МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

 

ПРИКАЗ

 

13 марта 1975 г.

 

N 250

 

ОБ УНИФИКАЦИИ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ

 

Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам является необходимым для рациональной терапии больных, оценки эффективности новых лекарственных препаратов, а также при эпидемиологических исследованиях.

Точные и быстрые лабораторные методы определения чувствительности возбудителей заболеваний к химиотерапевтическим препаратам приобретают особое значение в связи с широким распространением устойчивых, в том числе полирезистентных, к лекарственным препаратам штаммов микроорганизмов и снижением эффективности химиотерапии.

В целях дальнейшего улучшения организации лабораторного обследования и рациональной химиотерапии больных:

I. Утверждаю:

I. Перечень унифицированных методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам (приложение 1).

2. Методические указания по применению унифицированных методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам (приложение 2).

II. Приказываю:

I. Министрам здравоохранения союзных республик:

а) организовать, начиная с 1975 г., проведение лабораторных исследований по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и некоторым другим химиотерапевтическим препаратам в бактериологических лабораториях по утвержденным унифицированным методам;

б) обеспечить обучение врачей-лаборантов на местных базах применению унифицированных методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам.

2. Главному аптечному управлению Минздрава СССР (тов. Клюев М.А.), Главному управлению лечебно-профилактической помощи Минздрава СССР (тов. Сягаев С.А.), Главному санитарно-эпидемиологическому управлению Минздрава СССР (тов. Ковшило В.Е.), Главному управлению лечебно-профилактической помощи детям и матерям Минздрава СССР (тов. Никитина М.Н.) с привлечением соответствующих научно-исследовательских учреждений изучить вопрос об организации снабжения лабораторий через аптечную сеть стандартными диагностическими дисками с химиотерапевтическими препаратами и чистыми химиотерапевтическими препаратами. Представить необходимые предложения во втором квартале 1975 года.

3. Главному управлению по производству бактерийных и вирусных препаратов Минздрава СССР (тов. Христов Л.Н.) и Главному управлению лечебно-профилактической помощи Минздрава СССР (тов. Сягаев С.А.) рассмотреть вопрос о создании специальных сухих стандартных питательных сред и основ для определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам с помощью стандартных диагностических дисков.

4. Управлению по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники (тов. Бабаян Э.А.):

а) принимать для рассмотрения материалы о клиническом изучении новых химиотерапевтических препаратов только в том случае, если одновременно разработаны соответствующие диагностические диски;

б) одновременно с рассмотрением инструкции по клиническому изучению и медицинскому применению новых химиотерапевтических препаратов рассматривать метод определения чувствительности возбудителей к этому препарату и методические указания по его применению;

в) подготовить предложения об организации выпуска стандартных диагностических дисков с химиотерапевтическими препаратами, для которых такие диски еще не разработаны, и передать эти предложения в Министерство медицинской промышленности СССР.

5. Главному управлению учебных заведений Минздрава СССР (тов. Исаков Ю.Ф.) внести изменения в программы усовершенствования врачей с учетом применения унифицированных методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам.

Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на начальника Главного управления лечебно-профилактической помощи Минздрава СССР тов. Сягаева С.А., начальника Главного санитарно-эпидемиологического управления Минздрава СССР тов. Ковшило В.Е., начальника Главного управления лечебно-профилактической помощи детям и матерям Минздрава СССР тов. Никитину М.Н. и начальника Управления по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники Минздрава СССР тов. Бабаяна Э.А.

 

Министр

здравоохранения СССР

Б.В.ПЕТРОВСКИЙ

 

 

 

 

 

Приложение N 1

к приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 13 марта 1975 г. N 250

 

ПЕРЕЧЕНЬ

УНИФИЦИРОВАННЫХ МЕТОДОВ

 

1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к

химиотерапевтическим препаратам

 

1.1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков.

1.1.2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом разведений в бульоне.

1.1.3. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом разведений в питательном агаре.

