

14. Стандартный раствор D-глюкозы в 0,2% растворе бензойной кислоты. Высушенную до полного веса при 37 град. С D-глюкозу хранят в эксикаторе. 500 мг глюкозы растворяют в мерной колбе на 100 мл в 0,2% растворе бензойной кислоты. Оставляют стоять на свету в течение 12-16 часов. 1 мл стандартного раствора содержит 5 мг глюкозы.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр или

спектрофотометр.

Секундомер.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку помещают 1,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия, добавляют 0,1 мл крови (плазмы, сыворотки, спинномозговой жидкости). Несколько раз промывают пипетку, приливают 0,4 мл 5% раствора сернокислого цинка и 0,4 мл 0,3н раствора едкого натра. Тщательно перемешивают и через 10 минут центрифугируют при 2.500 об/мин в течение 10 минут. Тотчас же сливают надосадочную жидкость.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл энзимо-хромогенного реактива, доведенного предварительно до комнатной температуры. Осторожно перемешивают и измеряют на фотоэлектроколориметре на 20-23 минуте в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 625 нм (красный светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба. К 1 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл энзимо-хромогенного реактива.

Серия не должна превышать 10-15 проб; при этом надо строго соблюдать, чтобы время с момента добавления энзимо-хромогенного реактива до измерения было во всех пробах одинаковым.

Расчет производят по формуле:

 

                            Еоп

                     Соп = ----  х Сст, где:

                            Ест

 

Соп - концентрация глюкозы в крови в мг%.

Сст - концентрация глюкозы в калибровочном растворе в мг% (100 мг%).

Еоп - экстинкция опытной пробы.

Ест - экстинкция калибровочной пробы.

от условий опыта, то калибровочную пробу ставят параллельно с опытной пробой и обрабатывают ее так же, как опытную пробу. На 1 серию ставят 1 калибровочную пробу.

Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией глюкозы сохраняется от 0 до 400 мг%.

Нормальные величины: Кровь - 56-94 мг%, в плазме и сыворотке - 55-100 мг%. Спинномозговая жидкость - 50-70 мг%.

Примечания.

1. Цельная кровь исследуется немедленно после взятия.

2. В каждую последующую пробу серии энзимо-хромогенный реактив добавляется с интервалом в 1 минуту.

3. Для получения более точных результатов время максимума окрашивания (20-23 минуты) устанавливается в каждой серии определений по нарастанию экстинкции первой опытной пробы.

4. За 3 дня до исследования исключить прием аскорбиновой кислоты, антибиотиков тетрациклинового ряда.

 

Литература.

1. Middleton Y.E., Griffith W. - Brit. Med. - Y., 1957, 2, 1525.

2. Marks V. - Clin. Chim. Acta, 1959, 4, 3, 395.

3. Лукомская И.С., Городецкий В.К. - Биохимия, 1961, т. 26, вып. 3, 477-482.

 

3.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА

 

3.3.1. Определение общих липидов в сыворотке крови по

цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом

 

Принцип. Продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом, состоящим из серной, ортофосфорной кислот и ванилина, окрашенное соединение; интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов сыворотки крови.

Реактивы.

1. Серная кислота, концентрированная, для пробы Саваля.

2. Ортофосфорная кислота, концентрированная.

3. 0,6% водный раствор ванилина. 0,6 г ванилина растворяют нагреванием на водяной бане в небольшом количестве дистиллированной воды; после охлаждения доводят объем до 100 мл. Стабилен при хранении при комнатной температуре.

4. Фосфорнованилиновая смесь. 4 части концентрированной ортофосфорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6% раствора ванилина. Смесь хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

5. Хлороформ, хч или для наркоза.

6. Основной калибровочный раствор триолеина, 1.200 мг%, в хлороформе. Взвешивают на аналитических весах 1.200 мг триолеина в мерной колбе на 100 мл и доводят хлороформом до метки. Хранят в холодильнике, в посуде из темного стекла с притертой пробкой.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Водяная баня.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. К 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают на 10 минут в кипящую водяную баню. Пробирки вынимают и сразу охлаждают под водопроводной водой до комнатной температуры. Из каждой пробирки по 0,2 мл смеси помещают в чистую сухую пробирку, добавляют 3 мл фосфорнованилиновой смеси, тщательно перемешивают и оставляют стоять 45 минут в темноте при комнатной температуре. Измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против холостой пробы.

Холостую пробу ставят как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,1 мл воды.

Расчет производят по калибровочному графику или по формуле.

Построение калибровочного графика. Из основного калибровочного раствора готовят рабочие калибровочные растворы, как указано в таблице:

 

┌────────────┬───────────────────┬───────────────┬───────────────┐

│     NN     │   Калибровочный   │   Хлороформ   │   Концентрация│

│  пробирок  │     раствор       │     (мл)      │      общих    │

│            │    триолеина      │               │     липидов   │

│            │      (мл)         │               │      (мг%)    │

├────────────┼───────────────────┼───────────────┼───────────────┤

│    1       │      0,17         │    0,83       │     200       │

│    2       │      0,33         │    0,67       │     400       │

│    3       │      0,5          │    0,5        │     600       │

│    4       │      0,67         │    0,33       │     800       │

│    5       │      0,83         │    0,17       │     1000      │

│    6       │      1,0          │    -          │     1200      │

└────────────┴───────────────────┴───────────────┴───────────────┘

 

Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего калибровочного раствора и далее обрабатывают как опыт. По полученным данным строят калибровочный график. Прямолинейная зависимость между содержанием общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 1200 мг%.

 

                                            Еоп

    Расчет по формуле: Общие липиды в мг% = ---- х Ск

                                            Ек

 

Нормальные величины - 350-800 мг%.

Примечания.

1. Исследование проводят строго натощак.

2. Сыворотку можно хранить в холодильнике в течение 3-6 дней (не замораживая).

3. При концентрации общих липидов выше 1.200 мг% сыворотку разводят водой и результаты умножают на разведение.

4. Посуду, применяемую для определения общих липидов, мыть отдельно от другой посуды. Необходимо тщательно прополоскать ее дистиллированной водой и спиртом (этанолом или метанолом).

 

Литература.

1. Zollner N., Kirsch K. - Z.fur ges. exp. Med., 1962. 135, 545-561.

2. Knight Y., Anderson S., Rawle Y. - Clin. Chem. 1972, 18, N 3, 199-200.

 

3.3.2. Определение триглицеридов в сыворотке крови

по цветной реакции с хромотроповой кислотой

 

Принцип. Триглицериды гидролизуются с освобождением глицерина. Глицерин количественно окисляется до формальдегида метапериодатом натрия. Образующиеся при этом йодаты и непрореагировавшие периодаты восстанавливаются в йодиты избытком бисульфита натрия, после чего формальдегид определяют по цветной реакции с хромотроповой кислотой.

Реактивы.

1. Хлороформ, хч или для наркоза.

2. Метанол (метиловый спирт), хч.

3. Смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1.

4. Эфир для наркоза.

5. 0,37% раствор хлористого калия. 0,37 г хлористого калия растворяют в 100 мл воды. Стабилен 2-3 месяца при хранении при комнатной температуре.

6. Смесь для промывания липидного экстракта - хлороформ-метанол: вода (3:48:47).

7. Этанол (этиловый спирт), абсолютный.

8. 2.5% раствор едкого кали. 0,25 г едкого кали растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Раствор стабилен при хранении при комнатной температуре.

9. Спиртовой раствор едкого кали. Смешивают extempore 1 объем 2,5% водного раствора едкого кали и 19 объемов абсолютного спирта.

10. 0,02М раствор натрия метапериодата (натрия йоднокислого мета, NaIO4). 0,426 г метапериодата натрия растворяют в мерной колбе на 100 мл в небольшом количестве воды и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор стабилен около года при хранении при комнатной температуре в посуде из темного стекла.

11. 5% раствор бисульфита натрия. 5 г бисульфита натрия (метабисульфита натрия) растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стабилен при хранении при комнатной температуре в течение месяца.

12. Раствор хромотроповой кислоты. 1 г динатриевой соли хромотроповой кислоты (ч) (1,8-диоксинафталин-3,6-дисульфоновой кислоты динатриевой соли) растворяют в 100 мл дистиллированной воды; раствор фильтруют, добавляют 300 мл концентрированной серной кислоты и 150 мл дистиллированной воды. Стабилен в течение 3-4 недель при хранении в холодильнике, в посуде из темного стекла.

13. 0,7М раствор серной кислоты. В мерную колбу на 100 мл к небольшому количеству дистиллированной воды добавляют 3,7 мл серной кислоты, смешивают и после охлаждения доводят объем дистиллированной водой до метки.

14. Кремневая кислота, очищенная, активированная. Кремневую кислоту предварительно очищают и активируют.

Очистка кремневой кислоты. К 500 г кремневой кислоты, водной, ч или чда, добавляют 2 л дистиллированной воды, тщательно размешивают и оставляют стоять полученную суспензию на 1 час. Верхний слой отсасывают водоструйным насосом, нижний слой фильтруют. Кремневую кислоту промывают 3 раза абсолютным метанолом и несколько раз хлороформом. Очищенную кремневую кислоту активируют в сушильном шкафу при температуре 110 град. С в течение 12 часов. Хранят в герметично закрытой посуде. Перед работой кремневую кислоту вновь активируют в течение 1 часа при температуре 100 град. С.

15. Основной калибровочный раствор триолеина (0,01М). 0,815 мл триолеина (0,884 г триолеина) растворяют в небольшом количестве хлороформа в мерной колбе на 100 мл и доводят хлороформом до метки.

Рабочий раствор триолеина. 1 мл основного калибровочного раствора доводят хлороформом до 100 мл. 1 мл этого раствора содержит 0,1 мкМ триолеина.

Вместо триолеина в качестве калибровочного вещества можно употреблять трибутирин.

Основной калибровочный раствор трибутирина (0,01М). 302 мг трибутирина растворяют в небольшом количестве хлороформа в мерной колбе на 100 мл и доводят хлороформом до метки.

Рабочий раствор трибутирина. 1 мл основного калибровочного раствора доводят хлороформом до 100 мл. 1 мл этого раствора содержит 0,1 мкМ трибутирина.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Баня водяная.

Насос водоструйный.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. 1) Получение общего липидного экстракта. К 0,5 мл сыворотки добавляют 10 мл смеси хлороформ-метанол (2:1), энергично встряхивают 30 секунд и фильтруют через бумажный обезжиренный фильтр. Для обезжиривания помещают обеззоленные фильтры в посуду со смесью Блюра или Фолча, оставляют на сутки и высушивают на воздухе. Хранят в плотно закрытой посуде. Пробирки промывают 3 мл смеси хлороформ-метанол (2:1) и вновь фильтруют. Объем фильтрата доводят до 12 мл смесью хлороформ-метанол. Добавляют 2,4 мл 0,37% раствора хлористого калия. Содержимое пробирок энергично встряхивают 30 сек. и оставляют стоять на 2-3 часа (можно на сутки) для образования двух фаз (двух слоев). Образовавшийся верхний слой отсасывают пипеткой с помощью водоструйного насоса (не задевая нижнего слоя). На нижний слой наслаивают два раза по 1 мл смеси хлороформ:метанол:вода (3:48:47) и отсасывают смесь (промывание липидного экстракта). Затем к нижнему слою добавляют по каплям метанол для просветления липидного экстракта. Объем полученного очищенного экстракта доводят смесью хлороформ-метанол (2:1) до 10 мл и тщательно перемешивают.

2) Определение триглицеридов. 4 мл экстракта выпаривают на водяной бане при 60-80 град. С. Сухой остаток растворяют в 7 мл хлороформа и в полученный раствор вносят 500 мг активированной кремневой кислоты; содержимое пробирок энергично встряхивают 30 сек. Затем смесь фильтруют через обезжиренный фильтр, промывают дважды пробирки хлороформом по 2 мл и вновь фильтруют.

Хлороформ выпаривают досуха в водяной бане при температуре 70-80 град. С. После выпаривания в пробирки вносят по 1 мл спиртового раствора едкого кали и вновь помещают в водяную баню при 60-65 град. С на 30 минут (для гидролиза). Затем пробирки вынимают, охлаждают до комнатной температуры и прибавляют по 1,6 мл 0,7М раствора серной кислоты, перемешивают и добавляют 4 мл эфира. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 1 минуты. Отстоявшийся верхний эфирный слой осторожно отсасывают пипеткой с помощью водоструйного насоса.

Из оставшегося нижнего слоя берут 0,6 мл, добавляют 0,1 мл 0,02М раствора натрия метапериодата, тщательно перемешивают. Через 10 минут добавляют 0,1 мл 5% раствора бисульфита натрия, энергично встряхивают (раствор сначала желтеет, а затем светлеет), через 5 минут добавляют 2,5 мл раствора хромотроповой кислоты, встряхивают и ставят на 30 минут в кипящую водяную баню (развивается темно-вишневое окрашивание). После охлаждения в бане со льдом измеряют на ФОКе против холостой пробы при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Холостая проба. 2 пробирки с 1 мл хлороформа выпаривают на водяной бане 70-80 град. С досуха, добавляют по 1 мл спиртового раствора едкого кали и вновь помещают в водяную баню 60-65 град. С на 30 минут. Далее определение ведут как и в опытной пробе.

Калибровочная проба обрабатывается как и холостая проба, но вместо 1 мл хлороформа берут 1 мл рабочего калибровочного раствора.

Расчет производят по формуле:

 

                       0,1 х Еоп х 500 х 850    Еоп

    Содержание три-  = ---------------------- = ---- х 42,5

    глицеридов в мг%   Ек х 1.000               Ек

 

    где: Еоп - экстинкция опытной пробы,

         Ек - экстинкция калибровочной пробы,

         0,1 - содержание   триолеина   в  мкМ  в  1  мл  рабочего

               калибровочного раствора,

         500 - коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки,

          850

         ----- -  коэффициент  пересчета  на  миллиграммы  (850  -

         1.000

средневзвешенный молекулярный вес жирных кислот триглицеридов в организме человека).

Нормальные величины - 50-150 мг%.

Примечания.

1. Исследование необходимо проводить строго натощак после 12-часового голодания.

2. Пробирки для работы должны быть абсолютно чистыми и сухими. Необходимо после обычного мытья тщательно прополаскивать их дистиллированной водой и спиртом (этанолом или метанолом).

 

Литература.

1. Carlson L.A. - Atheroscler. Res., 1963, 3, 334.

2. Van Handel E. - Clin. Chem., 1961, 7, 249.

3. Биохимические методы исследования в клинике. Справочник. Под ред. А.А.Покровского. М., 1969, 294.

 

3.3.3. Определение бета-липопротеидов в сыворотке крови

турбидиметрическим методом

 

Принцип. При добавлении гепарина к сыворотке крови образуется в присутствии хлористого кальция гепарин-липопротеиновый комплекс. Возникающая мутность пропорциональна содержанию бета-липопротеидов.

Реактивы.

1. 0,025М раствор хлористого кальция. 0,5475 г 6-водного хлористого кальция (CaCl2 x 6H2O) или 0,3675 г 2-водного хлористого кальция (CaCl2 x 2H2O) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл и доводят объем дистиллированной водой до метки.

Для приготовления 0,025М раствора хлористого кальция из ампулированного раствора хлористого кальция 2,8 мл 10% ампулированного раствора хлористого кальция помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Стабилен при хранении в холодильнике.

2. Раствор гепарина (1 мл должен содержать 1.000 МЕ). 1 мл препарата гепарина фирмы "Гедеон Рихтер" (ВНР), содержащего 5000 МЕ в 1 мл, доводят дистиллированной водой до 5 мл. Отечественный гепарин с содержанием 5.000 МЕ, 10.000 МЕ и 20.000 МЕ в 1 мл разводят так, чтобы раствор содержал 1.000 МЕ в 1 мл.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Колбы мерные.

Секундомер.

Ход определения. В пробирку, содержащую 2 мл 0,025М раствора хлористого кальция, добавляют 0,2 мл сыворотки, тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность (Е1) на фотоэлектроколориметре при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против дистиллированной воды. Затем добавляют 0,04 мл 1% раствора гепарина, тщательно перемешивают и точно через 4 минуты по секундомеру вновь измеряют оптическую плотность (Е2). Разница экстинкций (Е2-Е1) соответствует оптической плотности, обусловленной содержанием бета-липопротеидов.

Расчет. Содержание бета-липопротеидов выражают в единицах экстинкции, умноженных на 100:

 

    Содержание

    бета - липопротеидов  = (Е2 - Е1) х 100

 

Нормальные величины содержания бета-липопротеидов сыворотки крови здоровых людей соответствуют 35-55 ед.

Примечание.

1. Кровь исследуют у пациента после 12-часового голодания.

2. При высоких концентрациях бета-липопротеидов сыворотку разводят физиологическим раствором, полученные результаты умножают на разведение.

3. Расчет можно вести по калибровочному графику, построенному по калибровочному раствору бета-липопротеидов. Однако выделение чистых бета-липопротеидов для получения калибровочного раствора технически трудно. Кроме того, бета-липопротеиды - соединения малоустойчивые, и денатурируются при высушивании и замораживании. Поэтому было предложено выражать результаты в единицах экстинкции, умноженных на 100.

 

Литература.

1. Burstein M., Samaille Y. - C.R.Acad. Sci., 1956, 243, 2185.

2. Ледвина М. - Лабор. дело, 1960, 3, 13.

 

3.4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИНЕРАЛЬНОГО ОБМЕНА

 

3.4.1. Определение железа в сыворотке крови по цветной

реакции с батофенантролином

 

Принцип. При реакции комплексирования железа с батофенантролином образуется окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации железа.

Реактивы.

1. 20% раствор трихлоруксусной кислоты.

2. 70% раствор уксуснокислого аммония. 70 г уксуснокислого аммония и 30 мл воды.

3. Насыщенный водный раствор сернокислого гидразина. 2,5 г сернокислого гидразина растворяют в 100 мл бидистиллированной воды. Хранят при комнатной температуре в посуде из темного стекла.

4. Хлорсульфоновая кислота (ч).

5. 20% раствор едкого натра.

6. 0,05% раствор батофенантролина (4,7-дифенил-1,10-фенантролин). 100 мг батофенантролина помещают в пробирку, прибавляют 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, кипятят 30 секунд, после охлаждения медленно добавляют 10 мл бидистиллированной воды, нагревают 5 минут на кипящей водяной бане. Содержимое пробирки переносят в мерную колбу на 200 мл, добавляют 100 мл бидистиллированной воды, затем 20% раствор едкого натра до получения рН-4,0 и доводят бидистиллированной водой до метки.

7. 0,3н раствор соляной кислоты.

8. Серная кислота концентрированная.

9. Основной калибровочный раствор железа. 1 мл раствора содержит 100 мкг железа. 703,2 мг соли Мора (аммоний-железо (II) сернокислый (NH4)2Fe(SO4)2 х 6H2O) растворяют в 5 мл 0,3М раствора соляной кислоты в мерной колбе на 1 л и доводят объем до метки бидистиллированной водой, подкисленной предварительно 1 мл серной кислоты.

Рабочий раствор готовят разведением основного раствора подкисленной бидистиллированной водой в 50 раз. 1 мл рабочего раствора содержит 2 мкг железа.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Водяная баня.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. К 2 мл сыворотки добавляют 2,5 мл бидистиллированной воды, 1,5 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. После перемешивания содержимое помещают на 15 минут в водяную баню 90-95 град. С. Смесь центрифугируют при 2.000 об/мин в течение 20 минут. К 4 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,35 мл 70% раствора уксуснокислого аммония, затем 0,3 мл насыщенного раствора сернокислого гидразина. Измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против воды. Затем в опытную пробу добавляют 0,4 раствора батофенантролина, оставляют стоять на 40 минут и повторно измеряют при тех же условиях.

Холостая проба. Смешивают 1 мл трихлоруксусной кислоты, 3 мл воды, прибавляют 0,35 мл 70% раствора уксуснокислого аммония, 0,3 мл насыщенного раствора сернокислого гидразина. Измеряют при тех же условиях, что и опытные пробы. Через 40 минут к холостой пробе, так же как и к опытной, добавляют 0,4 мл раствора батофенантролина и повторно измеряют при тех же условиях.

Калибровочная проба. К 2 мл рабочего калибровочного раствора добавляют 1 мл бидистиллированной воды, 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, 0,35 мл 70% раствора уксуснокислого аммония, 0,3 мл насыщенного раствора сернокислого гидразина и далее обрабатывают и измеряют как опытные пробы.

Расчет производят по формуле. Из результатов отсчета после прибавления цветного реактива вычитают результаты того же исследования до прибавления цветного реактива.

 

 Концентрация железа    Еоп - Ехол        100    Еоп - Ехол

 в сыворотке крови    = ---------- х 4 х ---- = ----------  х 300,

   (в мкг%)            Ек - Ехол         1,33   Ек - Ехол

 

    где: Еоп  -  разность  между  окончательным  и предварительным

отсчетом экстинкции опытной пробы.

         Ехол -  разность  между  окончательным  и предварительным

отсчетом экстинкции холостой пробы,

         Ек - то же для калибровочной пробы,

         100

         ---- - коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки.

         1,33

 

Прямолинейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией железа сохраняется до концентрации 1.000 мкг%.

Нормальные величины - 65-175 мкг%.

Примечания.

1. Сыворотка крови должна быть свободной от гемолиза.

2. Кровь следует брать в специальную пробирку, промытую бидистиллированной водой.

3. Посуду промывают 5н раствором соляной кислоты и ополаскивают бидистиллированной водой.

4. Не рекомендуется употреблять трихлоруксусную кислоту с высоким содержанием в ней железа. Разность экстинкций холостой пробы не должен быть более 0,05.

 

Литература.

1. Henry R.I., Sobel C., Chiamory N. - Clin. Chim. Acta, 1958, 3, 523.

2. Идельсон Л.И., Радзивиловская Э.Г., Аполлонова Л.А. - Пр. гематологии и переливания крови, 1970, 5, 47.

 

3.4.2. Определение магния в сыворотке (плазме) крови

по цветной реакции с титановым желтым

 

Принцип. Магний реагирует с титановым желтым в щелочной среде с образованием окрашенных соединений. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации магния.

Реактивы:

1. 10% раствор вольфрамовокислого натрия.

2. 0,67н раствор серной кислоты.

3. 6% раствор едкого натра.

4. 2% раствор солянокислого гидроксиламина. Хранят в посуде из темного стекла.

5. 0,075% раствор титанового желтого. 18,7 мг титанового желтого растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 25 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике, в течение 10 дней.

6. 0,1% раствор метилового красного в 95% этаноле.

7. 2мг% калибровочный раствор сернокислого магния.

205 мг сернокислого магния (хч) (MgSO4 х 7H2O) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 литр и доводят дистиллированной водой до метки. 1 мл раствора содержит 0,02 мг магния.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Пробирки центрифужные мерные, на 10 мл.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку наливают 2 мл дистиллированной воды, 1 мл сыворотки (плазмы), 1 мл 10% раствора вольфрамовокислого натрия, смешивают, добавляют 1 мл 0,67н раствора серной кислоты. Тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Через 15 минут центирифугируют при 3,5-4 тыс. об/мин в течение 10 минут. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной. К 2,5 мл надосадочной жидкости в мерной центрифужной пробирке на 10 мл добавляют 1 каплю индикатора - метилового красного и нейтрализуют несколькими каплями 0,8% раствора едкого натра до желтой окраски раствора.

К этому раствору добавляют 1 мл 2% раствора гидроксиламина, 1 мл 0,075% раствора титанового желтого и 2 мл 6% раствора едкого натра. Затем раствор доводят до объема 10 мл дистиллированной водой.

Измеряют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба. В центрифужной пробирке на 10 мл смешивают 1,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 10% раствора вольфрамовокислого натрия, 0,5 мл 0,67н раствора серной кислоты, добавляют 1 каплю индикатора метилового красного и далее обрабатывают как опытную пробу.

Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Из основного калибровочного раствора готовят разведения, как указано в таблице

 

   ┌────────────┬─────────────┬──────────────────┬───────────────┐

   │Основной    │Содержание Mg│ Дистиллированная │Концентрация Mg│

   │калибровоч- │ в основном  │       вода       │ в сыворотке   │

   │ный раствор │калибровочном│       (мл)       ├───────┬───────┤

   │(мл)        │растворе (мг)│                  │  мг%  │  мэкв │

   ├────────────┼─────────────┼──────────────────┼───────┼───────┤

   │   0,25     │   0,005     │      до 6,0      │   1   │  0,82 │

   │   0,5      │   0,01      │      до 6,0      │   2   │  1,64 │

   │   0,75     │   0,015     │      до 6,0      │   3   │  2,46 │

   │   1,0      │   0,02      │      до 6,0      │   4   │  3,27 │

   │   1,25     │   0,025     │      до 6,0      │   5   │  4,1  │

   │   1,5      │   0,03      │      до 6,0      │   6   │  4,92 │

   └────────────┴─────────────┴──────────────────┴───────┴───────┘

 

Ко всем растворам добавляют по 1 мл 2% раствора гидроксиламина, 1 мл 0,075% раствора титанового желтого и 2 мл 6% раствора едкого натра. Измеряют при тех условиях, что и опытные пробы против холостой пробы.

Холостая проба. 1 мл 2% раствора гидроксиламина, 1 мл 0,075% раствора титанового желтого, 2 мл 6% раствора едкого натра и доводят до 10 мл дистиллированной водой.

Прямолинейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией магния сохраняется от 0 до 6,0 мэкв/л.

Нормальные величины. Содержание магния в сыворотке и плазме - 1,7-2,4 мг%, или 1,5-2,0 мэкв/л.

Примечание. Сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

 

Литература.

Kunkel H.O., Pearson P.B., Schweiqert B.S. - Y.Lab. and Clin. Med., 1947, 32, 8, 1027-1033.

 

3.4.3. Определение магния в сыворотке (плазме) крови

и моче по цветной реакции с магоном

 

Принцип. Магний реагирует с магоном в щелочной среде с образованием окрашенных соединений. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации магния.

Содержание магния в сыворотке (плазме) крови и в моче по этой реакции можно определить готовым набором реактивов, выпускаемым фирмой "Лахема" (ЧССР).

Набор Био-Ла-Тест "Магний" состоит из следующих реактивов:

1. 2,8 х 10 (в минус четвертой степени) М раствор магона.