1.1.4. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам ускоренным методом с химическим RH2-индикатором трифенилтетразолхлоридом (ТТС).

1.1.5. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам ускоренным методом с биологическим RH2-индикатором гемоглобином крови.

1.1.6. Определение чувствительности микроорганизмов к сульфамидам методом разведений в жидких средах.

1.1.7. Определение чувствительности микроорганизмов к сульфамидам методом разведений в плотных средах.

1.1.8. Определение чувствительности микроорганизмов к нитрофурановым препаратам методом разведений в жидких средах.

1.1.9. Определение чувствительности микроорганизмов к неграму методом разведений в жидких средах.

1.1.10. Определение чувствительности микроорганизмов к энтеросептолу методом разведений в жидких средах.

1.1.11. Определение чувствительности микроорганизмов к 5-НОК методом разведений в жидких средах.

 

 

 

 

 

Приложение N 2

к приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 13 марта 1975 г. N 250

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ПРИМЕНЕНИЮ УНИФИЦИРОВАННЫХ МЕТОДОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К

ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ

 

Работа по унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и некоторым другим лекарственным препаратам проведена Комиссией, созданной приказом по Министерству здравоохранения СССР N 249 от 30 марта 1972 г., в составе:

    1. Меньшиков В.В.   - руководитель      Всесоюзного    научно-

                          методического  центра  по  лабораторному

                          делу, профессор, председатель комиссии;

 

    2. Покровский В.И.  - директор       Центрального      научно-

                          исследовательского             института

                          эпидемиологии     МЗ     СССР,     член-

                          корреспондент АМН СССР;

 

    3. Ведьмина Е.А.    - профессор кафедры микробиологии ЦОЛИУВ;

 

    4. Маршак  А.М.     - заведующая  лабораторией  по   апробации

                          новых антибиотиков АМН СССР, профессор;

 

    5. Шорин   В.А.     - заведующий      отделом     химиотерапии

                          Института     по     изысканию     новых

                          антибиотиков АМН СССР, профессор;

 

    6. Черномордик А.Б. - заведующий   лабораторией   антибиотиков

                          Киевского     института     инфекционных

                          болезней, профессор;

 

    7. Замотаев И.П.    - заведующий  кафедрой  II терапии ЦОЛИУВ,

                          профессор.

 

Ученый секретарь комиссии Москвитина М.Г., сотрудник Всесоюзного научно-методического центра по лабораторному делу.

Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и некоторым другим лекарственным препаратам разработаны коллективом авторов в составе:

 

    З.В.Ермольева    - ЦОЛИУВ, академик АМН СССР;

    Е.А.Ведьмина     - ЦОЛИУВ, профессор;

    И.В.Власова      - ЦОЛИУВ, канд.биол.наук;

    С.Д.Воропаева    - ВНИИ акушерства и гинекологии МЗ СССР,

                       д.м.н.;

    А.З.Смолянская   - Ин-т   экспериментальной   и    клинической

                       онкологии АМН СССР, д.м.н.;

    А.Б.Черномордик  - Киевский институт инфекционных болезней,

                       профессор.

 

В рецензировании и обсуждении методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и некоторым другим лекарственным препаратам принимали участие сотрудники следующих учреждений:

Лаборатории экспериментальной иммунобиологии АМН СССР,

Центрального научно-исследовательского ин-та травматологии и ортопедии им. Н.Н.Приорова МЗ СССР,

Кафедры инфекционных болезней I-го ММИ им. И.М.Сеченова,

Кафедры микробиологии ЦОЛИУ вачей,

Всесоюзного научно-исследовательского ин-та акушерства и гинекологии МЗ СССР,

Всесоюзного центра по эшерихиям Московского научно-исследовательского ин-та вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова,

Лабораторного Совета при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении МЗ СССР,

Московской областной санитарно-эпидемиологической станции,

Московской городской санитарно-эпидемиологической станции,

Санитарно-эпидемиологической станции Красногвардейского района Москвы,

Ин-та нейрохирургии им. Н.Н.Бурденко,

Ленинградского ин-та усовершенствования врачей,

Всесоюзного научно-исследовательского ин-та антибиотиков,

Ин-та эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи,

Всесоюзного научно-исследовательского химико-фармацевтического ин-та им. Орджоникидзе ММП СССР,

Ленинградского научно-исследовательского ин-та антибиотиков

Ин-та экспериментальной и клинической онкологии АМН СССР,

Волгоградского медицинского ин-та.

 

1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

1.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К

ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ

 

Критерии чувствительности микроорганизмов к

химиотерапевтическим препаратам

 

Успех химиотерапии во многом зависит от правильного выбора соответствующего лечебного препарата, для чего крайне важно располагать сведениями о чувствительности возбудителя болезни к избираемому для лечения препарату.

В клинической практике чувствительными к препарату считаются те микроорганизмы, на которые препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. В соответствии с этим критерии чувствительности микроорганизмов зависят от концентрации лечебного препарата в очаге инфекции, величины максимальной терапевтической дозы препарата, его фармакокинетики и токсичности.

Мерой чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам при постановке лабораторного теста является минимальная концентрация препарата, ингибирующая рост возбудителя заболевания при стандартных условиях постановки опыта. Деление микроорганизмов на устойчивые и чувствительные производится на основании соотношения минимальной ингибирующей рост микроба концентрации препарата, определенной в лабораторных условиях, концентрации этого же препарата, создаваемой в очаге инфекции при введении терапевтических доз. При соотношении

 

МИК(минимальная ингибирующая концентрация препарата)

---------------------------------------------------- < 1

    К (концентрация препарата в очаге инфекции)

 

можно говорить о чувствительности микроорганизма к данному химиотерапевтическому препарату.

Для клинической практики целесообразно делить микроорганизмы по степени чувствительности к химиотерапевтическим препаратам условно на 4 группы:

1-я группа - "чувствительных" микроорганизмов, когда обычно применяемые дозы препарата являются достаточными для достижения лечебного эффекта при общих заболеваниях;

2-я группа - "средне чувствительных" микроорганизмов, когда только повышенные дозы препарата могут обеспечить лечебный эффект при общих заболеваниях;

3-я группа - "умеренно устойчивых" микроорганизмов, когда лечебный эффект может быть достигнут только при локализации инфекционного очага в месте, где препарат концентрируется, или если препарат может быть введен непосредственно в очаг инфекции;

4-я группа - "устойчивых" микроорганизмов, когда нельзя рассчитывать на лечебный эффект.

Особенно важно определять чувствительность возбудителя заболевания к химиотерапевтическим препаратам:

- при процессах, вызванных микроорганизмами часто устойчивыми к лечебным препаратам;

- при затяжных инфекциях, когда сопротивляемость макроорганизма нарушена и выбор наиболее активного препарата играет особо важную роль;

- при применении препаратов, к которым во время лечения быстро развивается устойчивость (стрептомицин, рифампицин и некоторые другие.

В настоящее время предложены критерии чувствительности микроорганизмов только для некоторых антибиотиков (табл.1). Для других химиотерапевтических препаратов критерии чувствительности разрабатываются.

 

Таблица 1

 

Классификация микроорганизмов

по степени чувствительности к антибиотикам

(МИК в мкг/мл или ед/мл)

 

Антибиотики	Группы микроорганизмов
	I     чувствит.	II      средн.чувст.	III    умер.устойч.	IV     устойч.
Пенициллин G	0,25	16	128	128
Пенициллин V	0,25	4	128	128
Метициллин+)	2	x	x	x
Ампициллин+)	0,25	16	128	128
Карбенициллин	x	16	128	128
Цефалоспорины	2	16	128	128
Стрептомицин+)	4	x	128	128
Канамицин+)	4	x	128	128
Неомицин+)	4	x	128	128
Гентамицин	0,5	4	64	64
Левомицетин+)	1	8	x	x
Препараты тет- рациклинового ряда	1	4	64	64
Эритромицин	1	4	64	64
Линкомицин+)	1	4	64	64

 

Примечания: +) - критерии чувствительности относятся ко всем лекарственным формам указанного антибиотика.

x - группа не установлена.