2. 0,1М основной буферный раствор тетрабората натрия - 1-(2-оксиазо)-2 нафтол-3-(2,4-диметил)-карбоксанилид.

3. 20 мг% основной калибровочный раствор магния.

Приготовление рабочих растворов.

1. Рабочий буферный раствор. В колбу, емкостью 250 мл, наливают 50 мл основного буферного раствора и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Рабочий буферный раствор устойчив в течение нескольких месяцев.

2. Рабочий раствор магона готовят смешиванием равных объемов раствора магона и рабочего буферного раствора. Рабочий раствор магона устойчив ограниченное время, поэтому готовить его нужно ежедневно. Используют через 10 минут после приготовления.

3. Рабочий калибровочный раствор магния. В мерную колбу на 50 мл наливают 5,0 мл основного калибровочного раствора и доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация рабочего калибровочного раствора - 2 мг%.

Ход определения. В пробирку вносят 0,03 мл сыворотки или мочи, разбавленной в 3 раза дистиллированной водой, добавляют 4,0 мл свежеприготовленного рабочего раствора магона и перемешивают.

Измеряют на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.

Холостую пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки или мочи добавляют дистиллированную воду.

Калибровочная проба. Параллельно с опытной пробой ставят калибровочную, в которую вместо сыворотки добавляют рабочий калибровочный раствор магния.

Расчет ведут по калибровочному графику или по формуле:

 

    Концентрация       Еоп

    магния в мг%     = ---- х 2, где:

                       Ек

 

    Еоп - экстинкция опытной пробы,

    Ек - экстинкция калибровочной пробы,

    2 - содержание магния в калибровочном растворе в мг%.

    Концентрация магния в мэкв/л = концентрация магния в мг%

                                   -------------------------

                                            1,22

 

Построение калибровочного графика. Из основного калибровочного раствора (20 мг%) готовят рабочие калибровочные растворы 1, 2, 3, 4 мг% путем соответствующего разведения основного раствора дистиллированной водой.

Из каждого рабочего калибровочного раствора берут по 0,03 мл и обрабатывают как опытные пробы.

Нормальные величины. Содержание магния в сыворотке - 1,7-2,6 мг%, или 1,4-2,1 мэкв/л.

Примечание. Стабильность окраски получаемых растворов сохраняется в течение 20-30 минут.

 

Литература.

Инструкция к набору реактивов Био-Ла-Тест для определения магния в биологических жидкостях. "Лахема" (ЧССР).

 

3.4.4. Определение калия в биологических жидкостях

методом пламенной фотометрии

 

Принцип. Распыленную в воздухе биологическую жидкость вводят в горящую газовую смесь с высокой температурой. В этих условиях многие элементы имеют характерные для них спектры испускания. Концентрация исследуемого электролита пропорциональна интенсивности соответствующего участка спектра испускания пламени, что регистрируется прибором.

Реактивы.

1. Основные калибровочные растворы для определения калия в плазме (сыворотке), спинномозговой жидкости, экссудатах, транссудатах, желудочном содержимом, эритроцитах. Основные калибровочные растворы готовят из химически чистых солей хлористого натрия, хлористого калия, углекислого кальция, дважды перекристаллизованных и высушенных до постоянного веса.

а) 2,5418 г хлористого натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят бидистиллированной водой до метки.

б) 1,9069 г хлористого калия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят бидистиллированной водой до метки.

в) 2,4972 г углекислого кальция растворяют в 50 мл 1 н раствора соляной кислоты в мерной колбе на 1 л и доводят бидистиллированной водой до метки.

2. Основные калибровочные растворы для определения калия в моче.

а) 22,285 г сернокислого калия растворяют в мерной колбе на 1 л в небольшом количестве бидистиллированной воды и доводят бидистиллированной водой до метки.

б) 127,09 г хлористого натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят бидистиллированной водой до метки.

3. Гепарин (антикоагулянт)

Специальное оборудование.

Пламенный фотометр.

Компрессор.

Колбы мерные.

Бюксы, диаметром 10-15 мм.

Баллоны с ацетиленом.

Ход определения. Подготовка материала к определению.

Плазма или сыворотка. Кровь центрифугируют в течение 15 минут при 3.000 об/мин. Плазму<*> (сыворотку) осторожно отсасывают и разводят дистиллированной водой до 1:10. Отделять плазму (сыворотку) от эритроцитов следует не позднее чем через 1 час после взятия крови.

--------------------------------

<*> Для получения плазмы на 5-10 мл крови в пробирку добавляют 1 каплю (0,02 мл) гепарина.

 

Спинномозговую жидкость, экссудат, транссудат разводят дистиллированной водой 1:10.

Желудочное содержимое предварительно разводят дистиллированной водой 1:50, а затем делают разведение дистиллированной водой 1:10.

Эритроциты. Гепаринизированную кровь центрифугируют в течение 30 минут при 3.000 об/мин. Затем плазму с верхним слоем эритроцитов отсасывают. Эритроциты набирают пипеткой из нижней части пробирки, гемолизируют дистиллированной водой, т.е. разводят дистиллированной водой в соотношении 1:260.

Моча. Собирают суточную мочу, измеряют ее количество. Небольшое количество мочи центрифугируют, разводят дистиллированной водой 1:100.

Ход определения. Определение ведут согласно инструкции, прилагаемой к прибору. При включении прибора сначала пропускают сжатый воздух, потом ацетилен или другой газ. В бюксы, диаметром 10-15 мм, вносят соответствующим образом приготовленную биологическую жидкость и рабочие калибровочные растворы (приготовление рабочих калибровочных растворов - см. построение калибровочного графика). Исследование начинают с настройки прибора. Для этого калибровочные растворы вводят в горящую газовую смесь пламенного фотометра и настраивают показания гальванометра в соответствии с калибровочным графиком. Затем распыляют растворы исследуемых биологических жидкостей. До и после каждого определения распыляют дистиллированную воду для удаления следов ионов. В ходе определения несколько раз проверяют работу прибора при помощи одного из калибровочных растворов. После окончания исследования прибор промывают в течение 20 минут дистиллированной водой.

Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Из основных калибровочных растворов готовят рабочие растворы, как указано в таблицах.

 

Таблица

 

Рабочие калибровочные растворы для определения калия

в плазме (сыворотке), спинномозговой жидкости,

транссудате, экссудате, желудочном содержимом

 

┌────────────────────────────────┬────────────────┬──────────────┐

│ Основные калибровочные растворы│Дистиллированная│Концентрация  │

│             (мл)               │      вода      │калия в калиб-│

│                                │      (мл)      │ровочной пробе│

├─────────┬───────────┬──────────┤                ├─────┬────────┤

│   KCl   │    NaCl   │    CaCO3 │                │(мг%)│(мэкв/л)│

├─────────┼───────────┼──────────┼────────────────┼─────┼────────┤

│   0,6   │    16,5   │   0,2    │      82,7      │ 12  │  3,08  │

│   0,8   │    16,5   │   0,4    │      82,3      │ 16  │  4,10  │

│   1,0   │    16,5   │   0,5    │      82,0      │ 20  │  5,12  │

│   1,2   │    16,5   │   0,6    │      81,7      │ 24  │  6,15  │

│   1,4   │    16,5   │   0,8    │      81,3      │ 28  │  7,18  │

└─────────┴───────────┴──────────┴────────────────┴─────┴────────┘

 

Таблица

 

Рабочие калибровочные растворы

для определения калия в эритроцитах

 

  ┌──────────────┬─────────┬─────────────────────────────────────┐

  │  Основной    │Дистилли-│         Концентрация калия          │

  │калибровочный │рованная ├──────────────────────┬──────────────┤

  │ раствор KCl  │вода     │в калибровочной пробе │в эритроцитах │

  │    (мл)      │(мл)     ├─────────┬────────────┼─────┬────────┤

  │              │         │(мг%)    │(мэкв/л)    │(мг%)│(мэкв/л)│

  ├──────────────┼─────────┼─────────┼────────────┼─────┼────────┤

  │     1,0      │ до 100  │   1,0   │   0,256    │ 260 │   66,6 │

  │     1,1      │ до 100  │   1,1   │   0,282    │ 286 │   73,3 │

  │     1,2      │ до 100  │   1,2   │   0,307    │ 312 │   80,0 │

  │     1,3      │ до 100  │   1,3   │   0,333    │ 338 │   86,6 │

  │     1,4      │ до 100  │   1,4   │   0,359    │ 364 │   93,3 │

  │     1,5      │ до 100  │   1,5   │   0,384    │ 390 │  100,0 │

  │     1,6      │ до 100  │   1,6   │   0,412    │ 416 │  106,6 │

  └──────────────┴─────────┴─────────┴────────────┴─────┴────────┘

 

Таблица

 

Рабочие калибровочные растворы

для определения калия в моче

 

  ┌──────────────┬──────────────┬─────────┬──────────────────────┐

  │  Основной    │  Основной    │Дистилли-│  Концентрация К и Na │

  │калибровочный │калибровочный │рованная │ в калибровочной пробе│

  │раствор K2SO4 │ раствор NaCl │вода     │                      │

  │    (мл)      │    (мл)      │(мл)     │                      │

  ├──────────────┼──────────────┼─────────┼──────────────────────┤

  │     5        │     4        │  до 100 │  50 мг К + 200 мг Na │

  │     10       │     4        │  до 100 │ 100 мг К + 200 мг Na │

  │     15       │     4        │  до 100 │ 150 мг К + 200 мг Na │

  │     20       │     4        │  до 100 │ 200 мг К + 200 мг Na │

  │     25       │     4        │  до 100 │ 250 мг К + 200 мг Na │

  │     30       │     4        │  до 100 │ 300 мг К + 200 мг Na │

  └──────────────┴──────────────┴─────────┴──────────────────────┘

 

Рабочие калибровочные растворы обрабатывают как опытные пробы и по полученным данным строят калибровочный график.

Для расчета количества калия в моче показания калибровочного графика умножают на суточное количество мочи (в мл) и результат выражают в граммах.

Концентрация калия в биологической жидкости в миллиэквивалентах/л равна: С х К, где:

С - концентрация калия в мэкв, найденная по калибровочному графику,

К - разведение биологической жидкости.

Нормальные величины. Содержание калия:

 

    Плазма         13,6-20,8 мг%

                 - 3,44-5,3 мэкв/л

    Эритроциты     305-574 мг%

                 - 77,8-95,7 мэкв/л

    Моча            1,5-3 г в суточном количестве

    Желудочное      21,8-157,7 мг%

    содержимое   -   5,6-35,3 мэкв/л

 

3.4.5. Определение натрия в биологических жидкостях

методом пламенной фотометрии

 

Принцип. Тот же.

Реактивы. Те же.

Специальное оборудование. То же.

Ход определения. Подготовка материала к определению производится так же, как при определении калия, за исключением того, что сыворотку разводят 1:100, а эритроциты гемолизируют дистиллированной водой в соотношении 1:26. Ход определения тот же, что и при определении в биологических жидкостях калия.

Расчет производится по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Из основных калибровочных растворов готовят рабочие растворы, как указано в таблицах.

 

Таблица

 

Рабочие калибровочные растворы для определения натрия

в плазме (сыворотке), спинномозговой жидкости,

транссудате, экссудате, желудочном содержимом

 

┌─────────────────┬────────────────────┬─────────────────────────┐

│     Основной    │  Дистиллированная  │   Концентрация натрия   │

│   калибровочный │        вода        │  в калибровочной пробе  │

│   раствор NaCl  │        (мл)        ├───────────┬─────────────┤

│      (мл)       │                    │   (мг%)   │ (мэкв/л)    │

├─────────────────┼────────────────────┼───────────┼─────────────┤

│      2,6        │        97,4        │    260    │    113,0    │

│      2,8        │        97,2        │    280    │    121,7    │

│      3,0        │        97,0        │    300    │    130,4    │

│      3,4        │        96,6        │    340    │    147,8    │

│      3,8        │        96,2        │    380    │    165,2    │

│      4,0        │        96,0        │    400    │    174,3    │

│      4,2        │        95,8        │    420    │    182,6    │

└─────────────────┴────────────────────┴───────────┴─────────────┘

 

Таблица

 

Рабочие калибровочные растворы

для определения натрия в эритроцитах

 

┌─────────────────┬─────────┬────────────────────────────────────┐

│    Основные     │Дистилли-│        Концентрация натрия         │

│  калибровочные  │рованная ├─────────────────────┬──────────────┤

│    растворы     │вода     │в калибровочной пробе│в эритроцитах │

├────────┬────────┤(мл)     ├────────┬────────────┼─────┬────────┤

│NaCl(мл)│KCL (мл)│         │(мг%)   │(мэкв/л)    │(мг%)│(мэкв/л)│

├────────┼────────┼─────────┼────────┼────────────┼─────┼────────┤

│   0,4  │  14    │ до 100  │  0,4   │   0,174    │10,4 │  4,52  │

│   0,5  │  14    │ до 100  │  0,5   │   0,217    │13,0 │  5,65  │

│   1,0  │  14    │ до 100  │  1,0   │   0,434    │26,0 │  11,3  │

│   1,5  │  14    │ до 100  │  1,5   │   0,652    │39,0 │  16,9  │

│   2,0  │  14    │ до 100  │  2,0   │   0,869    │52,0 │  22,6  │

│   2,5  │  14    │ до 100  │  2,5   │   1,086    │65,0 │  28,2  │

└────────┴────────┴─────────┴────────┴────────────┴─────┴────────┘

 

Таблица

 

Рабочие калибровочные растворы

для определения натрия в моче

 

  ┌──────────────┬──────────────┬─────────┬──────────────────────┐

  │  Основной    │  Основной    │Дистилли-│  Концентрация Na и K │

  │калибровочный │калибровочный │рованная │ в калибровочной пробе│

  │ раствор NaCl │ раствор K2SO4│вода     │                      │

  │    (мл)      │    (мл)      │(мл)     │                      │

  ├──────────────┼──────────────┼─────────┼──────────────────────┤

  │      2       │     15       │ до 100  │ 100 мг Na + 150 мг K │

  │      3       │     15       │ до 100  │ 150 мг Na + 150 мг K │

  │      4       │     15       │ до 100  │ 200 мг Na + 150 мг K │

  │      5       │     15       │ до 100  │ 250 мг Na + 150 мг K │

  │      6       │     15       │ до 100  │ 300 мг Na + 150 мг K │

  │      7       │     15       │ до 100  │ 350 мг Na + 150 мг K │

  └──────────────┴──────────────┴─────────┴──────────────────────┘

 

Рабочие калибровочные растворы обрабатывают как опытные пробы и по полученным данным строят калибровочный график.

Для расчета количества Na в моче показания калибровочного графика умножают на суточное количество мочи (в мл) и результат выражают в граммах.

 

    Нормальные величины. Содержание натрия:

    плазма        300-360 мг%

                - 130,5-156,6 мэкв/л

    эритроциты    31-50 мг%

                - 13,48-21,75 мэкв/л

    моча        - 3-6 г в суточном количестве

    желудочное    72-435,4 мг%

    содержимое  - 31,3-189,3 мэкв/л

 

Литература.

1. Thiele W. - Yenaer. Rundschau, 1961, 2, 82.

2. Меньшиков В.В. - Методы клинической биохимии гормонов и медиаторов. М., 1969, 145.

3. Крохалев А.А. - Лабор.дело, 1961, 5, 12.

4. Gabsch H. - Ch. In: Moderne chemische Methoden in der Klinik. Leipzig, 1961, 646-655.

5. Hald P.W., Mason W.B. In: Standard Methods of Clinical Chemistry. V.II. New York. 1958, 165-185.

 

3.5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

 

3.5.1. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке

крови, моче и дуоденальном содержимом амилокластическим

методом со стойким крахмальным субстратом

(метод Каравея)

 

Принцип. альфа-амилаза гидролизует расщепление крахмала с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности альфа-амилазы судят по измерению уменьшения концентрации крахмала.

Реактивы.

1. Субстратно-буферный раствор, рН-7. 13,3 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия и 4,3 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл дистиллированной воды и доводят до кипения. Суспензируют 0,2 г растворимого крахмала (крахмал для колориметрии) в небольшом количестве холодной воды и вводят в кипящий раствор. Кипятят 1 минуту, охлаждают и доводят дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен при хранении при комнатной температуре. Субстратно-буферный раствор должен быть прозрачным.

2. 0,1н основной раствор йода. 3,567 г йодноватокислого калия (KIO3) и 45 г йодистого калия (KI) растворяют в 800 мл дистиллированной воды и медленно, при помешивании, добавляют 9 мл концентрированной соляной кислоты; затем объем доводят до 1 л дистиллированной водой.

3. 0,01н рабочий раствор йода. 25 г фтористого калия растворяют в 350 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл основного раствора йода и доливают дистиллированной водой до объема 500 мл. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике. Годен в течение 2 месяцев. Если в рабочий раствор йода не добавлять фтористого калия, то его следует готовить ежедневно.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Термостат.

Ход определения. Опытная проба. Микровариант. 5 мл субстратно-буферного раствора помещают в колбу, емкостью 50 мл, нагревают 5 мин. при 37 град. С, добавляют 0,1 мл биологической жидкости: сыворотки, профильтрованной мочи или дуоденального содержимого (предварительно разведенного 0,85% раствором хлористого натрия в 100 раз). Инкубируют 7,5 минут при 37 град. С. Время инкубации следует строго отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после инкубации добавляют 5 мл рабочего раствора йода и доводят объем дистиллированной водой до 50 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) против воды.

Холостую пробу ставят как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации, вместе с рабочим раствором йода. Измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу, против воды.

Ультрамикровариант. Ход определения опытной и холостой пробы тот же, что и при микроварианте, но объем всех реактивов и исследуемой биологической жидкости уменьшают в 5 раз. Определение проводят в пробирках, калиброванных на 10 мл.

Расчет. Активность альфа-амилазы выражают в мг крахмала, гидролизованного 1 мл биологической жидкости за 1 час инкубации при 37 град. С. Расчет производят по формуле:

 

  Активность      Е1 - Е2                    Е1 - Е2

  амилазы      = ------- х 2 х 8 х 10 х К = -------  х 160 х К,

  в мг/мл/час        Е1                         Е1

 

  где: Е1 - экстинкция холостой пробы,

       Е2 - экстинкция опытной пробы,

        2 - количество  мг  крахмала,  введенного  в  опытную   и

            холостую пробы,

        8 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации,

       10 - коэффициент пересчета на 1 мл биологической жидкости,

        К - коэффициент разведения биологической жидкости.

    При применении   ультрамикроварианта   окончательная   формула

расчета - та же:

 

               Активность      Е1 - Е2

               амилазы      = -------  x  160 x К

               в мг/мл/час        Е1

 

При активности фермента выше 140 мг крахмала биологическую жидкость следует развести 0,85% раствором хлористого натрия и коэффициент разведения учитывать при расчете активности фермента.

Нормальные величины:

Сыворотка крови - 12-32 мг крахмала мл/час.

Моча - 20-160 мг крахмала мл/час.

Дуоденальное содержимое - 6-16 г крахмала мл/час.

Примечания.

1. Гемолиз не влияет на активность фермента.

2. Для определения активности амилазы рекомендуется исследовать свежую биологическую жидкость.

3. Нормальные величины активности фермента для сыворотки крови и мочи желательно проверять на донорах в каждой лаборатории.

4. Серия исследований должны быть не больше, чем 5-7 проб.

 

Литература.

1. Caraway W.T. - Amer. Y.Clin.Pathol., 1959, 32, 97.

2. Клиническая ферментология. Под ред. Э.Щеклик. Варшава, 1966.

 

3.5.2. Определение активности лактатдегидрогеназы

в сыворотке крови по реакции с

2,4-динитрофенилгидразином (метод Севела, Товарек)

 

Принцип. L-лактат под действием фермента сыворотки в присутствии НАД окисляется в пируват; при реакции пирувата с 2,4-динитрофенилгидразином образуется окрашенный гидразон пировиноградной кислоты, интенсивность окраски которого пропорциональна активности фермента.

Реактивы.

1. 0,45М раствор молочнокислого натрия. В мерную колбу емкостью 100 мл, вносят 5 мл 80% молочной кислоты (коммерческой), добавляют 2н раствор едкого натра до получения рН-7,5 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

2. 0,03М раствор пирофосфорнокислого натрия, рН-8,8. 6,69 г пирофосфорнокислого натрия (Na4P2O7 х 10H2O) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, добавляют 1н раствор соляной кислоты до получения рН-8,8 и доводят объем дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

3. Раствор никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД). Готовят из расчета 3 мг НАД на 1 мл дистиллированной воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

4. Расчет 2,4-динитрофенилгидразина. 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1н раствора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1н раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.

5. 0,4н раствор едкого натра.

6. 1н раствор соляной кислоты.

7. Калибровочный раствор пировинограднокислого натрия. 11 мг кристаллического пировинограднокислого натрия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу, емкостью 100 мл, и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. 1,0 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты.

Рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного в 10 раз дистиллированной водой. 1 мл рабочего раствора содержат 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Термостат.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при 37 град. С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03М раствора пирофосфорнокислого натрия и 0,2 мл 0,45М раствора молочнокислого натрия, предварительно прогретых при 37 град. С, и инкубируют смесь при 37 град. С в течение 15 минут. Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин. при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4н раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин. измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостую пробу ставят как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет активности производят по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в микромолях пировиноградной кислоты, образовавшихся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 часа при 37 град. С.

Построение калибровочного графика. Из рабочего калибровочного раствора пировиноградного натрия готовят ряд разведений, как указано в таблице. Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные.

 

┌───┬────────────┬───────────┬───────┬────────────────┬──────────┐

│NN │  Рабочий   │0,03М      │Дистил-│Содержание пиро-│Активность│

│п/п│калибровочн.│раствор    │лиро-  │виноградной кис-│в мкмолях │

│   │  раствор   │пирофосфор-│ванная │лоты в калибро- │ за 1 час │

│   │  пирувата  │нокислого  │вода   │вочной  пробе   │ на 1 мл  │

│   │  натрия    │натрия     │(мл)   ├───────┬────────┤сыворотки │

│   │   (мл)     │(мл)       │       │ мкг   │ мкмоль │          │

├───┼────────────┼───────────┼───────┼───────┼────────┼──────────┤

│1  │ 0,1        │ 0,8       │ 0,5   │0,88   │ 0,01   │ 1,2      │

│2  │ 0,2        │ 0,8       │ 0,4   │1,76   │ 0,02   │ 2,4      │

│3  │ 0,4        │ 0,8       │ 0,2   │3,52   │ 0,04   │ 4,8      │

│4  │ 0,6        │ 0,8       │ -     │ 5,28  │ 0,06   │ 7,2      │

│5  │ 0,8        │ 0,6       │ -     │ 7,04  │ 0,08   │ 9,6      │

└───┴────────────┴───────────┴───────┴───────┴────────┴──────────┘

 

Холостую пробу ставят как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют дистиллированную воду.

Пересчет активности лактатдегидрогеназы на микромоли пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С производят по формуле:

 

    Активность            С х 30 х 4

    лактатдегидрогеназы = ----------,

    в мкМ/мл/час              88

 

где: С - микрограммы пировиноградной кислоты в калибровочной пробе,

30 - коэффициент пересчета на 1,0 мл сыворотки,

4 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации,

88 - вес 1 микромоля пировиноградной кислоты в микрограммах. Прямолинейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 10 микромолей/мл/час.

Нормальные величины - от 0,8 до 4,0 мкМ пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С.

Примечания.

1. Сыворотка крови должна быть свободной от гемолиза.

2. Для исследования рекомендуется использовать свежую сыворотку. Фермент не стабилен при хранении сыворотки при температуре -8-20 град. С.

3. Щавелевоуксусную плазму употреблять не рекомендуется, так как соли щавелевой кислоты ингибируют фермент.

 

Литература.

1. Sevela M., Tovarek Y. - Cas. Lek. Cesk., 1959, 98, 27, 844.

 

3.5.3. Определение активности сорбитолдегидрогеназы

в сыворотке крови по реакции с резорцином

(метод Севела, Товарек)

 

Принцип. d-сорбитол под действием фермента сыворотки в присутствии НАД превращается во фруктозу; при реакции фруктозы с резорцином образуется розово-красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся фруктозы.

Реактивы.

1. 0,5М раствор d-сорбитола на 0,05М трис-буфере.

0,225 г d-сорбитола (флакон N 1 по набору)<*> растворяют в 2,5 мл 0,05М трис-буфера. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

--------------------------------

<*> Набор реактивов для определения активности сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови, производство СССР.

 

2. 0,05М трис-буфер, рН-8,8. 70,5 мг триса (оксиметиламинометан) (флакон N 2 по набору) растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,4 мл 0,2н раствора соляной кислоты. Проверяют рН. Доводят дистиллированной водой до 10 мл. Раствор стабилен в течение года при хранении при комнатной температуре.

3. 0,006М раствор никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД). 25,0 мг НАД (флакон N 3 по набору) растворяют в 4,5 мл трис-буфера. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.

4. 10% раствор трихлоруксусной кислоты (флакон N 4 по набору).

5. 0,1% раствор резорцина в 96 град. этаноле (флакон N 5 по набору).

6. 30% раствор соляной кислоты.

7. 0,2н раствор соляной кислоты.

8. Калибровочный раствор фруктозы.27 мг фруктозы растворяют в

небольшом количестве 0,9% раствора хлористого натрия, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки 0,9% раствором хлористого натрия (флакон N 6 по набору).

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Термостат.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку вносят 0,1 мл 0,5М раствора d-сорбитола и 0,3 мл сыворотки, прогревают 5 минут при +37 град. С, затем добавляют 0,2 мл 0,006М раствора НАД, предварительно прогретого при 37 град. С, и инкубируют 30 минут при 37 град. С. Инкубацию прерывают добавлением 0,4 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости, 0,5 мл раствора резорцина, 1,5 мл 30% раствора соляной кислоты, перемешивают и помещают в водяную баню при 80 град. С точно на 8 минут, охлаждают. Возникающее розово-красное окрашивание измеряют на ФЭКе при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против холостой пробы.

Холостую пробу ставят как опытную, но раствор трихлоруксусной кислоты добавляют до инкубации.

Расчет активности производят по калибровочному графику. Активность сорбитолдегидрогеназы выражают в микромолях фруктозы, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 часа при 37 град. С.