 

Взятие материала для выделения возбудителя

заболевания и определения его чувствительности к

лекарственным препаратам

 

Важным условием соответствия результатов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам и клинической эффективности последних является исследование чувствительности чистых культур истинных возбудителей инфекции, а не сопутствующей им микрофлоры. Поэтому при взятии материала для исследования следует соблюдать следующие правила:

1. Материал должен быть получен до начала антибактериальной терапии или через такой период после введения антибактериального препарата, который необходим для его элиминации из организма больного.

2. Материал для посева при определении чувствительности следует брать непосредственно из очага инфекции с соблюдением правил асептики (стерильными инструментами, в стерильную посуду и т.д.).

3. В тех случаях, когда взятие материала непосредственно из очага инфекции невозможно, но он сообщается с внешней средой, можно производить исследование соответствующего отделяемого: мочи при пиелонефрите, мокроты при воспалительных процессах в легких, отделяемого цервикального канала при сальпингоофоритах и т.д. Перед сбором материала для посева следует провести предварительную обработку антисептическими растворами доступных для этого полостей или поверхностей человеческого организма, по которым проходит исследуемый материал.

Например, при сборе мокроты больной должен утром до еды почистить зубы, прополоскать рот слабым раствором антисептика и затем откашлять мокроту в стерильную карманную плевательницу или прокипяченную баночку с крышкой. При этом больному надо объяснить, что он не должен собирать носоглоточную слизь и слюну, а должен стараться собрать только отделяемое дыхательных путей. Если мокрота отделяется плохо, больному следует накануне назначить отхаркивающее.

Мочу для посева после тщательного туалета наружных половых органов 0,5% раствором марганцевокислого калия берут стерильно катетером или получают ее при естественном мочеиспускании, отбросив первую небольшую порцию ("первую струю").

4. Посев материала, взятого у больного, производят на соответствующий набор питательных сред, необходимых для выделения чистых культур различных видов микроорганизмов. В смешанной культуре производить определение чувствительности к антибактериальным препаратам не следует, так как скорость роста различных микроорганизмов, присутствующих в ассоциациях, неодинакова и при подобном методе исследования определяется чувствительность к антибактериальным препаратам наиболее быстро растущих видов, не всегда являющихся возбудителями заболеваний. Кроме того, при определении чувствительности бактерий в смешанных культурах можно получить ложные результаты за счет микробного антагонизма, когда рост одной культуры может быть подавлен не антибактериальным действием препарата, а вследствие антагонистического влияния другой культуры.

5. Если в исследуемом материале находится несколько видов условнопатогенных микроорганизмов, необходимо выяснить, какой из них является ведущим в данном патологическом процессе.

Ориентировочные данные можно получить при использовании метода количественного учета обсемененности материала, например, определение степени бактериурии при пиелонефритах - преобладание в моче одного вида микроорганизмов может свидетельствовать о его этиологической роли в данном процессе.

С этой же целью проводится бактериоскопическое исследование материала, нацеливающее бактериолога на определенную флору, которую он должен будет получать, применяя селективные и элективные среды. Например, в мокроте больного пневмонией при бактериоскопии обнаружены в большом количестве пневмококки и в значительно меньшем - стрептококки и стафилококки. При первичном посеве мокроты пневмококки могут не вырасти совсем или вырасти в относительно небольшом количестве. Однако, бактериолог, ориентированный по мазку из посевного материала, приложит усилия для выделения и определения чувствительности к антибактериальным препаратам именно пневмококков.

6. Если выяснение истинного возбудителя не удается, или патологический процесс вызван микробной ассоциацией, исследуется раздельно чувствительность к антибактериальным препаратам всех членов ассоциации, выделенных в чистой культуре.

7. В некоторых случаях, например, при раневой гнойной инфекции или термических осложненных ожогах, когда процесс вызывается ассоциацией микроорганизмов, практикуется определение чувствительности сразу всей ассоциации. Однако, эти данные надо рассматривать как сугубо ориентировочные, которые необходимо дополнить исследованием чувствительности раздельно у каждого из членов ассоциации.

8. В отдельных случаях определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам может проводиться при первичном посеве материала на питательные среды. Это возможно тогда, когда возбудитель находится в исследуемом материале в чистой культуре и в достаточно большом количестве (например, в гное из закрытых гнойных очагов).

 

Выбор методов определения чувствительности

микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

 

Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам в настоящее время может проводиться методом диффузии в агар с применением бумажных дисков или методом разведений, представленным двумя модификациями - метод разведений в плотной питательной среде и метод разведений в жидкой питательной среде. Применяются также и ускоренные методы определения чувствительности, среди которых есть как методы диффузии, так и методы разведений.

Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории, выполняющей исследования.

Метод диффузии в агар с применением дисков следует расценивать как метод качественный. Благодаря простоте, скорости и легкости исполнения он является основным при определении чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам практическими лабораториями.

Метод разведений - наиболее точный количественный метод. Он должен применяться в научно-исследовательской работе, при проведении международных исследований, а также в особенно важных случаях в лабораториях областных, краевых и республиканских санэпидстанций и в некоторых лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

Методом разведений в плотной питательной среде рациональнее пользоваться при необходимости исследовать одновременно большое количество культур, так как на чашку с плотной средой можно посеять одновременно несколько штаммов. Необходимо отметить также большую точность метода разведений в плотной среде, при котором определяется чувствительность к препарату большинства вариантов микробной популяции, в то время как при использовании жидкой среды определяется чувствительность наиболее устойчивых вариантов.

Ускоренные методы служат дополнением к основным вышеназванным методам.

Определение чувствительности микроорганизмов к сульфамидам затруднено тем, что большинство питательных сред, применяемых для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, для этих препаратов не годится: эти среды содержат значительное количество метаболитов, которые являются антагонистами сульфамидов (РАВА, фолиевая кислота и т.п.). Поэтому определение чувствительности микробов к сульфамидам производят методом разведений на специальных средах. Для определения чувствительности к сульфамидам энтеробактерий рекомендуется среда Биргера и Зац, а бактерий кокковой группы - среда Ланди, которые могут применяться как жидкими, так и агаризированными. В связи с существованием перекрестной устойчивости микроорганизмов к большинству сульфамидов при определении чувствительности возбудителей к этим препаратам достаточно проверить чувствительность к одному какому-либо сульфамиду - например, норсульфазолу.

Для облегчения сравнения полученных результатов и их правильной оценки необходимо при определении чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам любым методом обеспечить наиболее стандартные условия постановки опыта.

 

1.1.1. Определение чувствительности микроорганизмов

к антибиотикам методом диффузии в агар с применением

бумажных дисков

 

Принцип. На поверхность питательного агара в чашках Петри, засеянного испытуемыми микробами, наносят бумажные диски, пропитанные антибиотиками, и чашки инкубируют при 37 град. С. Наличие зоны задержки роста микробов вокруг дисков свидетельствует о чувствительности возбудителя к препарату, отсутствие зоны задержки роста - об устойчивости.

Компоненты.

1. Диски. Для исследования могут быть использованы только стандартные заводские диски. Во флаконах с дисками, пропитанными нестойкими к влаге антибиотиками, находится силикагель, который является хорошим влагоуловителем и показателем влажности во флаконе (при увлажнении силикагель меняет свою окраску с синей на розовую). Диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в коричневый или розовый цвет, не используются. Диски хранят в сухом темном месте при температуре не выше 20 град. С. После вскрытия флакона дисками можно пользоваться не более месяца.