Построение калибровочного графика. Из калибровочного раствора фруктозы готовят ряд разведений с добавлением реактивов, как указано в таблице. Далее калибровочные пробы помещают в водяную баню при 80 град. С на 8 минут, охлаждают и измеряют при тех же условиях, что и опытные пробы, против холостой пробы.

В холостую пробу вместо калибровочного раствора добавляют 0,9% раствор хлористого натрия.

Пересчет активности сорбитолдегидрогеназы на микромоли фруктозы на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С производят по формуле:

 

    Активность сорбитолдегидрогеназы   С х 3,3 х 2

    в мкмолях/мл/час                 = -----------

                                           180

 

NN  про- би  рок	Калибровоч- ный раствор фруктозы   (мл)	0,9% р-р NaCl	Р-р сор- би- тола	Трис -   бу- фер	Раствор три-   хлор-  уксус- ной    кислоты	Раст- вор  ре-  зор- цина	30%  р-р  соля- ной  кис- лоты	Содержа-  ние фрук- тозы в ка- либровоч- ной пробе (мкг)	Актив-  ность в мкмолях/ час/мл  сыворот- ки
1	0,2 калибр. раствора,  развед.   в 10 раз 0,9% р-ром NaCl	0,1	0,1	0,2	0,4	1,0	3,0	5,4	0,2
2	0,05	0,25	0,1	0,2	0,4	1,0	3,0	13,5	0,5
3	0,1	0,2	0,1	0,2	0,4	1,0	3,0	27,0	1,0
4	0,2	0,1	0,1	0,2	0,4	1,0	3,0	54,0	2,0
5	0,3	-	0,1	0,2	0,4	1,0	3,0	81,0	3,0

 

    где: С   - мкг фруктозы в калибровочной пробе,

         3,3 - коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки,

         2   - коэффициент пересчета на 1 час инкубации,

       180   - вес 1 микромоля фруктозы в мкг.

 

Прямолинейная зависимость сохраняется от 0 до 3,0 микромолей фруктозы на мл/час.

Нормальные величины. В сыворотке крови здоровых людей активность сорбитолдегидрогеназы равна нулю или очень небольшим величинам - 0,02+/-0,002 мкм/час на 1,0 мл.

Примечания.

1. Сыворотка должна быть свободной от гемолиза.

2. Фермент сыворотки термолабилен. Чтобы избежать потери активности фермента, сыворотку рекомендуется хранить при температуре от -8 град. С до -20 град. С.

 

Литература.

1. Sevela M., Tovarek Y. - Vnitrni lek., 1961, 7, 1392.

2. Громашевская Л.Л. - Инструкция к набору реактивов для определения активности сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови.

 

3.5.4. Определение активности трипсина в биологических

жидкостях с субстратом N, альфа-бензоил-Д,

l-аргинин-р-нитроанилид (БАПН) (метод Эрлангера в

модификации Шатерникова)

 

Принцип. При действии трипсина на синтетический субстрат N, альфа-бензоил-Д, l-аргинин-р-нитроанилид - образуются бензоил-Д,альфа-аргинин и пара-нитроанилин, окрашенный в желтый цвет. Об активности фермента судят по интенсивности окраски раствора.

Реактивы.

1. 0,2М раствор веронала натрия (мединала). 41,2 веронала натрия (мединала) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем дистиллированной водой до метки. Хранят в холодильнике. Годен в течение месяца.

2. 0,2н раствор соляной кислоты.

3. Вероналовый буфер, рН-8,2. К 50 мл 0,2М раствора веронала натрия добавляют 12,7 мл 0,2н раствора соляной кислоты, проверяют рН и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл. Хранят в холодильнике. Годен в течение месяца.

4. N, N-диметилформамид.

5. 20 мг% раствор N, альфа-бензоил-Д, l-аргинин-р-нитроанилида в вероналовом буфере. 2 мг БАПН растворяют в 0,1 мл N,N-диметилформамида при нагревании на водяной бане и доводят вероналовым буфером до 10 мл. Готовят непосредственно перед употреблением.

6. 0,5н раствор соляной кислоты.

7. 0,85% раствор хлористого натрия.

8. Калибровочный раствор пара-нитроанилина. 13,8 мг пара-нитроанилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят водой объем до метки. 1 мл раствора содержит 100 мкМ пара-нитроанилина.

Специальное оборудование.

Спектрофотометр.

Термостат.

Колбы мерные.

Ход определения. Сыворотку крови разводят физиологическим раствором 1:1. Дуоденальное содержимое разводят физиологическим раствором 1:10. Используют порции дуоденального содержимого только щелочной реакции. Если имеются хлопья, то дуоденальное содержимое предварительно фильтруют.

Опытная проба. К 0,5 мл соответствующим образом разведенной биологической жидкости прибавляют 4 мл рабочего раствора БАПН. Инкубируют 30 мин. при 37 град. С. После инкубации добавляют 0,5 мл 0,5н раствора соляной кислоты. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре против дистиллированной воды при длине волны 410 нм.

Холостую пробу ставят как опытную, но раствор соляной кислоты добавляют до инкубации. Из экстинкции опытной пробы вычитают экстинкцию холостой пробы.

Расчет активности трипсина проводят по калибровочному графику. Активность трипсина выражают в микромолях пара-нитроанилина, образовавшегося в результате расщепления субстрата 1 миллилитром не разведенного биологического материала за 1 минуту при 37 град. С.

Построение калибровочного графика. Из калибровочного раствора пара-нитроанилина готовят ряд разведений, как указано в таблице:

 

┌────────┬────────────────┬───────────────────────┬──────────────┐

│   NN   │ Калибровочный  │    Дистиллированная   │ Содержание   │

│  п/п   │   раствор      │         вода          │   р-НА в     │

│        │    (мл)        │         (мл)          │калибровочной │

│        │                │                       │   пробе      │

│        │                │                       │  (мкмоль)    │

├────────┼────────────────┼───────────────────────┼──────────────┤

│    1   │    0,5         │       4,5             │     50       │

│    2   │    1,0         │       4,0             │     100      │

│    3   │    2,0         │       3,0             │     200      │

│    4   │    3,0         │       2,0             │     300      │

│    5   │    4,0         │       1,0             │     400      │

│    6   │    5,0         │       -               │     500      │

└────────┴────────────────┴───────────────────────┴──────────────┘

 

Измерение оптической плотности растворов пара-нитроанилина проводят на спектрофотометре при длине волны 410 нм против дистиллированной воды. Строят калибровочный график, откладывая на оси ординат значения оптической плотности, а на оси абсцисс-концентрацию пара-нитроанилина в микромолях. По разности экстинкций опытной и холостой проб находят по калибровочному графику микромоли пара-нитроанилина. Пересчет активности трипсина на 1 мл неразведенной биологической жидкости в 1 минуту производят по формуле:

 

                           С х К

    Активность трипсина  = -----,

    в мкМ/мл/мин             t

 

    где: С  -  микромоли  пара  -   нитроанилина,   найденные   по

калибровочному графику,

         К - коэффициент пересчета на 1 мл биологической  жидкости

(для сыворотки крови - 4, для дуоденального содержимого - 20),

         t - коэффициент пересчета на 1  минуту  инкубации  (время

инкубации - 30 минут).

    Прямолинейная зависимость   между   концентрацией    пара    -

нитроанилина и оптической плотностью сохраняется до 100 мкМ пара -

нитроанилина на 1 мл.

    Нормальные величины. Активность трипсина:

    сыворотки крови - 1-4 микромоля/мл/мин

                      (60-240 микромолей/мл/час)

    дуоденального содержимого - 50-500 микромолей/мл/мин

                                (3.000-30.000 микромолей/мл/час)

 

Литература.

1. Erlander B.F., Kokovski N., Cohen N. - Arch. Biochem. Biophys., 1961, 95, 271.

2. Шатерников В.А. - Вопросы мед. химии, 1966, 12, 1.

 

3.5.5. Определение активности холинэстеразы

в сыворотке крови колориметрическим методом

по гидролизу ацетилхолинхлорида

 

Принцип. Под действием холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхолинхлорида с образованием уксусной кислоты и холина. Уксусная кислота сдвигает рН раствора, что устанавливается с помощью индикатора.

Реактивы.

1. 0,9М раствор ацетилхолинхлорида - 1,67 г ацетилхолинхлорида растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Удобно использовать фармакопейный ампулированный препарат ацетилхолинхлорида. Содержимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл дистиллированной воды.

2. 0,0075М вероналовый буфер, рН-8,4. 1,5450 г натриевой соли веронала растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 9,0 мл 0,1н раствора соляной кислоты и 150 мл 0,01% раствора индикатора - фенолового красного. Измеряют рН. Доливают дистиллированной водой до 1 литра. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Годен в течение месяца.

3. Индикатор - феноловый красный. Область действия - 6,8-8,4 рН. Изменение окраски от желтой к красной. 0,1 г сухого индикатора растирают в фарфоровой ступке с 5,7 мл 0,05н раствора едкого натра, количественно переносят в мерный цилиндр и доводят до 25 мл дистиллированной водой. Из полученного 0,4% раствора перед употреблением готовят 0,01% раствор разведением дистиллированной водой в 40 раз.

4. 0,1н раствор соляной кислоты.

5. 0,05н раствор едкого натра.

6. 0,7% раствор прозерина. 0,7 г прозерина растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Хранят в посуде из темного стекла.

7. 0,1н калибровочный раствор уксусной кислоты. 0,57 мл ледяной уксусной кислоты (хч) разбавляют дистиллированной водой до 100 мл в мерной колбе. Для проверки нормальности приготовленный раствор уксусной кислоты титруют 0,1н раствором щелочи по фенолфталеину до появления слабо розовой окраски. Нормальность раствора едкого натра определяют по точному 0,1н раствору щавелевой кислоты.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр.

Термостат.

Колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. Смешивают 5,0 мл вероналового буфера, 0,2 мл дистиллированной воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают при 37 град. С в течение 5 минут. Затем добавляют 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкубируют в течение 30 минут при 37 град. С. После инкубации добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Охлаждают и измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против воды. Окраска устойчива в течение одного часа.

Холостую пробу ставят как опыт, но раствор прозерина добавляют до инкубации. Из экстинкции холостой пробы вычитают экстинкцию опытной пробы.

Расчет ведут по калибровочному графику. Активность холинэстеразы выражают в микромолях уксусной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение часа при 37 град. С.

Построение калибровочного графика. Из 0,1н раствора уксусной кислоты готовят разведения, как указано в таблице:

 

┌────┬─────────────┬────────────────┬───────────────┬────────────┐

│ NN │ 0,1н раствор│Дистиллированная│  Содержание   │Активность в│

│ п/п│   уксусной  │    вода (мл)   │уксусн. кислоты│ микромолях/│

│    │ кислоты (мл)│                │в калибровочной│  час/мл    │

│    │             │                │     пробе     │ сыворотки  │

│    │             │                │  (микромоль)  │            │

├────┼─────────────┼────────────────┼───────────────┼────────────┤

│ 1  │     2,0     │      8,0       │      4        │     80     │

│ 2  │     4,0     │      6,0       │      8        │     160    │

│ 3  │     6,0     │      4,0       │      12       │     240    │

│ 4  │     8,0     │      2,0       │      16       │     320    │

│ 5  │     9,0     │      1,0       │      18       │     360    │

└────┴─────────────┴────────────────┴───────────────┴────────────┘

 

Из каждого разведенного раствора берут по 0,2 мл, смешивают с 5,0 мл вероналового буфера, 0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при 37 град. С, затем добавляют 0,2 мл прозерина, 0,2 мл ацетилхолинхлорида, инкубируют 30 минут при 37 град. С и охлаждают. Измерение проводят при тех же условиях, что и опытные пробы.

Холостую пробу ставят как калибровочную, но вместо растворов уксусной кислоты добавляют дистиллированную воду. Из экстинкции холостой пробы вычитают экстинкцию калибровочной пробы. На оси ординат откладывают полученную разницу экстинкций, на оси абсцисс-микромоли уксусной кислоты.

Пересчет активности холинэстеразы в микромоли уксусной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С производят по формуле:

 

    Активность холинэстеразы

    в микромолях/мл/час      = С х 10 х 2

 

где: С - микромоли уксусной кислоты в калибровочной пробе,

10 - коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки,

2 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации.

Прямолинейная зависимость калибровочного графика сохраняется в пределах от 0 до 400 микромолей/мл/час.

Нормальные величины - 160-340 микромолей уксусной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации.

Примечания.

1. Сыворотка должна быть свободной от гемолиза.

2. Нормальные величины активности фермента в сыворотке крови желательно проверять на донорах в каждой лаборатории.

3. Лимоннокислую и щавелевоуксусную плазму употреблять нельзя, так как соли лимонной и щавелевой кислот ингибируют активность фермента.

 

Литература.

1. Schafer C.W., Dopke K.H., Goll und Gothe W. - Arzn. standard, 1967, 3, 84.

2. Molander D., Friedman M., La Due Y. - Ann. Int. Med., 1954, 41, 6, 1139-1151.

3. Делекторская Л.Н., Добрянская Л.Д., В кн: Унифицированные методы клинических лабораторных исследований. Под ред. В.В.Меньшикова. Вып. VI, М., 1974.

 

3.5.6. Определение активности холинэстеразы

в сыворотке крови экспресс-методом

с применением индикаторной бумаги

(Метод Герцфельда и Штрумпфа в модификации

Децика и Туркевича)

 

Определение проводят строго по инструкции.

Холинэстеразная индикаторная бумага представляет собой полоску хроматографической бумаги, размером 65х10 мм с линией перфорации, отделяющей конец индикаторной бумаги - 20х10 мм, пропитанной ацетилхолином и индикатором, меняющим цвет в зависимости от рН среды. После контакта исследуемой сыворотки с индикаторной бумагой, под влиянием холинэстеразы наступает гидролиз ацетилхолина и освобождается уксусная кислота, которая влияет на рН и меняет цвет индикатора. Реакция должна продолжаться до тех пор, пока рН достигнет определенного уровня, а соответствующий этому цвет индикаторной бумаги не сравняется с цветом эталона.

Мерой активности холинэстеразы является время (в минутах), на протяжении которого под влиянием исследуемой сыворотки происходит изменение цвета индикаторной бумаги вплоть до совпадения с цветом эталона.

Ход определения. Микропипеткой наносят 0,05 мл сыворотки крови на поверхность химически чистого предметного стекла. Стекло должно лежать на белой бумаге (белый фон).

На каплю сыворотки, находящуюся на предметном стекле, помещают пропитанный конец индикаторной бумаги до границы с линией перфорации. Затем быстро накладывают второе предметное стекло, слегка прижимая его с целью равномерного распределения сыворотки в полоске индикаторной бумаги. Верхнее стекло не следует снимать, чтобы не вызвать высыхания бумаги.

Рядом кладут эталон, представляющий собой полоску бумаги с желто-зеленым цветом.

Определение должно проводиться при комнатной температуре - 18-22 град. С.

Индикаторная бумага в сухом виде имеет желтый цвет; после контакта с сывороткой цвет ее становится темно-зеленым или сине-зеленым, на протяжении реакции меняется в пределах различных оттенков зеленого цвета и в конце определения сравнивается с желто-зеленым цветом бумаги - эталона.

Отсчет времени ведется с момента контакта индикаторной бумаги с сывороткой до момента, когда цвет этой бумаги сравняется с цветом эталона.

Время от 7 до 21 минуты соответствует нормальной активности холинэстеразы; время меньше 6 минут - повышенной активности, и наконец, время от 41 до 60 и больше минут свидетельствует о резком снижении активности фермента.

Расхождение результатов в параллельных определениях - не больше 21 минуты.

 

Литература.

Инструкция по определению активности сывороточной холинэстеразы микроэкспресс-методом Герцфельда и Штрумпфе в модификации Ю.И.Децика и Н.Н.Туркевича. Инструкция разработана Львовским государственным медицинским институтом совместно с Рижским заводом "Реагент" и согласована с Всесоюзным научно-методическим центром по лабораторному делу.

 

3.5.7. Обнаружение активности

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов

(проба Бернштейна)

 

Принцип. Глюкозо-6-фосфат в присутствии глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов и НАДФ окисляется с образованием НАДФ-Н. НАДФ-Н восстанавливает феназин метосульфат, который, в свою очередь, восстанавливает 2,6-дихлорфенолиндофенол. Феназин метосульфат действует в этой реакции как активный переносчик электронов от НАДФ к краске, что значительно убыстряет ход реакции.

Реактивы.

1. Раствор никотинамид-аденин-динуклеотидфосфата (НАДФ). 5,75 мг НАДФ растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды. Хранят в холодильнике. Стабилен в течение 4 недель.

2. Раствор глюкозо-6-фосфата. 38 мг глюкозо-6-фосфатдинатриевой соли растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды.

Так как в продаже чаще имеется бариевая соль глюкозо-6-фосфата, то перевод ее в динатриевую соль осуществляется следующим способом: 60,0 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата растворяют в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл насыщенного раствора сернокислого натрия, центрифугируют. Отбирают весь надосадочный слой и прибавляют к нему 1,3 мл дистиллированной воды. Раствор используют для определения активности фермента. Хранят в холодильнике.

3. 2 мг% водный раствор феназин метосульфата. Раствор - не стабилен, готовят перед употреблением.

4. 1н раствор соляной кислоты.

5. 0,74М трис-буфер, рН-8,0. 44,8 г триса (гидроксиметиламинометана) растворяют в 200 мл дистиллированной воды, прибавляют 1н раствор соляной кислоты до получения рН-8,0 и доводят дистиллированной водой до 500 мл. Хранят в холодильнике.

6. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в трис-буфере. К 5,8 мг 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия прибавляют 40 мл 0,74М трис-буфера, рН-8,0. Хранят в холодильнике.

7. Для реакции используют смесь реактивов, состоящую из: одной части раствора НАДФ, одной части раствора глюкозо-6-фосфата, двух частей раствора феназин метосульфата, 16-ти частей раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Смесь реактивов - не стабильна, готовят перед употреблением.

Специальное оборудование. Не требуется.

Ход определения. Опытная проба. В пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды, добавляют 0,02 мл крови и после наступления полного гемолиза (через 5-10 минут) прибавляют 0,5 мл смеси реактивов. При проведении массовых исследований прибавление смеси может быть проведено одновременно в 35-40 пробах. Время от момента взятия крови до прибавления реактива не должно превышать 45 минут. Через 30 минут производят оценку результатов.

Контрольная проба ставится как опытная, для исследования берется кровь практически здорового человека.

Оценка результатов.

Отрицательная реакция (в норме) - происходит полное обесцвечивание краски.

Сомнительная (+/-) - происходит явное обесцвечивание, но по сравнению с контрольной пробой остается зеленоватый оттенок.

Положительная реакция - обесцвечивания краски не происходит или происходит очень незначительно.

Примечания.

1. При работе в экспедиционных условиях заранее приготовляются навески реактивов в зависимости от количества исследований, запланированных на 1 раз.

2. Сомнительные (+/-) реакции не должны приниматься в расчет при массовом обследовании населения; плохо вымытая пробирка может симулировать сомнительную (+/-) реакцию. При массовых исследованиях имеют значение резко положительные и положительные реакции.

3. Сомнительные (+/-) реакции следует принимать во внимание и проверять активность фермента количественным методом у женщин с подозрением на гемолитическую анемию, обусловленную дефицитом активности фермента, особенно после приема лекарств, вызывающих гемолитические кризы у этих больных.

 

Литература.

Bernstein R.E. - Nature, 1962, 194, 192. Идельсон Л.И., Котоян

Э.Р. - Лабор. дело, 1970, 7, 428.

 

4. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

4.1. ИЗОИММУНОЛОГИЯ (ИЗОСЕРОЛОГИЯ)

 

4.1.1. Определение групп крови системы АВО

при помощи стандартных сывороток

 

Принцип. Реакцией агглютинации с помощью стандартных сывороток определяют групповые агглютиногены в эритроцитах исследуемой крови, что дает возможность судить о групповой принадлежности исследуемой крови.

Реагенты.

1. Стандартная сыворотка группы 0 альфа-бета (I) двух различных серий.

2. Стандартная сыворотка группы А-бета (II) двух различных серий.

3. Стандартная сыворотка группы В-альфа (III) двух различных серий.

4. Стандартная сыворотка группы АВ (IV).

Сыворотки можно применять не окрашенными или окрашенными: группы А-бета(II) - в синий цвет, группы В-альфа (III) - в красный цвет и группы АВ(IV) - в желтый цвет.

Хранят сыворотки в холодильнике. Срок годности указан на этикетках.

5. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

Специальное оборудование.

Белые пластинки со смачиваемой поверхностью.

Стаканы химические.

Штативы для ампул или флаконов со стандартными сыворотками.

Ход определения. Определение группы крови производят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25 град. С. Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в два штатива с тремя гнездами каждый или в один штатив с двумя рядами гнезд. В левые гнезда ставят сыворотку группы 0-альфа-бета(I), в средние - сыворотку группы А-бета(II) и в правые - сыворотку группы В-альфа(III). Отдельно ставят сыворотку группы АВ(IV), употребляемую в качестве дополнительного контроля. Сухие пипетки опускают во все ампулы со стандартными сыворотками и в пробирку с физиологическим раствором. Для промывания стеклянных палочек и пипеток подготавливают химические стаканы с водой и физиологическим раствором. На пластинке делают надпись: на левой стороне 0-альфа-бета, в середине - А-бета, справа В-альфа и на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови. Под соответствующей надписью наносят по 0,1 мл (1 большая капля) каждой стандартной сыворотки. Всего получается 6 капель - два ряда по три капли в каждом, в следующем порядке слева направо: 0-альфа-бета(I), А-бета(II) и В-альфа(III). Пипетку, которой берут сыворотку из ампулы, тотчас же после того, как из нее выпущена сыворотка, опускают в ту же ампулу, из которой она взята. Кровь для исследования берут из пальца или из мочки уха. 0,01 мл (1 маленькая капля) крови сухой стеклянной палочкой наносят рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Стеклянными палочками перемешивают капли стандартной сыворотки с находящимися рядом с ними каплями исследуемой крови - каждую отдельной палочкой. Можно перемешивать кровь с сыворотками одной стеклянной палочкой, но в этом случае необходимо после перемешивания каждой капли промывать палочку в воде и насухо ее вытирать. После размешивания капель пластину покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически ее покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее 5 минут, хотя агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд, так как возможна поздняя агглютинация, например, с эритроцитами группы А2(II). По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты, в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют по 0,05 мл (1 капля) физиологического раствора и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения 5 минут, после чего оценивают результат.

Оценка результатов. Реакция в каждой капле может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные зернышки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов, которые постепенно сливаются в более крупные зерна или хлопья неправильной формы. При этом сыворотка полностью или частично обесцвечивается. При отрицательной реакции на протяжении всего времени наблюдения (5 минут) жидкость остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживают никаких агглютинатов. Результаты реакции в каплях с сыворотками одной группы должны быть одинаковыми для обеих серий. Всего может получиться четыре различных комбинации положительных и отрицательных реакций (см. рис. 1). <*>

--------------------------------

<*> Рисунок не приводится.

 

1. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию, т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без признаков агглютинации, испытуемая кровь принадлежит к группе 0(I).

2. Если сыворотки групп 0-альфа-бета(I) и В-альфа(III) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А-бета(II) - отрицательную, испытуемая кровь принадлежит к группе А(II).

3. Если сыворотки групп 0-альфа-бета(I) и А-бета(II) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В-альфа(III) - отрицательную, испытуемая кровь принадлежит к группе В(III).

4. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, то в этих случаях для исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых эритроцитов проводится дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВ0(IV).

Для этого на пластинку наносят 0,1 мл (1 большая капля) стандартной сыворотки группы АВ0(IV), добавляют 0,01 мл (1 маленькая капля, величиной с булавочную головку) исследуемой крови, перемешивают и наблюдают за результатом при периодическом покачивании пластинки в течение 5 минут. Отсутствие агглютинации в этой капле при наличии ее во всех остальных позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ(IV). Наличие агглютинации с сывороткой группы АВ0(IV) говорить о неспецифической агглютинабельности эритроцитов (аутоагглютинация), панагглютинация). В этих случаях исследование следует повторить с отмытыми эритроцитами.

Примечание. При получении сомнительного или нечеткого результата исследуют кровь данного лица повторно стандартными сыворотками других серий. Если результаты остаются неясными, то следует определить группу крови перекрестным способом при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов.

 

4.1.2. Определение групп крови системы АВО

перекрестным способом при помощи стандартных

сывороток и стандартных эритроцитов

 

Принцип. Определение реакцией агглютинации одновременно групповых агглютиногенов в эритроцитах исследуемой крови при помощи стандартных сывороток и групповых агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных эритроцитов позволяет с достоверностью установить групповую принадлежность исследуемой крови.

Реагенты.

1. Стандартная сыворотка группы 0-альфа-бета(I) двух различных серий.

2. Стандартная сыворотка группы А-бета(II) двух различных серий.

3. Стандартная сыворотка группы В-альфа(III) двух различных серий.

4. Стандартная сыворотка группы АВ(IV).

Сыворотки можно применять не окрашенными или окрашенными: группы А(II) - в синий цвет, группы В(III) - в красный цвет и группы АВ(IV) - в желтый цвет.

Хранят сыворотки в холодильнике. Срок годности указан на этикетках.

5. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

6. Стандартные эритроциты групп 0(I), А(II) и В(III).

В центрифужную пробирку, содержащую 0,25-0,5 мл изотонического раствора лимоннокислого натрия, добавляют 2-4 мл крови доноров, затем пробирку на 3/4 заполняют физиологическим раствором, содержимое ее перемешивают и центрифугируют или оставляют стоять до оседания эритроцитов. Стандартные эритроциты хранят в холодильнике. Срок годности - 2-3 дня.

Специальное оборудование.

Белые пластинки со смачиваемой поверхностью.

Стаканы химические.

Штативы для пробирок, ампул и флаконов со стандартными сыворотками.

Ход определения. Определение группы крови производят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25 град. С. Ампулы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в два штатива с тремя гнездами каждый или в один штатив с двумя рядами гнезд. В левые гнезда ставят сыворотку группы 0-альфа-бета(I), в средние - сыворотку группы А-бета(II) и в правые - сыворотку группы В-альфа(III). Отдельно ставят сыворотку группы АВ0(IV), употребляемую в качестве дополнительного контроля. Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в отдельный штатив с 3 гнездами в следующем порядке: слева - группы 0(I), в середине - группы А(II) и справа - группы В(III). Сухие пипетки опускают во все ампулы (флаконы) со стандартными сыворотками, в пробирку с физиологическим раствором и в пробирки со стандартными эритроцитами. Для промывания стеклянных палочек и пипеток подготавливают стаканы с водой и с физиологическим раствором.

На пластинке делают надписи слева направо: 0-альфа-бета, А-бета и В-альфа для стандартных сывороток и 0, А и В - для стандартных эритроцитов. На верхнем крае пластинки надписывают фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.

Под соответствующими обозначениями наносят по 0,1 мл (1 большая капля) всех стандартных сывороток. Получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке (слева направо): 0-альфа-бета(I), А-бета(II), В-альфа(III). На нижнюю часть пластинки, также у соответствующих обозначений, наносят по 0,01 мл (1 маленькая капля, величиной с булавочную головку) стандартных эритроцитов. Исследуемую кровь берут из вены, пальца или из мочки уха в сухую пробирку. Для отделения сыворотки кровь центрифугируют или оставляют стоять на 20-30 минут.

Из пробирки, содержащей исследуемую кровь, пипеткой извлекают сыворотку так, чтобы не взболтать эритроциты, и капают по 0,1 мл (1 большая капля) на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна пробирки эритроциты исследуемой крови и наносят их по 0,01 мл (1 маленькая капля) рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки. Во всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.

Наблюдение за ходом реакции продолжается не менее 5 минут. Агглютинация в каплях со стандартной сывороткой обычно начинается через 10-30 секунд, агглютинация же в каплях со стандартными эритроцитами может наступить позже, даже к концу 5 минуты, в связи с возможностью низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке агглютининов. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты, в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют по одной капле физиологического раствора и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения 5 минут.

Оценка результатов. Результаты реакций, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать, т.е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов, соответствующих одной и той же группе крови. Возможны 4 варианта (рис. 2) (рисунки не приводятся).

1. Реакция со стандартными сыворотками указывает на принадлежность исследуемой крови к группе 0(I). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы 0(I) и положительную - с эритроцитами групп А(II) и В(III). Это указывает на наличие в сыворотке агглютининов альфа и бета, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе 0-альфа-бета(I).

2. Реакция со стандартными сыворотками указывает на принадлежность исследуемой крови к группе А(II). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и А(II), но положительную - с эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в сыворотке агглютининов бета, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе А-бета(II).

3. Реакция со стандартными сыворотками указывает на принадлежность исследуемой крови к группе В(III). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и В(III), но положительную - с эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в сыворотке агглютининов альфа, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе В-альфа(III).

4. Реакция со стандартными сыворотками указывает на принадлежность исследуемой крови к группе АВ(IV). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, т.е. не содержит агглютининов, что подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе АВ(IV).

Примечание. Причины ошибок:

1. Ошибочный порядок расположения стандартных сывороток или стандартных эритроцитов в штативах.

2. Ошибочный порядок нанесения стандартных сывороток или стандартных эритроцитов на пластинку.

3. Неправильное соотношение количества сыворотки и эритроцитов (при избытке крови реакция может быть оценена как отрицательная при фактическом наличии агглютинации).

4. Несоблюдение времени наблюдения (при учете результатов реакции до истечения 5 минут поздно наступившая агглютинация может быть пропущена; при слишком долгом наблюдении (более 5 минут) смесь эритроцитов и сыворотки начинает подсыхать, и агрегация эритроцитов по периферии капли может быть принята за агглютинацию).

5. Отсутствие дополнительного контрольного исследования со стандартной сывороткой группы АВ(IV), в результате чего феномен ауто- или панагглютинации может быть оценен как положительный результат реакции.

6. Грязная или мокрая посуда, применяемая в реакции.

7. Использование недоброкачественных стандартных сывороток - недостаточно активных (с истекшим сроком годности, агглютинирующая способность которых не проверена), загрязненных или частично высохших.

8. Несоблюдение температурных условий проведения реакции - при температуре воздуха выше 25 град. С агглютинация может быть не замечена, ниже 15 град. С - может появиться неспецифическая агглютинация.

9. Образование "монетных столбиков" из эритроцитов, которые невооруженным глазом можно принять за агглютинацию. Прибавление физиологического раствора с последующим покачиванием разрушает их.

10. Отсутствие покачивания пластинки, на которой проводится определение, приводящее к оседанию эритроцитов на дно и образованию отдельных скоплений, могущих симулировать агглютинацию.

 

4.1.3. Определение резус-фактора методом

агглютинации в солевой среде и пробирках

 

Принцип. Исследуемые эритроциты смешивают со стандартной сывороткой антирезус, содержащей полные резус-антитела. Если исследуемые эритроциты резус-положительны, происходит их агглютинация, наличие которой устанавливают по форме осадка эритроцитов.

Реагенты.

1. Стандартные сыворотки антирезус с полными антителами, приготовленные для этого метода, двух различных серий. Группа стандартной сыворотки должна быть совместима с исследуемой: сыворотка антирезус группы 0(I) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах группы 0(I); сыворотка антирезус группы А(II) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах групп 0(I) и А(II); сыворотка антирезус группы В(III) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах групп 0(I) и В(III); сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная "универсальная" сыворотка пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы. Хранят стандартные сыворотки в холодильнике, срок годности указан на этикетке.

Если в распоряжении лаборатории не имеется второй серии сыворотки антирезус для данного метода, то можно пользоваться любой другой стандартной сывороткой, применяя тот метод, в котором она активна (метод указан в сопроводительной инструкции).

Стандартная сыворотка с полными антителами может быть использована неоднократно. Для этого после определения резус-фактора из всех пробирок острожно отсасывают сыворотку, не захватывая эритроцитов, и собирают ее в ампулу. Такая сыворотка пригодна для использования до тех пор, пока не потеряет активность.

2. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

4. Стандартные эритроциты для контроля. Применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы 0(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.

Специальное оборудование.

Термостат на 37 град. С.

Лупа.

Пробирки высотой 2-2,5 см и диаметром 0,5-0,6 см с гладким дном сферической формы.

Штативы для пробирок.

Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови и крови для получения стандартных эритроцитов. Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1,0 мл в центрифужные пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора лимоннокислого натрия. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь. Для этого в других, соответственно обозначенных, пробирках смешивают 2,45 мл (49 капель) физиологического раствора и 0,05 мл (1 капля) осадка отмытых эритроцитов.

Можно пользоваться также эритроцитами, оставшимися свободными после свертывания крови. Пробирку со свернувшейся кровью энергично встряхивают для отделения большего количества эритроцитов, отмывают их от сыворотки физиологическим раствором и готовят из них 2% взвесь, как это описано выше.

Допустимо хранить кровь до отмывания эритроцитов в течение 2-3 суток в холодильнике.

Ход определения. В штативе устанавливают два ряда пробирок: в каждом ряду по числу исследуемых и стандартных образцов эритроцитов для контроля. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, слегка накалывают на нем отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будут исследовать.

Во все пробирки первого ряда вводят по 0,1 мл (2 капли) сыворотки антирезус одной серии, разведенной равным количеством физиологического раствора; во все пробирки второго ряда - по 0,1 мл (2 капли) сыворотки антирезус другой серии, также разведенной равным количеством физиологического раствора. В одинаково обозначенные пары пробирок добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2% взвеси исследуемых эритроцитов, в одну пару контрольных пробирок - по 0,05 мл (1 каплю) 2% взвеси стандартных резус-положительных эритроцитов группы 0(I) или одноименной с исследуемой кровью, а в другую пару контрольных пробирок - по 0,05 мл (1 каплю) 2% взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемая кровь. Содержимое пробирок тщательно перемешивают встряхиванием и помещают на 1 час в термостат при 37 град. С. Для оценки полученных результатов следует рассматривать пробирки по продольной оси над источником света, закрытым матовым стеклом.

Оценка результатов. Результаты могут быть положительными и отрицательными. При положительном результате - наличии агглютинации - осадок эритроцитов располагается на дне пробирки неравномерным слоем. Видна шероховатость или зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой центральной части. При отрицательном результате - отсутствии агглютинации - осадок располагается совершенно равномерным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда - с небольшим просветлением в центре; границы его представляют собой правильно очерченный круг. Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше, чем при положительном. Результаты считаются истинными при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов (при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами).

Примечание. Если наблюдается слабая или сомнительная реакция, то кровь данного лица исследуют повторно этими же и другими сериями сыворотки антирезус, включая и сыворотки, содержащие неполные антитела.

 

4.1.4. Определение резус-фактора методом конглютинации

с применением желатины

 

Принцип. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной сывороткой антирезус, содержащей неполные антитела - резус, в коллоидной среде - растворе желатины. Если исследуемые эритроциты резус-положительны, происходит их склеивание - конглютинация, которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь физиологического раствора. Резус-отрицательные эритроциты не склеиваются.

Реагенты.

1. Стандартные сыворотки антирезус с неполными антителами, приготовленные для этого метода, двух различных серий. Группа стандартной сыворотки должна быть совместима с исследуемой: сыворотка антирезус 0(I) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах группы 0(I); сыворотка антирезус групп (II) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах групп (I) и А(II); сыворотка антирезус групп В(III) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах группы 0(I) и В(III); сыворотка антирезус группы АВ(IV) и специально приготовленная "универсальная" сыворотка пригодны для определения резус-фактора в эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови. Хранят стандартные сыворотки в холодильнике, срок годности указан на этикетке.

Если в распоряжении лаборатории не имеется второй серии сыворотки антирезус для данного метода, то можно пользоваться любой другой стандартной сывороткой, применяя тот метод, в котором она активна (метод указан в сопроводительной инструкции).

2. 10% раствор желатины, выпускаемый в ампулах заводом им. Семашко. Вскрытые ампулы хранить в холодильнике не более 2-3 дней. Раствор желатины мутный, с хлопьями или не застывающий при комнатной температуре употреблять нельзя.

3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

4. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

5. Стандартные эритроциты для контроля. Применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы 0(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.

Специальное оборудование.

Водяная баня или термостат на 48 град. С.

Пробирки, объемом не менее 10 мл.

Лупа с 2-кратным увеличением.

Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови и крови для получения стандартных эритроцитов. Кровь берут в сухую пробирку без стабилизатора в количестве 1-3 мл. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Для исследования берут эритроциты, оставшиеся свободными после свертывания крови. Если их окажется недостаточно, пробирку со свернувшейся кровью энергично встряхивают для отделения большего количества эритроцитов.

Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого натрия (0,25 мл на 1 мл крови), но тогда эритроциты необходимо отмыть; для этого пробирку с кровью на 3/4 заполняют физиологическим раствором, содержимое перемешивают и центрифугируют. Хранят кровь в течение 2-3 суток в холодильнике.

Ход определения. В штатив устанавливают три ряда пробирок: в каждом ряду по количеству исследуемых образцов эритроцитов для контроля. На каждых трех пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будут исследовать.

В одинаково обозначенные три пробирки каждого ряда вносят по 0,05 мл (1 капля) исследуемых эритроцитов, в три контрольные пробирки - по 0,05 мл (1 капля) стандартных резус-положительных эритроцитов группы 0(I) или группы, одноименной с исследуемой кровью. В других три контрольные пробирки - по 0,05 мл (1 капля) стандартных резус-отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемая кровь. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл (2 капли) 10% раствора желатины, предварительно подогретого до 48 град. С (до разжижения), и пробирки слегка встряхивают для перемешивания. После этого во все пробирки первого ряда вводят по 0,1 мл (2 капли) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки второго ряда - по 0,1 мл (2 капли) сыворотки антирезус другой серии. В пробирки третьего ряда сыворотки антирезус не вводят, эти пробирки служат контролем на отсутствие неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов в присутствии желатины. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и помещают в водяную баню при 48 град. С на 5 минут или в термостат при той же температуре на 30 минут. После прогревания в пробирки приливают 8-10 мл физиологического раствора, предварительно подогретого, и содержимое перемешивают путем перевертывания пробирок. Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.

Оценка результатов. Результат может быть положительным и отрицательным. При положительном результате, когда эритроциты резус-положительны, в пробирке наблюдаются легко различимые красные зерна или хлопья, состоящие из склеенных эритроцитов, на прозрачном, почти обесцвеченном фоне жидкости. При отрицательном результате, когда эритроциты резус-отрицательны, в пробирке видна равномерно окрашенная в розовый цвет, слегка опалесцирующая жидкость.

Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих сериях стандартной сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность стандартной сыворотки: стандартные резус-положительные эритроциты одноименной группы или группы 0(I) должны дать положительный результат, а стандартные резус-отрицательные эритроциты одноименной группы-отрицательный. Кроме того, отрицательный результат должен быть также во всех пробирках третьего ряда, т.е. без сыворотки антирезус.

Примечание. Если при определении резус-принадлежности наблюдается слабая или сомнительная реакция, то кровь данного лица исследуют повторно этими же или другими сериями сыворотки антирезус, причем желательно включить сыворотку с полными антителами.

 

4.1.5. Определение резус-фактора методом монглютинации

в сывороточной среде на чашках Петри

 

Принцип. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной сывороткой антирезус, содержащей неполные антитела - резус, в коллоидной среде - собственной сыворотке. Если исследуемые эритроциты резус-положительны, происходит их склеивание - конглютинация, выявляемая при просмотре жидкости в проходящем свете.

Реагенты.

1. Стандартные сыворотки антирезус с полными антителами, приготовленные для этого метода, двух различных серий. Группа стандартной сыворотки должна быть совместима с исследуемой: сыворотка антирезус группы 0(I) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах группы 0(I); сыворотка антирезус группы А(II) пригодна для определения резус-фактора в эритроцитах групп 0(I) и А(II); сыворотка антирезус группы В(III) пригодная для определения резус-фактора в эритроцитах групп 0(I) и В(III); сыворотка антирезус группы АВ(IV) и специально приготовленная "универсальная" сыворотка пригодны для определения резус-фактора в эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови. Хранят стандартные сыворотки в холодильнике, срок годности указан на этикетке.

Если в распоряжении лаборатории не имеется второй серии сыворотки антирезус для данного метода, то можно пользоваться любой другой стандартной сывороткой, применяя тот метод, в котором она активна (метод указан в сопроводительной инструкции).

2. Стандартные эритроциты для контроля. Применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы 0(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.

Специальное оборудование.

Водяная баня на 48 град. С.

Чашки Петри.

Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови и крови для получения стандартных эритроцитов. Кровь для исследования берут без стабилизатора в количестве 1-2 мл. На пробирках надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Для исследования берут эритроциты, оставшиеся свободными после свертывания крови. Если их окажется недостаточно, пробирку со свернувшейся кровью энергично встряхивают для отделения большего количества эритроцитов. В этой же пробирке готовят примерно 5% взвесь эритроцитов в той же сыворотке путем взбалтывания содержимого.

Допустимо хранить кровь к холодильнике в течение 2-3 суток.

Ход определения. В чашке Петри делают шесть цифровых пометок. Около каждой из них наносят по 0,1 мл (1 большая капля) сыворотки антирезус: три - одной серии, три - другой. К первой капле каждой серии сыворотки добавляют по 0,05 мл (1 капля) взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждой серии - по 0,05 мл (1 капля) взвеси стандартных резус-положительных эритроцитов группы 0(I) или группы, одноименной с исследуемой, и к третьей капле каждой серии - по 0,05 мл (1 капля) взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемые. Перемешивают стеклянной палочкой и чашки Петри на 7-10 минут опускают на поверхность воды в водяной бане при 48 град. С, после чего просматривают над источником света при легком покачивании.

Оценка результатов. Результат может быть положительным или отрицательным. При положительном результате, когда эритроциты - резус-положительны, на почти бесцветном фоне жидкости легко различимы красные зерна или хлопья, образованные склеившимися эритроцитами. При отрицательном результате смесь остается равномерно окрашенной в красный цвет.

Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих сериях стандартной сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность стандартной сыворотки: стандартные резус-положительные эритроциты группы 0(I) или группы, одноименной с исследуемой, должны дать положительный результат, а стандартные резус-отрицательные эритроциты одноименной группы - отрицательный.

Примечание. Если при определении резус-принадлежности наблюдается слабая или сомнительная реакция, то кровь данного лица исследуют повторно этими же и другими сериями сыворотки антирезус, причем желательно включить сыворотку с полными антителами.

 

4.1.6. Определение резус-фактора на плоскости

при комнатной температуре с помощью сывороток,

приготовленных на альбумине или полиглюкине

(экспресс-метод)

 

Принцип. Исследуемая кровь без предварительной обработки смешивается на плоскости со специальной стандартной сывороткой антирезус, приготовленной на альбумине или полиглюкине. Если исследуемая кровь резус-положительна, происходит агглютинация, хорошо видимая невооруженным глазом.

Реагенты.

1. Стандартная сыворотка антирезус, универсальная, АВ(IV), приготовленная на альбумине или полиглюкине, с указанием на этикетке и в сопроводительной инструкции о пригодности ее для данного метода. Хранят в холодильнике, срок годности указан на этикетке.

2. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

3. Контрольная сыворотка группы АВ(IV), не содержащая резус-антител, приготовленная на альбумине или полиглюкине той же серии и в тех же соотношениях, что и стандартная сыворотка антирезус, предназначенная для этого метода. Хранят в холодильнике. Срок годности указан на этикетке.

Специальное оборудование.

Белая пластинка со смачиваемой поверхностью.

Ход определения. Кровь для исследования берут из пальца непосредственно перед определением. Можно использовать также хранившиеся в холодильнике не более двух дней эритроциты, взятые со дна пробирки после центрифугирования или отстаивания от плазмы с консервантом. Эритроциты, оставшиеся на дне пробирки после свертывания крови, использовать не рекомендуется.

На пластинку слева наносят 0,05 мл (1 капля) стандартной сыворотки антирезус и справа - 0,05 мл (1 капля) контрольной сыворотки. Рядом с каждой из этих капель наносят не менее 0,02 мл (1 небольшая капля) свежей цельной крови или осадка эритроцитов. Стеклянной палочкой перемешивают сначала исследуемую кровь с контрольной сывороткой, размазывая ее до получения тонкого слоя, а затем другую каплю исследуемой крови со стандартной сывороткой, также размазывая ее тонким слоем. Пластинку периодически покачивают в течение 3-4 минут, после чего в обе капли добавляют по 0,05 мл (1 капля) физиологического раствора для снятия возможной неспецифической агглютинации и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения 5 минут, после чего учитывают результат.

Оценка результатов. Реакция может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции агглютинация эритроцитов наблюдается только в одной капле - слева, с сывороткой антирезус. При отрицательной реакции агглютинация эритроцитов отсутствует в обеих каплях, и они остаются равномерно окрашенными. Агрегацию эритроцитов в зоне подсыхания, по периферии капли, не учитывают.

Если реакция положительная - исследуемая кровь содержит резус-фактор, и ее относят к резус-положительному типу. Отрицательная реакция служит показателем того, что исследуемая кровь не содержит резус-фактора, т.е. является резус-отрицательной.

В капле контрольной сыворотки агглютинация эритроцитов должна отсутствовать. Если в контрольной капле имеется агглютинация эритроцитов, то заключение о резус-принадлежности исследуемого образца крови не делают и этот образец крови исследуют повторно другими сериями сывороток антирезус или направляют для исследования в серологическую лабораторию службы переливания крови.

Примечание. Метод применяется у постели больного.

 

4.1.7. Исследование сыворотки на наличие полных

резус-антител методом агглютинации в солевой

среде в пробирках

 

Принцип. Исследуемую сыворотку смешивают со стандартными резус-положительными эритроцитами. Реакция протекает в солевой среде. При наличии в исследуемой сыворотке полных резус-антител происходит агглютинация резус-положительных эритроцитов, наличие которой устанавливается по форме осадка эритроцитов.

Реагенты.

1. Стандартные эритроциты группы, совместимой с исследуемой сывороткой, резус-положительные, не менее чем 3 образца, обязательно содержащие в той или иной комбинации 3 антигена - резус: Rho(D), rh'(C) и rh"(E). Если антигены rh'(C) и rh"(E) в эритроцитах не определились, то количество образцов стандартных резус-положительных эритроцитов должно быть увеличено до 20.

2. Стандартные резус-отрицательные эритроциты (2-3 образца) группы, совместимой с исследуемой сывороткой.

3. Эритроциты лица, сыворотка которого исследуется - контроль (не обязательный).

4. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

5. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

Специальное оборудование.

Термостат на 37 град. С.

Пробирки высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 с гладким дном сферической формы.

Лупа с 6-8- кратным увеличением.

Подготовка к определению. Обработка крови для получения стандартных и контрольных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в центрифужные пробирки, емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл 3,8% раствора лимоннокислого натрия. Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, содержимое перемешивают, центрифугируют и жидкость над эритроцитами отбрасывают. Такое отмывание повторяют дважды. Можно также брать кровь без стабилизатора. В этом случае используют эритроциты, которые остаются на дне пробирки после свертывания крови. Если этих эритроцитов недостаточно, пробирку со свернувшейся кровью энергично встряхивают или разбивают сгусток. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как указано выше. Из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь в других пробирках: смешивают 2,45 мл (49 капель) физиологического раствора и 0,05 мл (1 капля) осадка эритроцитов.

Ход определения. Штатив для пробирок покрывают листом бумаги, на котором накалывают отверстия и сквозь них устанавливают ряд пробирок по числу образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка. На бумаге, около каждой пробирки, делают надпись. Во все пробирки вводят по 0,05 мл (1 капля) исследуемой сыворотки и по 0,05 мл (1 капля) физиологического раствора и перемешивают встряхиванием. В соответственно обозначенные пробирки вносят по 0,05 мл (1 капля) 2% взвеси стандартных или контрольных (собственных) эритроцитов, снова перемешивают содержимое пробирок и помещают их на 1 час в термостат при 37 град. С. После инкубации штатив с пробирками вынимают и результат реакции оценивают по наличию или отсутствию агглютинации, которая определяется по форме осадка эритроцитов на дне пробирки.

Оценка результатов. Наличие агглютинации в пробирках с резус-положительными образцами эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и контрольными (собственными) эритроцитами указывает на наличие в сыворотке полных резус-антител. Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на отсутствие полных резус-антител. Наличие агглютинации в пробирках с резус-отрицательными или собственными эритроцитами говорит о наличии антител другой специфичности или о неспецифической реакции. Такой результат не учитывают, ответа о наличии полных резус-антител не дают и сыворотку передают для исследования в специальную лабораторию.

 

4.1.8. Исследование сыворотки на наличие неполных

резус-антител методом конглютинации с применением

желатины

 

Принцип. Исследуемую сыворотку инкубируют со стандартными резус-положительными эритроцитами в коллоидной среде - растворе желатины. При наличии в исследуемой сыворотке неполных резус-антител происходит агглютинация резус-положительных эритроцитов, которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь физиологического раствора.

Реагенты.

1. Стандартные эритроциты группы, совместимой с исследуемой сывороткой, резус-положительные, не менее чем 3 образца, содержащие в той или иной комбинации 3 антигена резус: Rho(D), rh'(C), rh"(E). Если антигены rh'(C) и rh"(E) в эритроцитах не определились, то количество образцов стандартных резус-положительных эритроцитов должно быть увеличено до 20.

2. Стандартные эритроциты, резус-отрицательные, 2-3 образца, группы, совместимой с исследуемой сывороткой.

3. 10% раствор желатины, выпускаемый в ампулах заводом им. Семашко. Вскрытые ампулы хранят в холодильнике не более 2-3 дней. Раствор желатины мутный, с хлопьями или не застывающий при комнатной температуре, употреблять нельзя.

4. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

5. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

6. Эритроциты лица, сыворотка которого исследуется - контроль (не обязательный).

Специальное оборудование.

Водяная баня или термостат на 48 град. С.

Микроскоп.

Лупа с 2-кратным увеличением.

Пробирки, емкостью не менее 10 мл.

Подготовка к определению. Обработка крови для получения стандартных и контрольных эритроцитов. Кровь берут не более чем за 2 дня до исследования в количестве 1-3 мл без стабилизатора. Пробирки нумеруют, на них надписывают фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество эритроцитов, которые применяют для исследования. Эритроциты берут со дна пробирки; если при этом захватывается небольшое количество сыворотки, это не влияет на ход реакции.

Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого натрия. В этом случае эритроциты необходимо отмыть физиологическим раствором.

Ход определения. Пробирки устанавливают в штатив и нумеруют. Количество и нумерация пробирок должны соответствовать количеству образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка. В пробирки согласно нумерации вводят по 0,05 мл (1 капля) стандартных эритроцитов. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл (2 капли) 10% раствора желатины, предварительно подогретого до 48 град. С (до разжижения) и встряхивают их. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл (2 капли) исследуемой сыворотки, пробирки встряхивают для тщательного перемешивания содержимого и помещают в водяную баню при 48 град. С на 15 минут или в термостат при 48 град. С - на 45 минут. После инкубации в пробирки наливают по 5-8 мл физиологического раствора, предварительно подогретого в той же водяной бане. Содержимое пробирок перемешивают путем перевертывания и оценивают полученные результаты визуально или через лупу с 2-кратным увеличением. В неясных случаях жидкость микроскопируют с малым увеличением без покровного стекла.

Оценка результатов. Результаты оценивают по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Агглютинаты видны в виде красных комочков на фоне просветленной жидкости. Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус-положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на наличие в исследуемой сыворотке неполных резус-антител. Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на отсутствие неполных резус-антител.

Агглютинация в пробирках со стандартными резус-отрицательными или собственными эритроцитами говорит о наличии антител другой специфичности или о неспецифической реакции. Такой результат не учитывают, и сыворотку передают для исследования в специальную лабораторию.

 

4.1.9. Исследование сыворотки на наличие

неполных резус-антител непрямой пробой Кумбса

 

Принцип. Неполные резус-антитела, если они есть в исследуемой сыворотке, взаимодействуют со стандартными резус-положительными эритроцитами, не вызывая их агглютинации. Добавление антисыворотки по отношению к человеческому белку вызывает агглютинацию резус-положительных эритроцитов, сенсибилизированных резус-антителами.

Реагенты.

1. Сыворотка для пробы Кумбса.

2. Стандартные эритроциты группы, совместимой с исследуемой сывороткой, резус-положительные, не менее 3 образцов, содержащих в той или иной комбинации 3 антигена резус: Rho(D), rh'(C), rh"(E). Если антигены rh'(C) и rh"(E) не определялись, количество образцов стандартных резус-положительных эритроцитов должно быть увеличено до 20.

3. Стандартные эритроциты резус-отрицательные (2-3 образца) группы, совместимой с исследуемой сывороткой.

4. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

5. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

6. Эритроциты лица, сыворотка которого исследуется - контроль (не обязательный). Если исследуют сыворотку крови больного, эритроциты которого дают положительный результат в прямой пробе Кумбса, то они не могут служить контролем.

Специальное оборудование.

Термостат на 37 град. С.

Пробирки высотой 4-10 см с внутренним диаметром 0,5-0,8 см.

Белая пластинка со смачиваемой поверхностью.

Подготовка к определению. Обработка крови для получения стандартных и контрольных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в центрифужные пробирки, содержащие 0,25 мл 3,8% раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют, на них надписывают фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, содержимое перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки остаются эритроциты, которые применяют для исследования сыворотки.

Ход определения. Штатив накрывают листом бумаги, накалывают на нем отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки, и нумеруют их. Количество и нумерация пробирок должны соответствовать количеству образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка. Номера пробирок должны быть повторены на листе бумаги у каждой пробирки. Так же надписывают фамилию донора и резус-принадлежность стандартных эритроцитов, которые будут внесены в эту пробирку. Во все пробирки вносят по 0,15 мл (3 капли) исследуемой сыворотки. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают 0,01 мл (маленькую каплю) эритроцитов и переносят ее в пробирку с исследуемой сывороткой согласно нумерации пробирок. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и помещают в термостат при 37 град. С на 45 минут. После инкубации пробирки заполняют на 3/4 физиологическим раствором, перемешивают, центрифугируют и надосадочную жидкость отбрасывают. Такое отмывание эритроцитов повторяют 3 раза. Затем пробирки ставят в штатив соответственно их номерам. В каждую пробирку к отмытым эритроцитам добавляют столько физиологического раствора, сколько нужно для получения примерно 5% взвеси эритроцитов (обычно 3-5 капель). 0,05 мл взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку и к каждой из них прибавляют по 0,05 мл (1 каплю) сыворотки для пробы Кумбса. Капли тщательно перемешивают стеклянной палочкой и пластинку слегка покачивают.

Оценка результатов. Результат выявляется в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов. Обычно агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд, но при слабом титре резус-антител может наступить значительно позже; поэтому наблюдение следует продолжать в течение 20 минут. При наличии агглютинации образуются комочки эритроцитов на фоне просветленной жидкости. При отсутствии агглютинации смесь эритроцитов и сыворотки остается равномерно окрашенной в красный цвет.

Наличие агглютинации с резус-положительными эритроцитами и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на наличие в сыворотке неполных резус-антител. Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на отсутствие в сыворотке неполных антител. Агглютинация со стандартными резус-отрицательными или собственными эритроцитами говорит о наличии антител другой специфичности или о неспецифической реакции. Такой результат не учитывают и сыворотку передают на исследование в специальную лабораторию.

 

4.1.10. Определение титра полных резус-антител

методом агглютинации в солевой среде в пробирках

 

Принцип. Стандартные резус-положительные эритроциты агглютинируются в солевой среде исследуемой сывороткой, содержащей резус-антитела, взятой в разных разведениях, в зависимости от активности антител в этой сыворотке.

Реагенты.

1. Смесь стандартных резус-положительных эритроцитов от 4-5 лиц.

2. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

3. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

Специальное оборудование.

Термостат на 37 град. С.

Пробирки высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см, с гладким дном сферической формы.

Лупа с 6-8-кратным увеличением.

Подготовка к определению. Обработка крови для получения стандартных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в центрифужные пробирки, содержащие 0,25 мл 3,8% раствора лимоннокислого натрия. Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, перемешивают центрифугируют и жидкость над эритроцитами отбрасывают. Такое отмывание делают дважды. Можно использовать и те эритроциты, которые обычно остаются на дне пробирки после свертывания крови, взятой без стабилизатора, но с обязательным отмыванием физиологическим раствором, как описано выше. В опыт берут смесь резус-положительных эритроцитов, взятых в равных количествах от 4-5 лиц. Из смеси эритроцитов готовят 2% взвесь в физиологическом растворе. Для этого к 2,45 мл (49 капель) физиологического раствора прибавляют 0,05 мл (1 капля) осадка отмытых эритроцитов.

Ход определения. Штатив накрывают листом белой бумаги, на нем накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки, по 10 штук на каждую исследуемую сыворотку. Во все пробирки вносят по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. В первую пробирку с физиологическим раствором вносят 0,1 мл (2 капли) исследуемой сыворотки, перемешивают и переносят 0,1 мл (2 капли) смеси во вторую пробирку, перемешивают, 0,1 мл (2 капли) новой смеси переносят в третью пробирку и т.д. до последней, десятой, пробирки, из которой 0,1 мл (2 капли) выливают. В результате в пробирках получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024, что обозначают на бумаге около пробирок. В каждую пробирку добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2% взвеси стандартных резус-положительных эритроцитов, перемешивают и помещают в термостат при 37 град. С на 1 час. После инкубации оценивают полученные результаты по форме осадка эритроцитов на дне пробирки.

Оценка результатов. Результат реакции может быть положительным (наличие агглютинации) и отрицательным (отсутствие агглютинации). Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация эритроцитов, принимают за титр выявленных полных резус-антител. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.

 

4.1.11. Определение титра неполных резус-антител

методом конглютинации с применением желатины.

 

Принцип. Стандартные резус-положительные эритроциты агглютинируются в среде с раствором желатины исследуемой сывороткой, содержащей резус-антитела, взятой в разведениях в зависимости от активности антител в этой сыворотке, от 4-5 лиц.

Реагенты.

1. Смесь стандартных резус-положительных эритроцитов, взятых в равных количествах.

2. 10% раствор желатины, выпускаемый в ампулах заводом им. Семашко. Вскрытые ампулы хранить в холодильнике не более 2-3 дней. Раствор желатины мутный, с хлопьями или не застывающий при комнатной температуре употреблять нельзя.

3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

4. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

Специальное оборудование.

Водяная баня или термостат на 48 град. С.

Лупа с 2-кратным увеличением или микроскоп.

Пробирка, объемом не менее 10 мл.

Подготовка к определению. Обработка крови для получения стандартных эритроцитов. Кровь берут не более чем за 2-3 дня до исследования в количестве 1-3 мл без стабилизатора. Пробирку надписывают. Для исследования применяют эритроциты, оставшиеся на дне пробирки после свертывания крови. Эритроциты берут со дна пробирки. Если при этом захватывается небольшое количество сыворотки, это не влияет на ход реакции. Можно брать кровь с 3,8% раствором лимоннокислого натрия. В этом случае эритроциты следует отмывать физиологическим раствором.

Ход определения. В штатив устанавливают пробирки, по 10 штук на каждую исследуемую сыворотку. Во все пробирки вносят пипеткой по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. В первую пробирку с физиологическим раствором вносят 0,1 мл (2 капли) исследуемой сыворотки, перемешивают и переносят 0,1 мл (2 капли) во вторую пробирку. Из второй пробирки после перемешивания переносят 0,1 мл (2 капли) в третью и т.д. до последней, 10-й пробирки, из которой 0,1 мл (2 капли) выливают. В результате в пробирках получают разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024, что обозначают на бумаге около пробирок. Пробирки встряхивают и затем добавляют в них по 2 капли 10% раствора желатины, предварительно подогретого до 48 град. С. (до разжижения). Затем в каждую пробирку добавляют по 1 капле смеси стандартных эритроцитов. Пробирки снова встряхивают и помещают в водяную баню при 48 град. С на 15 минут или в термостат при той же температуре на 30 минут. После инкубации в них доливают по 5-8 мл подогретого физиологического раствора и оценивают результаты, просматривая пробирки на свет невооруженным глазом, через лупу или под микроскопом.

Оценка результатов. Результат реакции может быть положительным (наличие агглютинации) или отрицательным (отсутствие агглютинации). Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация эритроцитов, принимают за титр выявленных неполных резус-антител.

Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.

 

4.1.12. Определение титра неполных резус-антител

непрямой пробой Кумбса

 

Принцип. Стандартные резус-положительные эритроциты агглютинируются при добавлении сыворотки для пробы Кумбса после предварительной сенсибилизации их исследуемой сывороткой, содержащей резус-антитела, взятой в разведении в зависимости от активности неполных антител этой сыворотки.

Реагенты.

1. Сыворотка для пробы Кумбса.

2. Смесь стандартных резус-положительных эритроцитов, взятых в равных количествах, от 4-5 лиц.

3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

4. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

Специальное оборудование.

Термостат на 37 град. С.

Белые пластинки со смачиваемой поверхностью.

Подготовка к определению. Обработка крови для получения стандартных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в центрифужные пробирки, емкостью не менее 10 мл, содержащие по 0,25 мл изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, содержимое перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают. Такое отмывание эритроцитов повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки остаются эритроциты, которые применяют для исследования сыворотки.

Ход определения. Штатив накрывают листом бумаги с наколотыми отверстиями, сквозь которые устанавливают пробирки, по 10 штук в ряд на каждую исследуемую сыворотку. Пробирки нумеруют, эти же номера надписывают на бумаге у каждой пробирки. Во все пробирки вносят по 0,15 мл (3 капли) физиологического раствора. В первую пробирку с физиологическим раствором вносят 0,15 мл (3 капли) исследуемой сыворотки, перемешивают и 0,15 мл (3 капли) переносят во вторую пробирку, перемешивают. Из второй пробирки 0,15 мл (3 капли) смеси переносят в третью и т.д. до последней, 10-й пробирки, из которой 0,15 мл (3 капли) выливают. В результате в пробирках получаются разведения исследуемой сыворотки от 1:2 до 1:1024. Во все пробирки добавляют по 0,01 мл (1 маленькая капля) смеси стандартных эритроцитов, содержимое пробирок перемешивают и помещают в термостат при 37 град. С на 45 минут. После инкубации пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают. Такое отмывание эритроцитов делают 3 раза. К отмытым эритроцитам добавляют столько физиологического раствора, сколько нужно для получения 5% взвеси эритроцитов (приблизительно 3-5 капель). Из каждой пробирки на пластинку переносят по 0,05 мл (1 капля) 5% взвеси эритроцитов и к каждой капле взвеси эритроцитов прибавляют по 0,05 мл (1 капля) сыворотки для пробы Кумбса, которую перемешивают с эритроцитами. Через 5 минут при периодическом покачивании пластинки оценивают результат.

Оценка результатов. Результат может быть положительным (наличие агглютинации) или отрицательным (отсутствие агглютинации). Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация эритроцитов, принимают за титр выявленных неполных резус-антител.

Если агглютинация наблюдается во всех разведениях сыворотки, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.

 

4.1.13. Прямая проба Кумбса

 

Принцип. При наличии на исследуемых эритроцитах фиксированных in vivo антител происходит их агглютинация сывороткой для пробы Кумбса, содержащей антитела к человеческому белку.

Реагенты.

1. Сыворотка для пробы Кумбса. Хранят в холодильнике в замороженном состоянии. Срок годности указан на этикетке.

2. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

3. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.

Специальное оборудование.

Термостат на 37 град. С.

Белая пластинка со смачиваемой поверхностью.

Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови. 0,25-0,5 мл (5-10 капель) крови помещают в центрифужную пробирку, на 3/4 заполняют ее физиологическим раствором, перемешивают и ценрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают, а пробирку вновь наполняют физиологическим раствором, перемешивают и снова центрифугируют. Процедуру повторяют. Допускается хранение крови до отмывания в холодильнике, но не более 2-х дней. В этом случае кровь берут с 3,8% раствором лимоннокислого натрия (0,25 мл на 0,5 мл крови). После отмывания эритроцитов из них готовят в этой же пробирке 5% взвесь в физиологическом растворе: смешивают одну часть эритроцитов с 19-ю частями физиологического раствора.

Ход определения. 0,05 мл (1 капля) 5% взвеси исследуемых эритроцитов переносят на пластинку и покачивают в течение 3-х минут. Наступление агглютинации во взвеси эритроцитов до добавления сыворотки для пробы Кумбса свидетельствует об ауто- или панагглютинации исследуемой крови. В этом случае следует повторить все этапы постановки пробы, начиная с отмывания эритроцитов, но при температуре 37 град. С. Если агглютинация не наступила, к взвеси исследуемых эритроцитов добавляют 0,05 мл (1 капля) сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сухой стеклянной палочкой. Наблюдение за ними ведут в течение 10 минут при периодическом покачивании пластинки.

Оценка результатов. Появление агглютинации в смеси исследуемых эритроцитов и сыворотки для пробы Кумбса расценивают как положительный результат, отсутствие агглютинации - как отрицательный результат прямой пробы Кумбса.

 

4.1.14. Определение титра антител прямой пробой Кумбса

 

Принцип. Исследуемые эритроциты, сенсибилизированные in vivo антителами, обрабатывают сывороткой для пробы Кумбса, взятой в разных разведениях. Степень разведения сыворотки для пробы Кумбса, в котором наблюдается агглютинация, косвенно указывает на степень сенсибилизации эритроцитов.

Реагенты.

Те же, что для прямой пробы Кумбса.

Специальное оборудование.

То же, что для прямой пробы Кумбса.

Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови. Та же, что и для прямой пробы Кумбса.

Ход определения. На пластинке готовят двукратные разведения сыворотки для пробы Кумбса в физиологическом растворе от 1:2 до 1:1024, всего 10 разведений. На пластинке надписывают степень разведения сывороток, "1:1", "1:4" и т.д. до "1:1024". Затем возле каждого обозначения наносят по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. В физиологический раствор, возле надписи "1:2" вносят 0,1 мл (2 капли) сыворотки для пробы Кумбса, перемешивают той же пипеткой и переносят 0,1 мл (2 капли) смеси в физиологический раствор возле надписи "1:4", перемешивают и 0,1 мл (2 капли) новой смеси переносят в физиологический раствор возле надписи "1:8" и т.д. Из последней полученной смеси, возле обозначения "1:1024" 0,1 мл (2 капли) удаляют. К каждому разведению сыворотки на пластинке добавляют по 0,05 мл (1 капля) 5% взвеси исследуемых эритроцитов, тщательно перемешивают стеклянной палочкой эритроциты с разведенной сывороткой, начиная с последнего ее разведения ("1:1024") и наблюдают 10 минут, периодически слегка покачивая пластинку.

Оценка результатов. Последнее разведение сыворотки, в котором за это время появилась агглютинация эритроцитов, принимают за титр прямой пробы Кумбса. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки. Титр прямой пробы Кумбса зависит от активности примененного образца сыворотки для пробы Кумбса, поэтому сравнительное титрование следует производить одной и той же серией этой сыворотки.

 

Литература.

1. Материалы по вопросам службы крови. М., 1970.

2. Сборник инструкций по изосерологии. (Утв. МЗ СССР). Сост. М.А.Умнова. М., 1965.

 

4.2. ИММУНОДИАГНОСТИКА ПЕРВИЧНЫХ ГЕПАТОМ И ТЕРАТОБЛАСТОМ

 

4.2.1. Определение альфа-фетопротеина человека

реакцией микропреципитации в агаре

 

Принцип. Моноспецифическая антисыворотка против альфа-фетопротеина человека, реагируя в агаре со стандартными альфа-фетопротеином и с альфа-фетопротеином, содержащимся в сыворотке крови больного, образует с каждым из них полосы преципитации. Полосы преципитации, образованные антигенами и антисывороткой к ним, сливаются, что указывает на серологическое тождество сравниваемых антигенов.

Реагенты.

1. Агар фирмы "Дифко" или сухой агар-агар.

2. 0,85% раствор хлористого натрия.

3. Иммунодиагностикум для первичного рака печени (ПРП) и тератобластом (ТБ). Иммунодиагностикум выпускается Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.

Иммунодиагностикум представляет собой лиофильно высушенный препарат, состоящий из моноспецифической кроличьей антисыворотки против альфа-фетопротеина человека (АТ) и альфа-фетопротеина человека (АГ). 1 мл рабочего разведения АТ и 2 мл АГ составляют рабочую дозу иммунодиагностикума, которая достаточна для проведения 40-50 исследований.

Специальное оборудование.

Штампы или отдельные пробойники для просечения контуров лунок. Штамп и специальные стекла для постановки опыта входят в комплект иммунодиагностикума.

Подставка для стекол, сделанная из плексигласа.

Горизонтальный столик, на котором производится заливка агара.

Уровень.

Вакуум-насос или централизованный вакуум.

Металлическая трубочка, диаметром 0,8-1,5 мм, для отсоса агаровых пробок.

Пластинки стеклянные для постановки опыта.

Эксикатор.

Трубки стеклянные с равномерно оттянутыми капиллярными концами.

Колба с носиком для подключения к вакууму.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Обработка исследуемой сыворотки. Кровь у больного берут из локтевой вены или из пальца в количестве 1,0-3,0 мл, ставят на 1 час в термостат или на 2 час при комнатной температуре. Затем сыворотку отделяют от сгустка, ценрифугируют 20 минут при 2.000 об/мин и отсасывают.

2. Приготовление 1% агара. Отвешивают определенное количество агара "Дифко" и добавляют требуемый объем 0,85% раствора хлористого натрия.

Если агара фирмы "Дифко" в лаборатории нет, то пользуются сухим агар-агаром, из которого готовят 2% преципитированный агар. Для этого 20 г сухого агар-агара заливают 1 л дистиллированной воды, расплавляют на огне и добавляют 50 мл 10% раствора хлористого кальция. Выпавший осадок отбрасывают. Затем производят очистку полученного агара. Для этого преципитированный агар сначала разогревают и разливают в ванночки слоем толщиной 0,5-1,0 см. Застывший агар затем разрезают на квадраты с длиной сторон 0,5-1,0 см и промывают проточной водопроводной водой, которую заменяют 3-4 раза. Агар отжимают от воды в марле, переносят в колбу, разогревают на кипящей водяной бане и фильтруют 2-3 раза через бумажный фильтр. К готовому агару добавляют равный объем 1,8% раствора хлористого натрия и раствор мертиолата (1:10000) и затем разливают его в стерильные колбы по 50-100 мл. Перед применением агар разогревают на кипящей водяной бане, охлаждают до температуры 60-70 град. С и заливают на стекло. Приготовленный подобным образом агар имеет необходимую концентрацию (1%), достаточную прозрачность, не прорастает в течение опыта и по своим рабочим свойствам не уступает агару фирмы "Дифко".

3. Подготовка стекол и заливка агара. Реакцию преципитации в агаре можно ставить не только на стеклах, входящих в комплект иммунодиагностикума, но и на самодельных стеклах, которые готовят следующим образом. Отмытые от эмульсии стекла фотопластинок (9Х12) делят на 2-3 равные части стеклянными пластинками, шириной 4-5 мм и толщиной 2 мм. Такие же пластинки применяют в качестве боковых бортиков. Разделительные и боковые пластинки приклеивают к стеклу универсальным клеем (N 88). Такие стекла удобно использовать для одновременного исследования большого числа сывороток больных.

Отмытые и обезжиренные стекла проводят несколько раз над пламенем газовой горелки. Затем стекла помещают на строго горизонтальную поверхность (устанавливают по уровню) и в каждый отсек заливают по 5-6 мл агара. Заливка агара на горизонтальной поверхности дает возможность всегда получать стандартную толщину слоя агара, а наличие пластинок и боковых бортиков предохраняет от подсыхания агара с краев. Сразу же после застывания агара (5-7 минут) стекла помещают во влажную камеру на подставку на 30-40 минут. В качестве влажной камеры можно использовать эксикатор, на дно которого наливают дистиллированную воду с добавлением антисептика (тимол или мертиолат). Заметного подсыхания агара в такой камере не отмечается в течение нескольких суток. При использовании стандартного стекла из комплекта иммунодиагностикума необходимость в эксикаторе отпадает.

4. Приготовление лунок. К приготовлению лунок приступают через 30-40 минут после застывания агара во влажной камере. Для просечения контуров лунок в агаре применяются стандартные штампы. Контуры лунок просекают штампом вручную. Агар из просеченных лунок отсасывают с помощью металлической трубки, в качестве которой могут быть использованы обычные инъекционные иглы с наружным диаметром от 0,8 до 1,5 мм и срезанным острым концом.

В случаях, когда нет штампов, можно пользоваться отельными трубками-пробойниками, изготовленными из латуни и нержавеющей стали, с диаметром 4 мм. Конец трубки затачивают сверлом или шабером со стороны внутреннего диаметра трубки. Наружная поверхность трубки должна быть тщательно отшлифована. При этом необходимо заранее приготовить трафареты штампов. Такие трафареты, нарисованные на бумаге, подкладывают под стекло с агаром, и по ним пробойником просекают контуры лунок, из которых потом отсасывают агаровые пробки. Агаровые пробки отсасывают с помощью вакуумного или водоструйного насоса. После приготовления лунок стекла сразу же помещают в эксикатор.

Основной опыт. В стеклянные трубки с оттянутыми концами набирают необходимые для опыта реагенты:

1. Исследуемые сыворотки больных.

2. АТ - кроличья моноспецифическая антисыворотка против альфа-фетопротеина человека.

3. АГ - альфа-фетопротеин.

4. 0,85% раствор хлористого натрия.

Трубочки укладывают в определенном порядке на специальной подставке или на горизонтальной бумаге. Затем из эксикатора вынимают подготовленное стекло с агаром и вносят в лунки капиллярами соответствующие реагенты. При заполнении лунок следует возможно быстрее наливать реагенты в лунки вровень с поверхностью агара. В центральную лунку заливают АТ, в две периферические, противоположные друг другу - стандартный АГ, а в оставшиеся 4 лунки - исследуемые сыворотки и 0,85% раствор хлористого натрия для контроля.

Для уменьшения подсыхания агара делают по краям его дополнительные лунки, которые заполняют 0,85% раствором хлористого натрия.

Сразу же после заполнения лунок реагентами стекло помещают в эксикатор при комнатной температуре.

Оценка результатов. Результаты реакции регистрируются через 24-28 часов. Их оценивают по плюсовой шкале. Реакцию считают положительной, если линия преципитации иммунодиагностикума сливается с линией преципитации, образованной антигеном исследуемой сыворотки и антителами иммунодиагностикума.

В зависимости от места слияния полос реакцию считают:

+ слабо положительной: слияние у лунки с исследуемой сывороткой (концентрация АФП в сыворотки больного - меньше 50 мкг на мл).

++ положительной: линии преципитации иммунодиагностикума и исследуемой сыворотки находятся на одинаковом расстоянии от центральной лунки (концентрация АФП в сыворотке больного - 50 мкг на мл).

+++ резко положительной: линия преципитации исследуемой сыворотки диффузна и сдвинута в сторону центральной лунки, а линия преципитации иммунодиагностикума резко обрывается (концентрация АФП в сыворотке больного больше 50 мкг на мл). В этом случае необходимо поставить повторно опыт с двукратными разведениями исследуемой сыворотки и установить, во сколько раз в ней больше альфа-фетопротеина по сравнению со стандартным препаратом.

Реакцию считают отрицательной, если линия преципитации иммунодиагностикума достигает своими концами лунок с исследуемыми сыворотками и 0,85% раствором хлористого натрия.

Диагностическими считают все три описанные типа положительных реакций.

Источники ошибок.

1. Наличие ореола вокруг лунок с исследуемыми сыворотками может маскировать линии преципитации сывороток со слабо положительной реакций. Для уменьшения и снятия ореола вокруг лунок рекомендуется поместить стекло в ванночку с 10-15% раствором хлористого натрия на 1 час.

2. Изменение концентрации 1% агара при многократном его нагревании. Поэтому желательно готовить агар только для одного, в крайнем случае, для нескольких опытов.

3. Подсыхание агара может привести к появлению артефактов, к размыванию линии преципитации или к ее раздвоению. Для уменьшения подсыхания агара по краям агаровой пластинки делают дополнительно лунки, которые заполняют 0,85% раствором хлористого натрия. Постановка опыта должна занимать не более 10-15-ти минут.

4. Отслойка агара и порча лунок при извлечении агаровых пробок приводит к искажению формы линии преципитации.

Примечания.

1. АФП обнаруживается в крови больных первичным раком печени, гепатоцеллюлярной и смешанной формы, в 65-75% случаев, а также в 50% случаев при тератобластомах с элементами эмбрионального рака или с элементами хориоэпителиомы и семиломы.

2. Холангиомы, опухоли непеченочного происхождения, нераковые заболевания печени не сопровождаются появлением АФП в крови.

 

Литература.

1. Абелев Г.И. - Вестник АМН СССР, 1970, 7, 49.

2. Абелев Г.И., Перова С.Д., Храмкова Н.И. и др. - Биохимия, 1963, т. 28, 4, 625.

3. Татаринов Ю.С. - Вопр. мед. химии, 1964, 1, 90.

4. О"Конор Г.Т., Татаринов Ю.С., Абелев Г.И. и Урчель Ж. - Вестник АМН СССР, 1971, 3, 3.

5. Гусев А.И. - В кн. Иммунохимический анализ, 1968.

 

4.3. СЕРОДИАГНОСТИКА СИФИЛИСА

 

Для определения сложных иммунных изменений в организме больного сифилисом с целью подтверждения диагностики, контроля за успешностью терапии и определения излеченности в настоящее время рекомендуются обязательные для применения серологические реакции и группа специфических серологических реакций на сифилис.

ГРУППА ОБЯЗАТЕЛЬНЫХ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ РЕАКЦИЙ:

1. Реакция Вассермана, основанная на феномене связывания комплемента комплексом липоидный антиген + реагин испытуемой сыворотки. Индикация образовавшегося комплекса достигается добавлением гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка).

2. Модификации реакции Вассермана:

а) количественная методика Боаса с уменьшающимися дозами испытуемой сыворотки для определения титра реагинов в случае получения положительных результатов в реакции Вассермана;

б) реакция Григорьева и Раппопорта, основанная на применении в реакции связывания комплемента естественного комплемента сыворотки;

в) реакция Вайнштейна и Резниковой, основанная на использовании естественного комплемента и гемолизина испытуемой сыворотки.

Реакции Григорьева-Раппопорта и Вайнштейна-Резниковой рекомендуются для недостаточно оснащенных лабораторий, где невозможно из-за отсутствия того или иного прибора поставить классическую реакцию Вассермана.

3. Реакция Колмера, основанная на феномене двухфазного связывания комплемента: первая фаза - при температуре 18-20 град. С. в течение 30 минут; вторая фаза - в холодильнике при температуре 4-6 град. С. в течение 18-20 часов.

Реакция Колмера обладает более выраженной чувствительностью и рекомендуется в диагностических целях при первичном сифилисе и скрыто протекающей сифилитической инфекции.

4. Осадочные реакции, основанные на образовании комплекса липоидный антиген + реагины испытуемой сыворотки, проявляющегося макрофлокулятом, видимым простым глазом:

а) реакция Кана, основанная на применении антигена Кана;

б) реакция Закс-Витебского (цитохоль), основанная на применении антигена, приготовленного по методике Закс-Витебского.

Для постановки стандартных серологических реакций применяются неспецифические антигены, исходным материалом для приготовления которых служат органы здоровых животных. Действующим началом этих антигенов являются фосфатиды, активизированные добавлением холестерина.

Для диагностики, наблюдения за успешностью противосифилитической терапии и для определения извлеченности рекомендуется комплекс стандартных серологических реакций на сифилис, состоящий из реакций Вассермана с обязательным применением: 1) кардиолипинового антигена, как самого чувствительного, 2) трепонемального озвученного или протеиновой фракции из трепонем, 3) обычного неспецифического и двух осадочных реакций - реакции Кана и реакции Закс-Витебского (цитохоль). В отдельных случаях допустима замена реакции Вассермана одной из активных модификаций.

 

ГРУППА СПЕЦИФИЧЕСКИХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ:

 

Рекомендуется для исследования сывороток: а) для дифференцирования биологически ложноположительных реакций от скрыто протекающего сифилиса у лиц с положительными результатами стандартных серологических реакций и с отсутствием видимых клинических проявлений сифилиса; б) для подтверждения диагноза у лиц с клиническими симптомами сифилиса и с отрицательными результатами стандартных серологических реакций. Для этих целей рекомендуются следующие специфические серологические реакции.

1. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), основанная на феномене потери подвижности бледных трепонем в присутствии иммобилизинов и активного комплемента.

2. Модификация реакции иммобилизации бледных трепонем.

Меланжерная методика РИТ Н.М.Овчинникова, основанная на феномене потери подвижности бледных трепонем в присутствии иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента. Анаэробные условия опыта создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты резиновым кольцом.

3. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), основанная на феномене свечения комплекса бледная трепонема + антитело, участвующее в реакции иммунофлуоресценции, + видовая антисыворотка, меченая флуорохромом при исследовании препаратов в люминесцентном микроскопе.

Модификации реакции иммунофлуоресценции:

а) непрямая методика реакции иммунофлуоресценции с разведением испытуемой сыворотки в 200 раз - РИФ200;

б) реакция иммунофлуоресценции с адсорбцией сыворотки специальными сорбентами для удаления субстанций, обусловливающих возможность неспецифического свечения, - РИФадс.

4. Реакция связывания комплемента с трепонемными антигенами, полученными из культуральных или патогенных бледных трепонем.

Модификации реакции связывания комплемента:

а) реакция связывания комплемента с малыми объемами ингредиентов;

б) реакция Колмера в 1/5 объема.

Пользование несколькими серологическими реакциями на сифилис (специфическими и стандартными) обеспечивает более полное определение различных антител, которые могут иметь место в испытуемой сыворотке, и тем самым - более точную серодиагностику сифилиса.

 

4.3.1. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного

антигена и реагина или трепонемального антигена

и антитрепонемных антител исследуемой сыворотки

(реакция Вассермана, качественный метод)

 

Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с неспецифическими и кардиолипиновыми антигенами. Специфические антитрепонемные антитела вступают в соединение со специфическими антигенами (озвученными или протеиновой фракцией трепонем). Образовавшиеся комплексы сорбируют вводимый в реакцию комплемент. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка).

Реагенты.

1. 0,85% раствор хлористого натрия х.ч. (физиологический раствор).

2. Антигены: неспецифический, кардиолипиновый, сохраняются в темном шкафу при комнатной температуре.

3. Антигены специфические - протеиновая фракция культуральных трепонем или ультраозвученный трепонемный антиген, сохраняются в холодильнике при температуре +2-4 град. С.

4. Комплемент. Применяется смесь сывороток крови, полученной пункцией сердца у 5-10 здоровых морских свинок. При консервировании 4% борной кислотой и 5% сернокислым натрием сохраняется в холодильнике 1-2 месяца. Может быть использован лиофильно высушенный комплемент.

5. Гемолизин. Кроличья гемолитическая сыворотка с разными титрами, сохраняется в холодильнике.

6. Эритроциты барана. Кровь получают у барана путем пункции яремной вены. Кровь собирают в стерильную банку со стеклянными бусами, которую встряхивают 10-15 минут. Фильтрованием через марлю отделяют образовавшиеся сгустки фибрина. Дефибринированная кровь барана хранится в холодильнике в течение 3-5 дней. При необходимости более длительного хранения кровь консервируют. Приготовление консерванта: на 100 мл физиологического раствора, 6 г глюкозы и 4,5 г борной кислоты, смесь кипятят на водяной бане три дня по 20 минут. К 100 мл дефибринированной бараньей крови добавляют 15 мл консерванта. Дефибринированная консервированная и неконсервированная кровь хранится в холодильнике.

Специальное оборудование.

Термостат с температурой +37 град. С.

Холодильник с температурой +4-6 град. С.

Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.

Центрифуга.

Пробирки размером 15х150 мм.

Пробирки размером 15х100 мм.

Пипетки градуированные 1, 2, 5, 10 мл с делениями 0,01 мл.

Цилиндры градуированные 100 и 500 мл с делениями на 5 мл.

Банки стеклянные 50, 100 и 500 мл.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:

1. Обработка испытуемой сыворотки. Для исследования требуется 4-8 мл крови, которую получают пункцией локтевой вены. Пункция производится стерильной иглой или иглой, надетой на стерильный шприц, предварительно промытый физиологическим раствором. У маленьких детей кровь можно брать из темпоральной вены или из надреза на пятке. Взятие крови производится натощак (через 5-6 часов после приема пищи). За 3-4 дня необходимо отменить прием наркотических средств, препаратов наперстянки и др. Не рекомендуется брать кровь для исследования у лихорадящих больных, после приема алкоголя, после общего наркоза, после травм и хирургических вмешательств. Собранную в стерильную пробирку кровь помещают на 1 час в термостат. Образовавшийся сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки, и кровь оставляют в холодильнике на 20-24 часа. За это время над сгустком образуется прозрачная сыворотка, которую осторожно сливают или отсасывают при помощи резинового баллона и пастеровской пипетки в другую пробирку и инактивируют в водяной бане. Такие сыворотки могут сохраняться в холодильнике в течение 5-6 дней. При необходимости длительного хранения сывороток (3-4 недели) их консервируют добавлением сухой борной кислоты (из расчета получения 2% концентрации). В день исследования сыворотки подвергают повторному нагреванию в водяной бане в течение 15 минут. Допускается исследование сыворотки крови, высушенной следующим образом: на 1 мл сыворотки добавляют 3-4 капли 40% раствора пищевого сахара, перемешивают и отдельными каплями по 0,5 мл высушивают на вощеной бумаге. Для исследования сухую сыворотку необходимо растворить в физиологическом растворе в объеме, равном объему высушенной сыворотки. Перед исследованием проводят инактивирование в водяной бане в течение 30 минут.

Желтушные, хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки для исследования непригодны.

2. Приготовление раствора антигенов. Антигены разводят соответственно способу и титру, указанному на этикетке. Титр - это количество антигена на 1 мл физиологического раствора.

3. Приготовление гемолитической системы. Дефибринированную баранью кровь или эритроциты барана в объеме, необходимом для работы в данный день, центрифугируют, плазму осторожно отсасывают и осадок трижды отмывают 5-6 объемами физиологического раствора. При последнем промывании надосадочная жидкость должна быть бесцветной. Из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе. Равный объем гемолитической сыворотки, разведенной в физиологическом растворе по утроенному титру (например, на этикетке указан титр 1:1500; для разведения титр будет 1:500, т.е. 0,1 на 50 мл физиологического раствора), объединяют с 3% взвесью эритроцитов барана. Раствор гемолитической сыворотки приливают к взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание. Полученную гемолитическую систему выдерживают в термостате 30 минут.

4. Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят 1:10 в физиологическом растворе. При работе с сухим комплементом предварительно необходимо растворить содержимое ампулы в физиологическом растворе в объеме, равном объему высушенного комплемента.

Нормальную инактивированную сыворотку человека, отрицательную в реакции Вассермана и в осадочных реакциях, разводят физиологическим раствором 1:5.

Титрование комплемента производят в 40 пробирках, поставленных по 10 штук в четыре ряда: три ряда для титрования комплемента в присутствии трех антигенов и четвертый ряд для титрования комплемента в присутствии физиологического раствора. Шесть контрольных пробирок: три для контроля трех антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и физиологического раствора на гемотоксичность - заполняют до объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси бараньих эритроцитов следующим образом (см. табл. 1).

 

Таблица 1

 

ЗАПОЛНЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ ПРОБИРОК

 

┌───────────────────────────────┬────────────────────────────────┐

│                               │           Пробирки             │

│        Реактивы               ├─────┬─────┬────┬────┬─────┬────┤

│                               │  I  │ II  │III │ IV │  V  │ VI │

├───────────────────────────────┼─────┼─────┼────┼────┼─────┼────┤

│2,5% взвесь эритроцитов барана │ 0,25│ 0,25│0,25│0,25│0,25 │0,25│

│Раствор гемолитической         │  -  │ 0,25│ -  │ -  │  -  │ -  │

│сыворотки по тройному титру    │     │     │    │    │     │    │

│Раствор комплемента 1:10       │ 0,25│  -  │ -  │ -  │  -  │ -  │

│Раствор антигена I по титру    │  -  │  -  │ -  │0,5 │  -  │ -  │

│Раствор антигена II по титру   │  -  │  -  │ -  │ -  │ 0,5 │ -  │

│Раствор антигена III по титру  │  -  │  -  │ -  │ -  │  -  │0,5 │

│Физиологический раствор        │ 0,75│ 0,75│1,0 │0,5 │ 0,5 │0,5 │

└───────────────────────────────┴─────┴─────┴────┴────┴─────┴────┘

 

После 45 минут пребывания в термостате во всех пробирках должен отсутствовать гемолиз.

Комплемент, разведенный 1:10, разливают в 10 пробирок четвертого ряда в дозах, 0,1; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5; 0,56; 0,6. Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл соответствующими объемами физиологического раствора: 0,9; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,44; 0,4. Полученную в каждой пробирке смесь переносят по 0,25 в соответствующие пробирки трех рядов. Нормальную человеческую сыворотку, разведенную физиологическим раствором 1:5, разливают во все 40 пробирок по 0,25 мл. Антиген I, разведенный по титру физиологическим раствором, приливают по 0,25 мл в 10 пробирок первого ряда; антиген II, разведенный по титру физиологическим раствором, приливают по 0,25 мл в 10 пробирок второго ряда; антиген III, разведенный по титру физиологическим раствором, приливают по 0,25 мл в 10 пробирок третьего ряда; физиологический раствор приливают по 0,25 мл в 10 пробирок четвертого ряда. После 45-минутной инкубации в термостате во все 40 пробирок приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Повторная инкубация в термостате продолжается 45 минут (см. табл. 2)

Титром комплемента считается его наименьшее количество, обеспечивающее полный гемолиз бараньих эритроцитов в присутствии антигена и нормальной человеческой сыворотки. Для основного опыта необходима рабочая доза комплемента, т.е, надбавка к титру в пределах 20-30% в зависимости от степени гемолиза в последних пробирках с меньшим количеством комплемента. Например, полный гемолиз получен в четвертой пробирке - рабочая доза комплемента будет равна 3,6%. Готовят необходимый для данного рабочего дня объем комплемента, разведенного по рабочей дозе, исходя из расчета 1 мл комплемента на каждую испытуемую сыворотку. Например, на 200 испытуемых сывороток необходимо 200 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Следовательно, к 192,8 мл физиологического раствора нужно прибавить 7,2 мл комплемента морских свинок.

5. Основной опыт. Каждую испытуемую инактивированную сыворотку, разведенную 1:5 физиологическим раствором, исследуют в 4-х пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,25 мл. В первую пробирку приливают 0,25 мл антигена I, разведенного по титру; во вторую - 0,25 мл антигена II, разведенного по титру; в третью - 0,25 мл антигена III, разведенного по титру; в четвертую (контрольную) - 0,25 мл физиологического раствора. Комплемент, разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрольные пробирки. После первичной 45-минутной инкубации в термостате добавляют во все опытные и контрольные пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат на 45-60 минут (см. табл. 3). После наступления гемолиза в контрольных пробирках регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках.

Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырех плюсов: полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабо положительная реакция); незначительная задержка гемолиза - + или +/- (сомнительная реакция).

Источники ошибок.

1. Неправильно выбранная доза комплемента (избыток или недостаток в опыте).

2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.

3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.

 

Таблица 2

 

Схема титрования комплемента

 

┌───────────────────┬────────────────────────────────────────────┐

│                   │               NN пробирок                  │

│      Реактивы     ├───┬───┬────┬───┬────┬───┬────┬───┬────┬────┤

│                   │ 1 │ 2 │ 3  │ 4 │ 5  │ 6 │ 7  │ 8 │ 9  │10  │

├───────────────────┼───┼───┼────┼───┼────┼───┼────┼───┼────┼────┤

│  Комплемент (1:10)│0,1│0,2│0,24│0,3│0,36│0,4│0,44│0,5│0,56│0,6 │

│  физиологический  │0,9│0,8│0,76│0,6│0,64│0,6│0,56│0,5│0,44│0,4 │

│  раствор          │   │   │    │   │    │   │    │   │    │    │

├───────────────────┴───┴───┴────┴───┴────┴───┴────┴───┴────┴────┤

│   После тщательного перемешивания из каждой пробирки  переносят│

│по  0,25  мл  в  соответствующие  пробирки  третьего,  второго и│

│первого ряда. К оставшимся объемам разведенного комплемента 4-го│

│ряда   добавляется  физиологический  раствор  (вместо  антигена)│

│по 0,25 мл во все 10 пробирок.                                  │

│                                                                │

│                          Третий ряд,                           │

│   Антиген III  по 0,25 мл во все 10 пробирок.                  │

│                                                                │

│                           Второй ряд                           │

│   Антиген II    по 0,25 мл во все 10 пробирок.                 │

│                                                                │

│                           Первый ряд                           │

│   Антиген I     по 0,25 мл во все 10 пробирок.                 │

│                                                                │

│   Нормальная человеческая                                      │

│   сыворотка (1:5)          по 0,25 мл во все 40 пробирок       │

│                            Инкубация в термостате 45 минут     │

│                                                                │

│   Гемолитическая система   по 0,5 мл во все 40 пробирок        │

│                            Инкубация в термостате 45 минут     │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

Таблица 3

 

СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

 

┌───────────────────────────┬────────────────────────────────────┐

│      Ингредиенты (в мл)   │         NN пробирок                │

│   (общий объем - 1,25 мл) ├────────┬─────┬────────┬────────────┤

│                           │   1    │  2  │   3    │4 (контроль)│

├───────────────────────────┼────────┼─────┼────────┼────────────┤

│   Испытуемая сыворотка,   │  0,25  │0,25 │ 0,25   │   0,25     │

│   инактивированная,       │        │     │        │            │

│   разведенная 1:5         │        │     │        │            │

│   Антиген I, разведенный  │  0,25  │ -   │  -     │    -       │

│   по титру                │        │     │        │            │

│   Антиген II, разведенный │  -     │0,25 │  -     │    -       │

│   по титру                │        │     │        │            │

│   Антиген III, разведенный│  -     │ -   │ 0,25   │    -       │

│   по титру                │        │     │        │            │

│   Физиологический раствор │  -     │ -   │  -     │   0,25     │

│   Комплемент, разведенный │  0,25  │0,25 │ 0,25   │   0,25     │

│   по рабочей дозе         │        │     │        │            │

├───────────────────────────┴────────┴─────┴────────┴────────────┤

│              Встряхнуть, в термостат на 45 минут               │

├───────────────────────────┬────────┬─────┬────────┬────────────┤

│   Гемолитическая          │   0,5  │0,5  │ 0,5    │   0,5      │

│   система                 │        │     │        │            │

├───────────────────────────┴────────┴─────┴────────┴────────────┤

│             Встряхнуть, в термостат на 45-60 минут             │

│       (до наступления гемолиза в контрольных пробирках)        │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

4.3.2. Реакция связывания комплемента комплексом

липоидного антигена и реагина или трепонемального

антигена и антитрепонемальных антител исследуемой сыворотки

(Количественный метод реакции Вассермана)

 

Принцип. Определение титра реагинов в положительных сыворотках путем исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся объемов сыворотки, разведенной физиологическим раствором.

Реагенты.

физиологический раствор, антигены, комплемент, гемолизин, эритроциты барана приготовляют и хранят так же, как при постановке качественной методики реакции Вассермана.

Специальное оборудование.

Центрифуга.

Термостат с температурой +37 град. С.

Холодильник с температурой +4-6 град. С.

Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:

1. Подготовка испытуемой сыворотки. Сыворотку, обнаружившую резко положительные результаты при исследовании в реакции Вассермана, повторно инактивируют 15 минут при температуре 56 град. С в водяной бане. Если исследуется новая порция той же сыворотки, инактивирование удлиняется до 30 минут.

2. Разведение антигена, приготовление гемолитической системы проводится так же, как при постановке качественной методики реакции Вассермана.

3. Титрование комплемента. Титрование комплемента, контроль ингредиентов на гемотоксичность и выбор рабочей дозы комплемента производят так же, как и при постановке качественной реакции Вассермана.

Основной опыт. Каждая сыворотка исследуется в восьми пробирках. В первую пробирку наливается 0,8 мл физиологического раствора, со второй по седьмую пробирку - по 0,25 мл физиологического раствора. В первую пробирку вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки, содержимое перемешивают, затем 0,25 мл удаляют, а 0,25 мл переносят во вторую и восьмую пробирки. После перемешивания переносят 0,25 мл из второй пробирки в третью, из третьей - в четвертую и так далее до седьмой пробирки, из которой 0,25 мл разведенной сыворотки удаляют. В восьмую пробирку (контрольную) приливают 0,25 мл физиологического раствора, а во все остальные пробирки по 0,25 мл антигена, разведенного по титру. После легкого встряхивания во все пробирки приливают по 0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в термостате продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их помещают в термостат на 45 минут и после наступления полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результаты реакции (см. табл. 4).

Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки является наибольшее разведение, давшее полную задержку гемолиза - 4+ или значительную задержку гемолиза - 3+.

Источники ошибок.

1. Неправильный выбор рабочей дозы комплемента (избыток или недостаток в опыте).

2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.

3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.

 

Таблица 4

 

Схема основного опыта количественной реакции Вассермана

 

┌────────────────┬────────────────────────────────────────────────┐

│  Ингредиенты   │               NN пробирок                      │

│    (в мл)      ├─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬──────┤

│                │  1  │  2  │  3  │  4  │  5  │  6  │  7  │  8   │

│                │     │     │     │     │     │     │     │контр.│

├────────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┤

│Физиологический │ 0,8 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │      │

│раствор         │     │     │     │     │     │     │     │      │

│Испытуемая      │ 0,2 │-0,25│-0,25│-0,25│-0,25│-0,25│-0,25│-0,25 │

│сыворотка       │     │     │     │     │     │     │-0,25│      │

├────────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┤

│                                                                 │

│   После перемешивания  из первой пробирки 0,25 удаляют,  а 0,25 │

│переносят во вторую и восьмую пробирки  и далее  последовательно │

│переносят  по 0,25  мл  из  пробирки  в пробирку до седьмой,  из │

│которой 0,25 мл удаляют. Получается разведение:                  │

│                    1:5  1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:5     │

├────────────────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬──────┤

│Антиген по титру│ 0,25│0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │ -    │

│Физиологический │  -  │ -   │ -   │ -   │ -   │ -   │ -   │0,25  │

│раствор         │     │     │     │     │     │     │     │      │

│комплемент в    │ 0,25│0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25 │0,25  │

│рабочей дозе    │     │     │     │     │     │     │     │      │

├────────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┤

│         Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут           │

├────────────────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬──────┤

│Гемолитическая  │ 0,5 │0,5  │0,5  │0,5  │0,5  │0,5  │0,5  │0,5   │

│система         │     │     │     │     │     │     │     │      │

├────────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┤

│        Встряхнуть, поставить в термостат до наступления         │

│            полного гемолиза в контрольных пробирках             │

└─────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

4.3.3. Реакция связывания комплемента комплексом

липоидного антигена и реагина с использованием

естественного комплемента исследуемой сыворотки

(реакция Григорьева-Раппопорта)

 

Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с кардиолипиновым и неспецифическим антигенами. Образовавшиеся комплексы сорбируют естественный комплемент испытуемой сыворотки. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (дефибринированная баранья кровь + гемолитическая сыворотка).

Реагенты.

1. 0,85% раствор хлористого натрия х.ч. (физиологический раствор).

2. Антигены: обычный неспецифический и кардиолипиновый. Сохраняются в темном шкафу в пробирках с корковыми пробками.

3. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с разными титрами. Сохраняется в холодильнике.

4. Дефибринированная кровь барана.

Специальное оборудование.

Центрифуга.

Холодильник с температурой +4-6 град. С.

Термостат с температурой +37 град. С.

Пробирки размером 15х150 мм.

Пробирки размером 15х100 мм.

Пипетки градуированные 1, 2, 5 и 10 мл с делениями 0,01 мл.

Цилиндры градуированные.

Банки стеклянные.

Ход определения.

Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Обработка испытуемой сыворотки. Кровь в объеме 4-5 мл, взятую натощак из локтевой вены, оставляют стоять при комнатной температуре. Образовавшийся в пробирке сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенки пробирки, образовавшуюся прозрачную сыворотку осторожно сливают или отсасывают при помощи резинового баллона и пастеровской пипетки в другую пробирку. В реакции используется сыворотка не ранее 8 часов и не позже 36 часов после взятия крови. Высушенные сыворотки для исследования не пригодны.

2. Приготовление растворов антигенов. Антигены разводят согласно способу и титру, указанным на этикете. Титр - это количество антигена на 1 мл физиологического раствора.

3. Приготовление гемолитической системы. Гемолитическую сыворотку разводят по усиленному в 4 раза титру (например, при титре гемолиза 1:1200, обозначенном на этикетке, пользуются титром 1:300, т.е. 0,1 на 30 мл физиологического раствора). Для получения взвеси бараньих эритроцитов берут 1 мл дефибринированной крови на 24 мл физиологического раствора. Разведенную гемолитическую сыворотку и взвесь бараньих эритроцитов объединяют в равных объемах в количестве, необходимом для данного дня работы. Разведение гемолитической сыворотки вливают во взвесь бараньих эритроцитов, быстро перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 минут для сенсибилизации. Гемолитическая система годна в течение 12 часов с момента приготовления.

Основной опыт. Каждую испытуемую активную сыворотку исследуют в трех пробирках, в которые отмеривают по 0,2 мл. В первую добавляют 0,3 мл антигена серии I, во вторую - 0,3 мл антигена серии II; физиологический раствор приливают в первую пробирку в объеме 0,5 мл, во вторую - 0,5 мл и в третью пробирку - 0,8 мл. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и оставляют их при комнатной температуре (20-22 град. С) на 20-25 минут при периодическом встряхивании. После первичной инкубации во все пробирки доливают гемолитическую систему по 1,0 мл и, перемешав содержимое пробирок встряхиванием, оставляют их при той же температуре на 25-30 минут до полного гемолиза в контрольных пробирках (см. табл. 5).

 

Таблица 5

 

СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РЕАКЦИИ ГРИГОРЬЕВА-РАППОПОРТА

 

┌─────────────────────────────────┬──────────────────────────────┐

│                                 │         NN пробирок          │

│        Ингредиенты (в мл)       ├──────┬─────────┬─────────────┤

│                                 │  1   │   2     │ 3 (контроль)│

├─────────────────────────────────┼──────┼─────────┼─────────────┤

│   Испытуемая активная сыворотка │ 0,2  │  0,2    │ 0,2         │

│   Антиген серии I               │ 0,3  │  -      │ -           │

│   Антиген серии II              │ -    │  0,3    │ -           │

│   Физиологический раствор       │ 0,5  │  0,5    │ 0,8         │

├─────────────────────────────────┴──────┴─────────┴─────────────┤

│   Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 20-30 минут│

├─────────────────────────────────┬──────┬─────────┬─────────────┤

│   Гемолитическая система        │ 1,0  │  1,0    │ 1,0         │

├─────────────────────────────────┴──────┴─────────┴─────────────┤

│   Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 20-30 минут│

│         После полного гемолиза в контрольных пробирках         │

│              немедленный учет результатов реакции              │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

В случае отсутствия в некоторых сыворотках гемолиза в контрольных пробирках исследование их повторяют с введением в каждую пробирку дополнительно к испытуемой сыворотке по 0,2 мл активной отрицательной сыворотки из этого же опыта. При этом соответственно уменьшается объем физиологического раствора в каждой пробирке.

Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции Григорьева - Раппопорта пользуются системой четырех плюсов: полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабо положительная реакция); незначительная задержка гемолиза - + или +/- (сомнительная реакция).

Источник ошибок. Длительное хранение испытуемой сыворотки.

 

4.3.4. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного

антигена и реагина с использованием естественного

комплемента  и гемолизина исследуемой сыворотки

(реакция Вайнштейна-Резниковой)

 

Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с кардиолипиновым и неспецифическим антигенами. Образовавшиеся комплексы сорбируют естественный комплемент испытуемой сыворотки. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением 1% дефибринированной бараньей крови; роль гемолитической сыворотки выполняют естественные гемолизины испытуемой сыворотки.

Реагенты.

1. Физиологический раствор, антигены - обычный неспецифический и кардиолипиновый.

2. Дефибринированная кровь барана.

Специальное оборудование.

Холодильник с температурой +4-6 град. С.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Обработка испытуемой сыворотки. Для исследования требуется 4-5 мл крови. Взятую кровь оставляют при комнатной температуре. Образовавшийся сгусток стеклянной палочкой отделяют от стенок пробирки, прозрачную сыворотку осторожно сливают или отсасывают при помощи резинового баллона и пастеровской пипетки в другую пробирку. В реакции используются сыворотки не ранее 8 и не позже 24 часов после взятия крови. Высушенные сыворотки для исследования не пригодны.

2. Приготовление растворов антигенов. Антигены разводят в физиологическом растворе по утроенному титру. Например, на этикетке указан титр - 0,002; значит, в 1 мл физиологического раствора необходимо внести 0,006 мл антигена.

3. Приготовление 1% дефибринированной бараньей крови. На 100 мл физиологического раствора берут 1 мл дефибринированной бараньей крови, готовят объем, необходимый для данного дня работы.

Основной опыт. Каждую испытуемую активную сыворотку исследуют в трех пробирках, в которые отмеривают ее по 0,2 мл. В первую пробирку добавляют 0,3 мл антигена серии I, во вторую - 0,3 мл антигена серии II, в третью - 0,3 мл физиологического раствора. После 3-минутного встряхивания во все пробирки приливают по 0,75 мл 1% дефибринированной бараньей крови. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 45-60 минут. После наступления полного гемолиза в контрольных пробирках регистрируют результат реакции (см. табл. 6).

В случае отсутствия в некоторых сыворотках гемолиза в контрольных пробирках исследование их повторяют при введении в каждую пробирку по 0,1 мл активной отрицательной сыворотки из этого же опыта (см. табл. 7).

 

Таблица 6

 

СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РЕАКЦИИ ВАЙНШТЕЙНА-РЕЗНИКОВОЙ

 

┌─────────────────────────────────┬──────────────────────────────┐

│                                 │         NN пробирок          │

│        Ингредиенты (в мл)       ├──────┬────────┬──────────────┤

│                                 │  1   │   2    │  3 (контроль)│

├─────────────────────────────────┼──────┼────────┼──────────────┤

│   Испытуемая активная сыворотка │ 0,2  │  0,2   │  0,2         │

│   Антиген серии I               │ 0,3  │  -     │  -           │

│   Антиген серии II              │ -    │  0,3   │  -           │

│   Физиологический раствор       │ -    │  -     │  0,3         │

├─────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────────────┤

│                Встряхивание в течение 3 минут                  │

├─────────────────────────────────┬──────┬────────┬──────────────┤

│   1% дефибринированная баранья  │ 0,75 │  0,75  │  0,75        │

│   кровь                         │      │        │              │

├─────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────────────┤

│   Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 45-60 минут│

│         После полного гемолиза в контрольных пробирках         │

│              немедленный учет результатов реакции              │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

 

Таблица 7

 

Схема основного опыта реакции Вайнштейна-Резниковой

при исследовании сывороток с недостаточной активностью

естественного комплемента и гемолизина

 

┌─────────────────────────────────┬──────────────────────────────┐

│                                 │         NN пробирок          │

│       Ингредиенты (в мл)        ├──────┬────────┬──────────────┤

│                                 │  1   │   2    │  3 (контроль)│

├─────────────────────────────────┼──────┼────────┼──────────────┤

│ Испытуемая активная сыворотка   │ 0,2  │  0,2   │  0,2         │

│ Отрицательная активная сыворотка│ 0,1  │  0,1   │  0,1         │

│ Антиген серии I                 │ 0,3  │   -    │   -          │

│ Антиген серии II                │  -   │  0,3   │   -          │

│ Физиологический раствор         │  -   │   -    │  0,3         │

├─────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────────────┤

│                Встряхивание в течение 3 минут                  │

├─────────────────────────────────┬──────┬────────┬──────────────┤

│ 1% дефибринированная баранья    │ 0,75 │  0,75  │  0,75        │

│ кровь                           │      │        │              │

├─────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────────────┤

│   Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 45-60 минут│

│         После полного гемолиза в контрольных пробирках         │

│              немедленный учет результатов реакции              │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции Вайнштейна - Резниковой пользуются системой четырех плюсов: полная задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - 2+ (слабо положительная реакция); незначительная задержка гемолиза - + или +/- (сомнительная реакция).

Источник ошибок. Длительное хранение испытуемых сывороток.

 

4.3.5. Реакция трехфазного связывания комплемента

комплексом липоидного антигена и реагина исследуемой

сыворотки (реакция Колмера, качественный метод)

 

Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с неспецифическим и кардиолипиновым антигенами. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (бараньи эритроциты + гемолитическая сыворотка). Особенностью данной реакции является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента.

Реагенты.

1. Солевой раствор: хлористый натрий (х.ч.) - 8,5 г, сернокислый магний (х.ч.) - 0,1 г, дистиллированная вода - 1 л.

2. Антигены: неспецифический и кардиолипиновый. Сохраняют в темном шкафу в пробирках под корковыми пробками.

3. Комплемент - смесь сывороток крови морских свинок. Может быть использован лиофильно высушенный или жидкий, консервированный 5 г сернокислого натрия и 4 г борной кислоты на 100 мл. Хранится в холодильнике.

4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с разными титрами. Консервируется нейтральным глицерином, сохраняется в холодильнике.

5. Эритроциты барана.

Специальное оборудование.

Центрифуга.

Термостат с температурой +37 град. С.

Холодильник с температурой +4 град. С.

Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.

Пробирки: 15х100 мм и 15х150 мм.

Стеклянные банки емкостью 200 и 500 мл.

Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл.

Цилиндры градуированные на 100 и 500 мл.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Обработка испытуемой сыворотки производится согласно методике, принятой для серологических исследований на сифилис.

2. Приготовление солевого раствора. В 1 л дистиллированной воды растворяют 0,85 г хлористого натрия и 0,1 г сернокислого магния. Свежеприготовленный солевой раствор фильтруют через складчатый бумажный фильтр и используют только в день постановки реакции. Солевой раствор хранению не подлежит.

3. Приготовление разведения антигенов. Антигены разводят соответственно способу и титру, указанным на этикетке. Титр - это количество антигена на 1 мл солевого раствора.

4. Приготовление раствора гемолизина. Гемолитическую сыворотку консервируют химически чистым нейтральным глицерином в соотношении 1:1 и хранят в холодильнике. Активность такой основной гемолитической сыворотки сохраняется в течение 3-4 лет. Из основного консервированного гемолизина готовят рабочий раствор 1:100, который и применяется для постановки основного опыта. Для приготовления рабочего раствора гемолизина в колбу отмеряют 94 мл солевого раствора и 4 мл 5% фенола. Взбалтыванием раствор фенола хорошо перемешивается с солевым раствором, затем туда добавляют 2 мл основного консервированного гемолизина. Содержимое колбы вновь перемешивают. Полученный рабочий раствор сохраняют в холодильнике, срок годности 1 год.

Определение титра гемолизина в рабочем растворе 1:100. Для определения титра гемолизина в рабочем растворе 1:100 используют 10 пробирок, в которых готовят ряд возрастающих разведений от 1:1000 до 1:16000 в объеме 0,5 мл. Во все 10 пробирок к каждому разведению рабочего раствора гемолизина добавляют по 0,3 мл комплемента, разведенного 1:30, и по 0,5 мл 2% взвеси бараньих эритроцитов (см. табл. 8). Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 1 час при периодическом встряхивании. После одночасовой инкубации определяют единицу или титр рабочего раствора гемолизина, т.е. наивысшее разведение, которое в присутствии комплемента в течение 1 часа пребывания в термостате дает полный гемолиз 0,5 мл 2% взвеси бараньих эритроцитов.

Для титрования комплемента и проведения опыта применяется гемолизин по удвоенному титру (2 единицы гемолизина) (см. табл. 9). Например, титр гемолизина в рабочем растворе - 1:6000 (1 единица гемолизина), удвоенный титр - 1:3000 (2 единицы гемолизина). Так как рабочий раствор гемолизина приготовлен 1:100, то для основного опыта его нужно развести 1:30 (1 мл рабочего раствора гемолизина + 29 мл солевого раствора). Титруют каждую новую серию гемолизина.

 

Таблица 8

 

Схема определения титра гемолизина в рабочем растворе

(в мл)

 

┌──────────────┬─────────────┬───────────┬────────┬──────────────┐

│  Разведения  │ Количество  │Комплемент │Солевой │  2% взвесь   │

│  гемолизина  │разведенного │в разведе- │раствор │  эритроцитов │

│              │ гемолизина  │нии 1:30   │        │    барана    │

├──────────────┼─────────────┼───────────┼────────┼──────────────┤

│   1:1000     │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:2000     │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:3000     │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:4000     │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:5000     │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:6000     │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:8000     │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:10000    │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:12000    │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

│   1:16000    │   0,5       │   0,3     │  1,7   │     0,5      │

└──────────────┴─────────────┴───────────┴────────┴──────────────┘

 

Таблица 9

 

Схема разведения гемолизина

 

┌──────────────────┬──────────────────┬──────────────────────────┐

│  Титр гемолизина │ Гемолизин по     │  Приготовление раствора  │

│   (1 единица     │ удвоенному       │   гемолизина для опыта   │

│   гемолизина)    │ титру (2 еди-    ├─────────────┬────────────┤

│                  │ ницы гемолизина) │  рабочий    │  солевой   │

│                  │                  │  раствор    │  раствор   │

│                  │                  │ гемолизина  │            │

│                  │                  │   1:100     │            │

├──────────────────┼──────────────────┼─────────────┼────────────┤

│   1:4000         │     1:2000       │    0,3      │  5,7       │

│   1:5000         │     1:2500       │    0,2      │  4,8       │

│   1:6000         │     1:3000       │    0,2      │  5,8       │

│   1:8000         │     1:4000       │    0,15     │  5,85      │

│   1:10000        │     1:5000       │    0,1      │  4,9       │

│   1:12000        │     1:6000       │    0,1      │  5,9       │

│   1:16000        │     1:8000       │    0,1      │  7,9       │

└──────────────────┴──────────────────┴─────────────┴────────────┘

 

Разведения гемолизина по удвоенному титру готовят в объеме, необходимом для данного рабочего дня.

 

5. Приготовление взвеси эритроцитов барана. Дефибринированную кровь барана в объеме, необходимом для работы на данный день, центрифугируют, плазму осторожно отсасывают и осадок трижды отмывают 5-6 объемами солевого раствора. При последнем промывании надосадочная жидкость должна быть бесцветной. Из плотного осадка готовят 2% взвесь в солевом растворе в объеме, необходимом для данного рабочего дня.

Раствор гемолизина и взвесь эритроцитов барана при титровании комплемента при постановке основного опыта разливают раздельно.

6. Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят солевым раствором 1:30. Титрование проводят в восьми пробирках. В первые семь пробирок разливают разведенный комплемент в дозах 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5 мл и добавляют во все семь пробирок по 0,5 мл антигена, разведенного по титру. После этого в восемь пробирок разливают солевой раствор в следующих дозах: 1,3; 1,25; 1,2; 1,15; 1,1; 1,05; 1,0; 2,5 мл. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат на 45 минут. После инкубации в первые семь пробирок приливают раствор гемолизина по удвоенному титру по 0,5 мл и 2% взвесь эритроцитов барана по 0,5 мл во все восемь пробирок. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и помещают в термостат на 45 минут при периодическом встряхивании (см. табл. 10).

 

Таблица 10

Схема титрования комплемента для реакции Колмера

 

┌─────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐

│   Ингредиенты (в мл)    │            NN пробирок               │

│                         ├─────┬─────┬────┬────┬───┬────┬───┬───┤

│                         │  1  │  2  │  3 │  4 │ 5 │ 6  │ 7 │ 8 │

├─────────────────────────┼─────┼─────┼────┼────┼───┼────┼───┼───┤

│ Комплемент 1:30         │ 0,2 │0,25 │0,3 │0,35│0,4│0,45│0,5│ - │

│ Антиген по титру        │ 0,5 │0,5  │0,5 │0,5 │0,5│0,5 │0,5│ - │

│ Солевой раствор         │ 1,3 │1,25 │1,2 │1,15│1,1│1,05│1,0│2,5│

├─────────────────────────┴─────┴─────┴────┴────┴───┴────┴───┴───┤

│         Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут          │

├─────────────────────────┬─────┬─────┬────┬────┬───┬────┬───┬───┤

│ Гемолитическая сыворотка│ 0,5 │0,5  │0,5 │0,5 │0,5│ 0,5│0,5│ - │

│ по удвоенному титру     │     │     │    │    │   │    │   │   │

│ 2% взвесь эритроцитов   │ 0,5 │0,5  │0,5 │0,5 │0,5│ 0,5│0,5│0,5│

│ барана                  │     │     │    │    │   │    │   │   │

├─────────────────────────┴─────┴─────┴────┴────┴───┴────┴───┴───┤

│         Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут          │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

По истечении 45 минут определяют рабочую дозу комплемента. Минимальное количество комплемента, которое способствовало полному гемолизу 0,5 мл 2% взвеси эритроцитов барана, является титром комплемента. Рабочая доза комплемента должна быть на 0,05 мл больше титра комплемента (1 единица). Для реакции Колмера используют разведение комплемента, содержащее 2 единицы в 1 мл. Например, титр комплемента 0,3 мл; рабочая доза 0,3 + 0,05 = 0,35 мл (1 единица). Две точных единицы, или общая рабочая доза, будут равны 0,7 мл. Для того чтобы подсчитать необходимое разведение комплемента для проводимой реакции, нужно основное разведение 1:30

                                         30

разделить на две единицы, т.е. на 0,7 : ---- = 43.  Следовательно,

                                         0,7

в 42 объемах солевого раствора необходимо развести 1 мл комплемента морской свинки.

Для подсчета необходимых разведений комплемента используется специальная таблица (см. табл. 11).

 

Таблица 11

Схема разведения комплемента (в мл)

 

┌──────────────┬────────────┬─────┬────────────┬─────────────────┐

│    Титр      │Рабочая доза│Две  │Разведения  │  Приготовление  │

│ комплемента  │комплемента │еди- │комплемента │   разведений    │

│              │(1 единица) │ницы │            │   комплемента   │

│              │            │     │            ├────────┬────────┤

│              │            │     │            │ Компле-│Солевой │

│              │            │     │            │ мент   │раствор │

├──────────────┼────────────┼─────┼────────────┼────────┼────────┤

│   0,3        │  0,35      │0,7  │   1:43     │   1    │   42   │

│   0,35       │  0,4       │0,8  │   1:37     │   1    │   36   │

│   0,4        │  0,45      │0,9  │   1:33     │   1    │   32   │

│   0,45       │  0,5       │1,0  │   1:30     │   1    │   29   │

│   0,5        │  0,55      │1,1  │   1:27     │   1    │   26   │

└──────────────┴────────────┴─────┴────────────┴────────┴────────┘

 

Основной опыт. При постановке реакции Колмера с двумя антигенами - неспецифическим и кардиолипиновым - каждая сыворотка исследуется в трех пробирках. Кроме того, ко всему опыту ставят контроль ингредиентов в четырех пробирках. Каждую исследуемую инактивированную сыворотку разливают в три пробирки по 0,2 мл; в первую пробирку приливают 0,5 мл антигена I по по титру, во вторую - 0,5 мл антигена II по титру; в третью - 0,5 мл солевого раствора. В первую пробирку для контроля ингредиентов наливают 0,5 мл антигена I по титру, во вторую - 0,5 мл антигена II по титру. Солевой раствор добавляют в пробирки для контроля ингредиентов в следующих объемах: в первую пробирку - 0,2 мл, во вторую - 0,2 мл, в третью - 0,7 мл и в четвертую - 2,2 мл. После встряхивания все пробирки оставляют при комнатной температуре на 10 минут (первая фаза реакции). Затем во все пробирки с исследуемыми сыворотками и в первую, вторую и третью пробирки для контроля ингредиентов приливают по 1,0 мл комплемента, разведенного по общей рабочей дозе (2 единицы). После встряхивания все пробирки помещают в холодильник при температуре +6-8 град. С на 18-20 часов (вторая фаза реакции). После чего пробирки помещают в термостат, а затем добавляют по 0,5 мл гемолитической сыворотки, разведенной по удвоенному титру, во все пробирки с исследуемыми сыворотками и в первую, вторую и третью пробирки для контроля ингредиентов и по 0,5 мл 2% взвеси эритроцитов барана во все пробирки. После встряхивания пробирки помещают в термостат на 45-60 минут до полного гемолиза в контрольных пробирках исследуемых сывороток (третья фаза реакции) (см. табл. 12).

 

Таблица 12

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ КОЛМЕРА

 

Ингредиенты       (в мл)	NN пробирок
	исследуемая сыворотка		3    (контр.)	контроль      ингредиентов
	1	2		1	2	3	4
Испытуемая          инактивированная    сыворотка,          разведенная 1:5	0,2	0,2	0,2	-	-	-	-
Антиген I           по титру	0,5	-	-	0,5	-	-	-
Антиген II          по титру	-	0,5	-	-	0,5	-	-
Солевой раствор	-	-	0,5	0,2	0,2	0,7	2,2
Встряхнуть, оставить при комнатной температуре на 10 минут
Комплемент          (2 единицы)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	-
Встряхнуть, поставить в холодильник на 18-20 часов,       затем в термостат на 10 минут
Гемолитическая      сыворотка по        удвоенному титру	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-
2% взвесь           эритроцитов барана	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Встряхнуть, поставить в термостат на 45-60 минут до       наступления полного гемолиза в контрольных пробирках      исследуемых сывороток

 

Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции Колмера пользуются системой четырех плюсов. После наступления гемолиза в контрольных пробирках регистрируют результаты реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках. Полный гемолиз в опытных пробирках расценивается как отрицательная реакция. Полная задержка гемолиза в опытных пробирках - резко положительная реакция (4+); значительная задержка гемолиза - положительная реакция (3+); частичная задержка гемолиза - слабо положительная реакция(2+); незначительная задержка гемолиза - сомнительная реакция (1+ или +/-).

Источники ошибок.

1. Избыток комплемента в опыте.

2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.

3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.

 

4.3.6. Реакция трехфазного связывания комплемента

комплексом липоидного антигена и реагина исследуемой

сыворотки (реакция Колмера, количественный метод)

 

Принцип. Определение титра реагинов в положительных сыворотках путем исследования в реакции уменьшающихся объемов при разведении сыворотки солевым раствором. Особенностью данной реакции является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента.

Реагенты.

Солевой раствор, антигены, гемолитическая система. Готовятся таким же способом, как и для качественной реакции Колмера.

Специальное оборудование.

Центрифуга.

Термостат с температурой +37 град. С.

Холодильник с температурой +4 град. С.

Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.

Пробирки - 15х100 мм, 15х150 мм.

Банки стеклянные емкостью 200 и 500 мл.

Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями 0,01 мл.

Цилиндры градуированные на 100 и 500 мл.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Подготовка испытуемой сыворотки. Сыворотку, обнаружившую резко положительный результат в качественной методике Колмера, повторно инактивируют 15 минут в водяной бане. Если исследуют новую порцию той же самой сыворотки, инактивирование удлиняют до 30 минут.

2. Приготовление антигена. Антиген разводят солевым раствором согласно способу и титру, указанным на этикетке. Титр - это количество антигена на 1 мл солевого раствора.

3. Приготовление разведения гемолитической сыворотки. 4. Приготовление взвеси эритроцитов барана и 5. Титрование комплемента - производят так же, как и для качественной методики реакции Колмера.

Основной опыт. Каждую испытуемую сыворотку исследуют в восьми пробирках. Ко всему опыту ставят контроли ингредиентов (антигена, гемолизина и эритроцитов барана), а также заведомо положительной и заведомо отрицательной сыворотки из предыдущего опыта. В первую пробирку отмеряют 0,9 мл солевого раствора, в остальные семь - по 0,5 мл в каждую. В пробирку для контроля антигена вносят 0,5 мл солевого раствора, в пробирку для контроля гемолизина - 1,0 мл, для контроля эритроцитов барана - 2,5 мл солевого раствора. В первую пробирку приливают 0,6 мл испытуемой инактивированной сыворотки и, перемешав, переносят по 0,5 мл во вторую и в восьмую (контрольную) пробирки. Затем перемешивают содержимое второй пробирки и переносят 0,5 мл в третью пробирку, из третьей после перемешивания в четвертую, из четвертой - в пятую, из пятой - в шестую, из шестой - в седьмую, а из седьмой после перемешивания 0,5 мл удаляют. Таким образом, содержание сыворотки в семи опытных пробирках будет следующим: 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,012, 0,006, 0,003 мл.

В первые семь пробирок с испытуемой сывороткой и в пробирку для контроля антигена приливают по 0,5 мл антигена, разведенного по титру. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. По истечение 10 минут во все восемь пробирок с испытуемой сывороткой и в три пробирки с контролями ингредиентов приливают комплемент, разведенный согласно титрованию данного дня, в объеме 1,0 мл в каждую пробирку. После встряхивания штативы с пробирками помещают в холодильник при температуре +6-8 град. С на 18-20 часов с последующей инкубацией в термостате в течение 10 минут. После 10-минутного пребывания в термостате во все пробирки с испытуемыми сыворотками, а также в пробирку с контролем антигена и в пробирку с контролем гемолитической сыворотки приливают по 0,5 мл гемолитической сыворотки, разведенной по удвоенному титру. Одновременно во все пробирки с испытуемыми сыворотками и во все пробирки для контроля ингредиентов приливают по 0,5 мл 2% взвеси эритроцитов барана. Перемешав содержимое пробирок встряхиванием, их помещают в термостат на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольных пробирках (см. табл. 13).

Если испытуемая сыворотка в разведении 1:96 (седьмая пробирка) дала полную задержку гемолиза, рекомендуется исследовать ее в разведениях 1:192 и 1:768, пользуясь вышеизложенной методикой.

Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки является ее наибольшее разведение, давшее полную задержку гемолиза - 4+ или значительную задержку гемолиза - 3+.

Источники ошибок.

1. Неправильный выбор дозы комплемента (избыток или недостаток в опыте).

2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.

3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.

 

4.3.7. Осадочная реакция с образованием комплекса антигена

Кана и  реагина исследуемой сыворотки

(реакция Кана)

 

Принцип. Реакция основана на образовании комплекса антиген Кана + реагины испытуемой сыворотки, проявляющегося образованием макрофлокулята.

Реагенты.

1. Физиологический раствор - хлористого натрия х.ч. 8,5 г на 1 литр дистиллированной воды.

2. Антиген Кана. Сохраняется в темноте при комнатной температуре во флаконах или пробирках, плотно закрытых корковыми пробками. Антиген разводят по титру согласно способу, указанному на этикетке.

 

Таблица 13

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МЕТОДИКИ РЕАКЦИИ КОЛМЕРА

 

┌────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐

│            │                  NN пробирок                        │

│            ├───────────────────────────────────┬─────────────────┤

│            │                                   │Контроли ингреди-│

│            │                                   │     ентов       │

│Ингредиенты │        Разведение сыворотки       ├─────┬─────┬─────┤

│  (в мл)    │                                   │Анти-│Гемо-│Эрит-│

│            │                                   │ген  │лизин│роци-│

│            │                                   │     │     │ты   │

│            ├───┬───┬───┬───┬───┬────┬───┬──────┼─────┼─────┼─────┤

│            │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6  │ 7 │  8   │  9  │ 10  │ 11  │

│            │   │   │   │   │   │    │   │Контр.│     │     │     │

│            │   │   │   │   │   │    │   │сывор.│     │     │     │

├────────────┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼───┼──────┼─────┼─────┼─────┤

│Солевой     │0,9│0,5│0,5│0,5│0,5│ 0,5│0,5│ 0,5  │ 0,5 │ 1,0 │ 2,5 │

│раствор     ├───┴───┴───┴───┴───┴────┴───┴──────┴─────┴─────┴─────┤

│Испытуемая  │0,6 перемешивают, переносят  по  0,5 мл во  вторую  и│

│инактивиро- │    восьмую пробирки. Из второй пробирки после  пере-│

│ванная  сы- │    мешивания переносят последовательно из пробирки в│

│воротка     │    пробирку (из второй в третью, из третьей  в  чет-│

│            │    вертую и т.д.)  по  0,5 мл  до  7-й пробирки, из │

│            │    которой 0,5 мл удаляют.                          │

├────────────┴─────────────────────────────────────────────────────┤

│                Получается разведение сыворотки:                  │

│        1:1,5  1:3  1:6  1:12  1:24  1:48  1:96  1:1,5            │

├──────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│    Контрольные, заведомо положительную и заведомо отрицательную  │

│    сыворотки, разливают так же, как испытуемую сыворотку         │

├────────────┬───┬───┬───┬───┬────┬───┬───┬──────┬──────┬────┬─────┤

│Антиген     │0,5│0,5│0,5│0,5│0,5 │0,5│0,5│  -   │ 0,5  │ -  │ -   │

│по титру    │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

├────────────┴───┴───┴───┴───┴────┴───┴───┴──────┴──────┴────┴─────┤

│       Встряхнуть, оставить при комнатной температуре на 10 минут │

├────────────┬───┬───┬───┬───┬────┬───┬───┬──────┬──────┬────┬─────┤

│Комплемент, │1,0│1,0│1,0│1,0│1,0 │1,0│1,0│ 1,0  │ 1,0  │1,0 │1,0  │

│разведен-   │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│ный из      │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│расчета 2   │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│единицы     │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

├────────────┴───┴───┴───┴───┴────┴───┴───┴──────┴──────┴────┴─────┤

│           Встряхнуть, поставить в холодильник на 18-20 часов     │

│        с последующей инкубацией в термостате в течение 10 минут  │

├────────────┬───┬───┬───┬───┬────┬───┬───┬──────┬──────┬────┬─────┤

│Гемолити-   │0,5│0,5│0,5│0,5│0,5 │0,5│0,5│ 0,5  │ 0,5  │0,5 │ -   │

│ческая сы-  │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│воротка по  │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│удвоенному  │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│титру       │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│2% взвесь   │0,5│0,5│0,5│0,5│ 0,5│0,5│0,5│  0,5 │  0,5 │ 0,5│0,5  │

│эритроцитов │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

│барана      │   │   │   │   │    │   │   │      │      │    │     │

├────────────┴───┴───┴───┴───┴────┴───┴───┴──────┴──────┴────┴─────┤

│            Встряхнуть, поставить в термостат на 45-60 минут      │

│               до полного гемолиза в контрольных пробирках        │

└──────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

Специальное оборудование.

Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.

Термостат с температурой +37 град. С.

Аппарат для встряхивания (шуттель-аппарат).

Пробирки размером 11х75 мм.

Пипетки градуированные на 0,1, 1, 2 и 5 мл с делениями на 0,01 мл.

Стеклянные стаканчики на 20 и 40 мл.

Банки стеклянные на 200 и 500 мл.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Приготовление физиологического раствора. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия. Раствор фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

2. Обработка испытуемой сыворотки. Производится так же, как для реакции Вассермана.

3. Приготовление разведения антигена. Антиген разводят по титру, который, как правило, бывает 1 +1 или 1 +1,2, т.е. на каждый 1 мл антигена добавляют 1 мл или 1,2 мл физиологического раствора. Для приготовления разведения антигена в низкий стеклянный стаканчик отмеривают необходимый для данного рабочего дня объем физиологического раствора, во второй стаканчик - необходимое количество антигена Кана. Для отмеривания антигена Кана обязательно пользоваться сухой пипеткой. Затем физиологический раствор быстро вливают в антиген и смесь переливают из стаканчика в стаканчик 6-7 раз (не встряхивать!). Разведение антигена оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Приготовленное разведение антигена Кана пригодно для постановки реакции только в течение 30 минут. Поэтому при большом количестве испытуемых сывороток рекомендуется готовить разведения антигена отдельными порциями.

Основной опыт. Каждую сыворотку исследуют в одной пробирке, в которую при помощи микропипетки вносят 0,025 мл разведенного антигена, стараясь попасть на дно. Приливают 0,15 мл исследуемой сыворотки и встряхивают на шуттель-аппарате 3 минуты. После этого в пробирку приливают 0,5 мл физиологического раствора и встряхивают до смешивания содержимого пробирок. Для всего опыта ставят три контроля: антигена, заведомо положительной и заведомо отрицательной сыворотки (см. табл. 14).

 

Таблица 14

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ КАНА

 

┌──────────────────────────────────┬─────────────────────────────┐

│       Ингредиенты (в мл)         │       NN пробирок           │

│                                  ├──────┬──────────────────────┤

│                                  │   1  │          контроли    │

│                                  │      ├────────┬──────┬──────┤

│                                  │      │    2   │   3  │    4 │

├──────────────────────────────────┼──────┼────────┼──────┼──────┤

│Антиген, разведенный по титру     │0,025 │ 0,025  │0,025 │0,025 │

│Сыворотка испытуемая              │0,15  │   -    │  -   │  -   │

│Сыворотка заведомо положительная  │ -    │ 0,15   │  -   │  -   │

│Сыворотка заведомо отрицательная  │ -    │   -    │0,15  │  -   │

│Физиологический раствор           │ -    │   -    │  -   │0,15  │

├──────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────┴──────┤

│              Встряхивание в течение 3 минут                    │

├──────────────────────────────────┬──────┬────────┬──────┬──────┤

│Физиологический раствор           │0,5   │ 0,5    │0,5   │0,5   │

├──────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────┴──────┤

│        Встряхивание до смешивания содержимого пробирок         │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

Оценка результатов. Определение результатов реакции Кана производят непосредственно после добавления физиологического раствора невооруженным глазом, при помощи лупы или при помощи агглютиноскопа. Пользоваться следует каким-либо одним методом. Для обозначения позитивности реакции Кана пользуются системой четырех плюсов: выпадение крупных хлопьев, жидкость прозрачная - резко положительная реакция (4+); образование ясного преципитата со значительным просветлением жидкости - положительная реакция (3+); образование преципитата со взвешенными мелкими частицами в мутноватой жидкости - слабо положительная реакция (2+); мелкие частицы, взвешенные в мутной жидкости - сомнительная реакция (1+). Отсутствие осадка и взвешенных частиц в прозрачной опалесцирующей жидкости в опытных пробирках и в пробирке с контролем антигена регистрируют как отрицательный результат реакции Кана.

Источники ошибок.

1. Избыток антигена в реакции.

2. Длительное хранение разведенного антигена.

3. Загрязнение испытуемой сыворотки или лабораторной посуды.

 

4.3.8. Осадочная реакция с образованием комплекса

цитохолевого антигена и реагина исследуемой сыворотки

(реакция Закс-Витебского)

 

Принцип. Реакция основана на образовании комплекса антиген цитохолевый + реагины испытуемой сыворотки, проявляющегося образованием макрофлокулята.

Реагенты.

1. Физиологический раствор - хлористый натрий х.ч. 8,5 г на 1 литр дистиллированной воды.

2. Антиген Закс-Витебского (цитохолевый). Сохраняется в темноте при комнатной температуре во флаконах или пробирках, плотно закрытых корковыми пробками. Антиген разводят по титру, согласно способу, указанному на этикетке.

Специальное оборудование.

Термостат с температурой +37 град. С.

Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.

Аппарат для встряхивания (шуттель-аппарат).

Пробирки размером 11х75 мм.

Пипетки градуированные на 0,1, 1, 2 и 5 мл с делениями на 0,01 мл.

Пробирки размером 15х150 мм.

Банки стеклянные на 200 и 500 мл.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Приготовление физиологического раствора. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия. Раствор фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

2. Обработка испытуемой сыворотки. Производится так же, как для реакции Вассермана.

3. Приготовление разведения антигена. Антиген Закс-Витебского (цитохолевый) разводят по титру, который бывает 1:2 или 1:3, т.е. в 2 мл или в 3 мл физиологического раствора добавляют 1 мл антигена. Заранее отмеривают необходимое для данного рабочего дня количество физиологического раствора. Нужный объем антигена, набранный сухой пипеткой, вдувают в физиологический раствор, перемешивают и оставляют для созревания при комнатной температуре на 10 минут.

Основной опыт. Каждую сыворотку исследуют в одной пробирке в объеме 0,1 мл. После добавления 0,05 мл разведенного антигена смесь встряхивают три минуты и оставляют при комнатной температуре на 30 минут. После этого добавляют 0,5 мл физиологического раствора и повторно встряхивают 5-10 секунд. Для всего опыта ставят три контроля: антигена, заведомо положительной и заведомо отрицательной сыворотки из предыдущего опыта (см. табл. 15)

 

Таблица 15

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЗАКС-ВИТЕБСКОГО (цитохолевой)

 

┌──────────────────────────────────┬─────────────────────────────┐

│                                  │       NN пробирок           │

│                                  ├──────┬──────────────────────┤

│      Ингредиенты (в мл)          │   1  │          контроли    │

│                                  │      ├────────┬──────┬──────┤

│                                  │      │    2   │   3  │    4 │

├──────────────────────────────────┼──────┼────────┼──────┼──────┤

│Сыворотка испытуемая              │0,1   │   -    │  -   │  -   │

│Сыворотка заведомо положительная  │ -    │ 0,1    │  -   │  -   │

│Сыворотка заведомо отрицательная  │ -    │   -    │0,1   │  -   │

│Физиологический раствор           │ -    │   -    │  -   │0,1   │

│Антиген, разведенный по титру     │0,05  │ 0,05   │0,05  │0,05  │

├──────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────┴──────┤

│              Встряхивать 3 минуты, оставить при                │

│               комнатной температуре на 30 минут                │

├──────────────────────────────────┬──────┬────────┬──────┬──────┤

│Физиологический раствор           │0,5   │ 0,5    │0,5   │0,5   │

├──────────────────────────────────┴──────┴────────┴──────┴──────┤

│                     Встряхивать 5-10 секунд                    │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

Оценка результатов. Учет результатов реакции Закс-Витебского (цитохолевой) производят тут же после добавления физиологического раствора и встряхивания невооруженным глазом или при помощи лупы, или при помощи агглютиноскопа. Необходимо пользоваться каким-либо одним методом. Для обозначения позитивности реакции Закс-Витебского (цитохолевой) пользуются системой четырех плюсов: выпадение крупных хлопьев, жидкость прозрачная - резко положительная реакция (4+); образование ясного преципитата со значительным просветлением жидкости - положительная реакция (3+); образование преципитата со взвешенными мелкими частицами в мутноватой жидкости - слабо положительная реакция (2+); мелкие частицы, взвешенные в мутной жидкости, - сомнительная реакция (1+). Отсутствие осадка и взвешенных частиц в прозрачной опалесцирующей жидкости в опытных пробирках и в пробирке с контролем антигена регистрируют как отрицательный результат реакции Закс-Витебского (цитохолевой).

Источники ошибок.

1. Избыток антигена в реакции.

2. Длительное хранение разведенного антигена.

3. Загрязнение испытуемой сыворотки или лабораторной посуды.

 

4.3.9. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ)

 

Принцип. Реакция основана на феномене потери подвижности бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента в условиях анаэробиоза.

Реагенты.

1. Едкий натрий, х.ч.

2. Двууглекислый натрий, х.ч.

3. Хлористый натрий, х.ч.

4. Спирт этиловый.

5. Эфир для наркоза.

6. Стрептомицин.

7. Кортизон или гидрокортизон.

8. Альбумин из человеческой сыворотки, лиофилизированный.

9. Желатина пищевая.

10. Азот газообразный.

11. Углекислый газ.

12. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка. Сохраняется в холодильнике.

13. Комплемент - свежая смесь стерильной сыворотки крови морских свинок. Хранится в холодильнике замороженным. Консервированный комплемент для постановки реакции непригоден. Высушенный из замороженного состояния комплемент - хуже, но может быть использован при условии, что перед высушиванием в него не добавляли консервант.

14. Эритроциты барана. Кровь получают у барана пункцией яремной вены. Кровь собирают в сухую чистую стеклянную банку со стеклянными бусами, которую встряхивают 10-15 минут. Фильтрованием через 2-3 слоя марли отделяют образовавшиеся сгустки фибрина. Дефибринированная кровь барана может храниться в холодильнике в течение 3-5 дней.

15. Говяжье мясо.

Специальное оборудование.

Центрифуга.

Термостат с температурой +35 град. С.

Холодильник с температурой в морозильном отделении -10-15 град. С.

Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.

Микроскоп бинокулярный с конденсором темного поля (окуляр 10х, объектив 40х).

Осветитель к микроскопу.

Бактериальные фильтры Л3.

Микроанаэростат.

Вакуумный насос.

Баллон со сжатым азотом.

Кварцевая лампа.

Аппарат для встряхивания (шуттель-аппарат).

Стерилизатор.

Шприцы на 5 и 10 мл.

Иглы для инъекций.

Пинцеты хирургические.

Ножницы прямые.

Пробирки 15х150 мм.

Пробирки 11х75 мм.

Пробирки центрифужные.

Чашки Петри.

Бюксы стеклянные на 50 мл.

Флаконы стеклянные на 50 и 100 мл.

Ампулы стеклянные на 5 и 10 мл.

Банки стеклянные на 100, 200 и 500 мл.

Пипетки пастеровские.

Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл.

Стекла предметные.

Стекла покровные.

Лабораторные животные.

Кролики - самцы весом 2,5-3 кг.

Морские свинки.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1. Приготовление солевого раствора. Растворяют 8,3 г хлористого натрия в 1 литре дистиллированной воды. Раствор фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

2. Обработка испытуемой сыворотки. Кровь для реакции иммобилизации бледных трепонем берут из вены стерильно в сухую, чистую, специально вымытую для этой цели и простерилизованную пробирку. Кожу в месте прокола протирают эфиром. Больной перед взятием крови не должен принимать медикаменты, которые могут оказать вредное влияние на подвижность бледных трепонем. Необходимо прекратить введение дюрантных и водорастворимых препаратов пенициллина на срок возможной их задержки в организме. Взятую кровь обрабатывают как для реакции Вассермана, но с соблюдением стерильности. В реакции применяют сыворотку крови, инактивированную в течение 30 минут в водяной бане. В случае повторного исследования инактивирование проводят вновь в течение 15 минут. Консерванты в сыворотку добавлять нельзя.

При необходимости сыворотку можно хранить длительно (10-15 дней) при температуре -10-15 град. С; при обычной температуре холодильника +4-6 град. С только 3-4 дня, так как в дальнейшем отмечается снижение позитивности сывороток крови больных сифилисом. Сыворотки крови, высушенные на вощанке с добавлением свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара по 3 капли на 0,5 мл сыворотки, можно в отдельных случаях применять для исследования в реакции иммобилизации бледных трепонем. Следует учитывать при этом, что титр иммобилизинов может снижаться. В сыворотках крови с невысоким титром иммобилизинов снижение может быть настолько значительным, что они станут отрицательными в реакции иммобилизации бледных трепонем; поэтому срок годности высушенных сывороток должен быть 5 дней с момента приготовления - в южных районах СССР или в жаркое время года и 10 дней - в остальной части СССР.

3. Приготовление сред выживания. Инкубационный период от момента постановки реакции иммобилизации бледных трепонем до регистрации ее результатов длится 18-20 часов. Поэтому, для сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности бледных трепонем необходима элективная среда выживания. Рекомендуются следующие среды выживания:

а) Среда выживания с 5% содержанием человеческого альбумина. Готовят 0,2% раствор пищевой желатины на 0,83% растворе хлористого натрия и стерилизуют его при 110 град. С в течение 10 минут. После автоклавирования добавляют стрептомицин из расчета 1:10000 для предотвращения прорастания среды выживания посторонними микробами. Раствор сухого человеческого альбумина готовят на 0,83% растворе хлористого натрия - 5 г сухого альбумина на 100 мл солевого раствора - и стерилизуют его фильтрованием через бактериальный фильтр Л3. Каждую новую серию сухого человеческого альбумина перед употреблением испытывают параллельно с предыдущей апробированной серией. Инактивированная стерильная сыворотка здорового кролика - донора входит в среду выживания в соотношении 1:2 с 0,83% раствором хлористого натрия. Весь запас перечисленных ингредиентов среды выживания хранят в холодильнике и непосредственно перед опытом смешивают в определенных соотношениях в общем объеме, необходимом для данного рабочего дня. При хранении ингредиентов рН среды, равный обычно 7,2-7,4, может меняться; поэтому в среду выживания, с целью ее подщелачивания, после объединения всех компонентов необходимо добавлять 1-2 капли стерильного 1% раствора двууглекислого натрия.

б) Безальбуминовая среда выживания N 2. 50 г говяжьего мяса освобождают от жира и сухожилий, измельчают, заливают 100 мл водопроводной воды и помещают в холодильник для экстрагирования на 24 часа. На другой день измельченное мясо при помешивании доводят до кипения. После охлаждения мясную воду фильтруют через многослойный бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4 путем добавления нескольких капель 20% раствора едкого натра. После приготовления среду выживания N 2 стерилизуют и ампулируют. При условии сохранения стерильности среда выживания N 2 пригодная для использования в реакции в течение 12 месяцев. Ампулы со средой N 2 хранят в холодильнике.

4. Комплемент. Реакция иммобилизации бледных трепонем протекает только при условии избытка комплемента. При пользовании одной и той же средой выживания установлено, что чем больше взято комплемента, тем большее количество иммобилизированных трепонем в положительных сыворотках; чем меньше его количество, тем больше бледных трепонем остается подвижными при наличии в испытуемой сыворотке крови специфических иммобилизинов. Количество комплемента в значительной степени зависит от среды выживания. При пользовании средой, содержащей 5% человеческий альбумин, количество комплемента должно составлять 35% от общего объема реагирующей смеси. При пользовании средой выживания N 2 комплемент составляет 40% по отношению к общему объему.

5. Приготовление антигена. В качестве антигена в реакции иммобилизации бледных трепонем применяют взвесь бледных трепонем из раннего орхита кролика, зараженного кроличьим сифилисом штамма Никольса или Будапештского штамма. Для заражения следует брать здоровых кроликов-самцов весом 2,5-3 кг с отрицательными стандартными серологическими реакциями на сифилис. Для получения раннего сифилитического орхита заражение кролика производят введением внутрь яичек взвеси бледных трепонем в количестве не менее 50-60 микроорганизмов в каждом поле зрения в объеме 0,5-1,0 мл в каждое яичко. Предварительно на лобке животного и на внутренних поверхностях бедер выстригают шерсть, а с кожи мошонки выщипывают пушковые волосы. Введение кортизона зараженным кроликам не является строго обязательным, так как при хорошо отработанной методике ранние орхиты у кроликов могут развиваться и без воздействия кортикостероидных препаратов. Однако при ослаблении штамма в процессе перевивки (уменьшение количества бледных трепонем) нужно непосредственно после заражения ввести кролику внутримышечно 20 мг гидрокортизона и в последующие 5 дней - по 10 мг. Для приготовления антигена пользуются 7-9-дневными орхитами. В это время клинических проявлений в месте заражения, кроме небольшой пастозности, не имеется. Для удаления яичек кролика привязывают к специальному станку, обескровливают пункцией сердца, затем забивают воздушной эмболией - введением 10-20 мл воздуха в краевую вену уха или, не вынимая иглы из сердца, непосредственно после обескровливания кролика, впускают в сердце воздух. Яички выводят через паховой канал в мошонку поглаживанием по животу сверху вниз. Далее поверхность кожи мошонки покрывают резиновой стерильной салфеткой с разрезом, через который выводят яичко наружу и протирают ее поверхность тампоном, смоченным эфиром. Яичко оператор фиксирует левой рукой, скальпелем или ножницами делает небольшой поперечный разрез кожи мошонки над яичком и яичко вместе с оболочками выводит из мошонки через разрез, отрезает ножницами и помещает в стерильную чашку Петри. Такого же рода манипуляцию проделывают и с яичком другой стороны мошонки. Далее, в условиях бокса ножницами удаляют придаток, освобождают яичко от оболочек и жира и разрезают его на 10-15 частей. Все кусочки помещают в небольшой стерильный флакон или колбу (емкостью 50-75 мл), в которую предварительно наливают среду выживания из расчета 5 мл на каждое яичко. Готовят препарат, и под микроскопом определяют наличие и количество бледных трепонем, чтобы определить длительность встряхивания. При 5-15 бледных трепонемах в одном поле зрения рекомендуется встряхивать взвесь 20-30 минут, при 20-40 бледных трепонемах - 10-15 минут, при 60-100 бледных трепонемах - 5 минут. После встряхивания содержимое колбы выливают в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин 5 минут для осаждения плотных кусочков тканей яичка и эритроцитов. После этого надосадочную жидкость сливают в чистую стеклянную пробирку, готовят препараты для микроскопирования и определяют количество бледных трепонем в поле зрения (окуляр 10х, объектив 40х). Антиген для реакции иммобилизации бледных трепонем представляет собой взвесь бледных трепонем в среде выживания с количеством микроорганизмов - 10-15 в каждом поле зрения. Это достигается добавлением в нужный объем среды выживания небольших порций полученной взвеси бледных трепонем (при 100-150 микроорганизмах в каждом поле зрения примерно 0,1-0,015 мл взвеси на каждые 10 мл среды выживания). При каждой постановке реакции следует одновременно производить заражение кролика для обеспечения следующего опыта ранним орхитом, так как обязательным условием получения ранних орхитов является регулярная перевивка штамма кроличьего сифилиса. Для этой цели используют взвесь бледных трепонем, оставшуюся после приготовления антигена. Зараженных кроликов содержать в отдельных клетках в светлом, проветриваемом помещении с температурой 18-20 град. С. Пища их должна быть полноценной, содержать достаточное количество витаминов, особенно моркови. Не следует прибегать к пункции яичек для определения в них бледных трепонем прежде чем взять кролика в опыт, так как эта процедура нарушает нормальное развитие орхита.

Основной опыт. Каждую испытуемую сыворотку (инактивированную) исследуют в двух пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,05 мл. В обе пробирки приливают по 0,35 мл антигена. Комплемент, активный, в дозе 0,15 мл приливают в первую пробирку; комплемент, инактивированный в водяной бане, в дозе 0,15 мл - во вторую пробирку. После легкого встряхивания пробирки помещают в микроанаэростат, из которого вакуумным насосом откачивают атмосферный воздух. Затем микроанаэростат заполняют газовой смесью из баллона - 95 частей азота и 5 частей углекислого газа. При заполнении микроанаэростатов не следует заполнять их газом полностью, до нулевого деления в манометре, так как при помещении их в термостат с температурой 35 град. С объем газов будет больше, чем при комнатной температуре.

Ко всему опыту ставят пять контролей. В двух пробирках - контроль заведомо положительной сыворотки из предыдущего опыта; в двух пробирках - контроль заведомо отрицательной сыворотки из предыдущего опыта; в одной пробирке - контроль активного комплемента; в одной пробирке - контроль инактивированного комплемента; в одной пробирке - контроль антигена.

Пробирки, пипетки и другая лабораторная посуда, используемая для постановки реакции иммобилизации бледных трепонем, должна быть вымыта без применения дезинфицирующих средств последовательно холодной, горячей и дистиллированной водой, высушена, замонтирована и простерилизована автоклавированием. Разлив ингредиентов производят в боксе, предварительно облученном кварцевой лампой в течение 45-60 минут. Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат на 18-20 часов (см. табл. 16).

 

Таблица 16

 

СХЕМА РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ

(МИКРОАНАЭРОСТАТНАЯ МЕТОДИКА)

 

   ┌────────────────────┬────────────────────────────────────────┐

   │                    │                NN пробирок             │

   │                    ├─────────────┬──────────────────────────┤

   │ Ингредиенты (в мл) │     опыт    │   контроли ингредиентов  │

   │                    ├─────┬───────┼─────┬────┬─────┬────┬────┤

   │                    │  1  │   2   │  1  │ 2  │ 3   │ 4  │ 5  │

   │                    │     │ контр.│     │    │     │    │    │

   ├────────────────────┼─────┼───────┼─────┼────┼─────┼────┼────┤

   │Испытуемая инактиви-│0,05 │ 0,05  │ -   │ -  │ -   │ -  │ -  │

   │рованная  сыворотка │     │       │     │    │     │    │    │

   │Комплемент активный │0,15 │  -    │0,15 │ -  │0,15 │ -  │ -  │

   │Комплемент инактиви-│ -   │ 0,15  │ -   │0,15│ -   │0,15│ -  │

   │рованный            │     │       │     │    │     │    │    │

   │Антиген             │0,35 │ 0,35  │0,35 │0,35│0,35 │0,35│0,35│

   │Положительная инак- │  -  │  -    │0,05 │0,05│ -   │ -  │ -  │

   │тивированная  сыво- │     │       │     │    │     │    │    │

   │ротка               │     │       │     │    │     │    │    │

   │Отрицательная инак- │  -  │  -    │ -   │ -  │0,05 │0,05│ -  │

   │тивированная  сыво- │     │       │     │    │     │    │    │

   │ротка               │     │       │     │    │     │    │    │

   ├────────────────────┴─────┴───────┴─────┴────┴─────┴────┴────┤

   │     Встряхнуть, поставить в термостат на 18-20 часов        │

   └─────────────────────────────────────────────────────────────┘

 

Оценка результатов. Через 18-20 часов пробирки вынимают из микроанаэростата попарно-опытную и контрольную - и производят подсчет подвижных и неподвижных бледных трепонем. Для этого пастеровской пипеткой наносят каплю жидкости из опытной пробирки на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону наносят каплю жидкости из контрольной пробирки одной и той же испытуемой сыворотки. Предварительно посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровным стеклом 20х20 мм. Капли не должны быть большими, иначе "трепонемы текут", и тогда суждение об их подвижности и подсчет затруднительны. Учет результатов реакции состоит в определении процента подвижных и неподвижных бледных трепонем сначала в препарате из контрольной, затем из опытной пробирки. Для этого подсчитывают 25-50 бледных трепонем и отмечают, какое количество из них подвижные, и какое - неподвижные. Если в контроле содержится меньше 17 подвижных бледных трепонем из 25 подсчитанных, то такой опыт непригоден, и исследование данной сыворотки следует повторить. В контрольных пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижных бледных трепонем объясняется не присутствием специфических иммобилизинов, а токсичностью испытуемой сыворотки крови или недостаточно высоким качеством среды выживания (загрязнение бактериями, примесь медикаментов и т.д.). При определении подвижности бледных трепонем нужно быть весьма внимательным, так как движение бледных трепонем по интенсивности бывает различным. Они могут обладать активной подвижностью с отчетливыми сгибательными движениями, иногда же отмечаются только винтообразные движения. Подсчет производят медленно, так как у видимо неподвижных бледных трепонем могут появиться активные движения. Следует также отличать активные движения бледных трепонем от движения с током жидкости.

Расчет специфической иммобилизации бледных трепонем производят по следующей формуле:

 

       подвижные бледные         подвижные бледные

       трепонемы в контроле  -  трепонемы в опыте

  Х =  -----------------------------------------  х 100

        подвижные бледные трепонемы в контроле

 

    Пример:

                          24 - 21

                    Х =  --------- х 100 = 12%

                            24

 

При практической работе процент специфической иммобилизации можно определять по специальной, высчитанной заранее, таблице (см. табл. 17).

Реакция иммобилизации бледных трепонем считается положительной, когда процент иммобилизированных бледных трепонем бывает 50 и выше; слабо положительной - от 31 до 50%; сомнительной - от 21 до 30%; отрицательной - от 20% и ниже. Сыворотки крови с сомнительными или слабо положительными результатами необходимо исследовать повторно для получения более четких и достоверных результатов. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки крови, показавшие полное расхождение результатов реакции иммобилизации бледных трепонем и стандартных серологических реакций. Эти сыворотки заслуживают особого внимания, так как в этих случаях результаты реакции иммобилизации бледных трепонем дают возможность судить о наличии или отсутствии сифилиса у обследуемого лица.

Определение остаточного комплемента. После регистрации результатов иммобилизации бледных трепонем в содержимом пробирок определяют остаточный комплемент добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в объеме 0,1 мл. Гемолитическая система состоит из равных частей (объемов) 1% взвеси эритроцитов барана с плотного осадка и гемолитической сыворотки по утроенному титру. При правильно прошедшем опыте в контрольных пробирках с инактивированным комплементом гемолиз должен отсутствовать. В опытных пробирках с активным комплементом гемолиз должен быть полным, или его задержка не должна превышать один плюс. Определение остаточного комплемента необходимо для суждения о том, достаточным ли было количество комплемента, не была ли подвижность бледных трепонем обусловлена тем, что количество его было недостаточным, и специфические иммобилизины не могли проявить свою иммобилизирующую активность.

Источники ошибок.

1. Токсичность испытуемой сыворотки.

2. Бактериальное загрязнение испытуемой сыворотки.

3. Недостаточное количество комплемента в опыте.

4. Нарушение герметичности микроанаэростата с последующим проникновением в него кислорода атмосферного воздуха.

5. Повышение температуры в термостате (выше 35 град. С) в течение реакции.

6. Кислотность или щелочность лабораторной посуды, применяемой для постановки реакции.

 

Таблица 17