2. Питательные среды.

а) Среда на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота, 1-2% агара, pH 7,2-7,4.

б) Казеиново-дрожжевая среда с таким же содержанием аминного азота и агара и значением pH.

в) Мясо-пептонная среда с таким же содержанием агара и pH.

В случае необходимости в среду может быть добавлено 5% крови или сыворотки, что отрицательного влияния на результаты анализа не оказывает.

 

Ход определения. В стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности, наливают по 20 мл расплавленного питательного агара. Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог легко всасываться. В качестве посевного материала может быть использована суточная бульонная культура (при интенсивном росте допускается использование 4-5-часовой культуры, при медленном росте - 2-3-суточной культуры) или 1-млрд-суспензии, приготовленной с агаровой культуры. 1мл бактериальной взвеси наносится на поверхность агара и равномерно распределяется путем покачивания чашки с последующим отсасыванием избытка жидкости пипеткой.

В тех случаях, когда допускается постановка теста с испытуемым материалом (гной, раневое отделяемое и др.), последний наносят на поверхность питательного агара и равномерно растирают по поверхности среды стерильным шпателем. Одновременно исследуемый материал засевают для выделения чистой культуры и последующей постановки теста с чистой культурой. При монокультуре исследование можно не повторять.

Чашки подсушивают в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянной среды пинцетом накладывают диски, пропитанные различными антибиотиками. В каждой чашке может быть испытано действие нескольких антибиотиков (до 5-6). Диски накладывают на поверхность агара плотно для тесного контакта со средой, следя за тем, чтобы не были положены 2 сцепленных между собой диска. Диски размещают на равном расстоянии один от другого и примерно на 2 см от края чашки. Чашки ставят в термостат перевернутыми кверху дном или вкладывают под крышку чашки кружок фильтровальной бумаги, чтобы избежать размывания газона конденсационной водой, и инкубируют при 37 град. С в течение 18-ти часов. Если исследуемый вид микроорганизмов растет медленно, инкубацию продлевают до 48-72 часов или более, в зависимости от появления роста в контроле.

Оценка результатов. С помощью линейки или измерителя и миллиметровой бумаги определяют диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Единичные колонии или тонкая пленка роста микроорганизмов внутри зоны задержки роста не учитывают. Отсутствие зон задержки роста микробов вокруг дисков указывает на отсутствие чувствительности микроба к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мм штамм расценивается как мало чувствительный. Зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибиотику. В ответе должно быть написано, какой чувствительностью обладает исследуемая культура, а не размер зоны задержки роста.

 

1.1.2. Определение чувствительности микроорганизмов

к антибиотикам методом разведения в бульоне

 

Принцип. Готовят серию разведений антибиотиков в питательной среде и вносят в каждое разведение антибиотика исследуемую культуру. После определенного периода инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Метод позволяет определить минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост изучаемого микроба.

Компоненты.

1. Питательные среды: мясо-пептонный бульон или бульон на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота, pH 7,2-7,4. Если исследуемые микроорганизмы не растут на простых средах, допускается использование специальных сред, например, бульона Мартена для дифтерийных микробов, жидкой среды Сабуро для грибков и т.д.

2. Основные растворы антибиотиков. Порошок антибиотика (желательно стандарта антибиотика) взвешивают и растворяют в стерильной дистиллированной воде так, чтобы получить определенную концентрацию антибиотика. Удобной концентрацией для основного раствора является 2000 мкг/мл или ед/мл. Некоторые антибиотики не растворяются водой в такой концентрации, для них нужен специальный растворитель. Например, эритромицин и левомицетин растворяют в минимальном количестве этилового спирта, а затем разводят стерильной дистиллированной водой. Основные растворы антибиотиков стабильны при хранении в холодильнике в течение 1 недели.

Подготовка к определению. Приготовление разведений антибиотиков. Разведения антибиотиков готовят путем разведения основного раствора антибиотика бульоном согласно представленной схеме (табл. 2). Диапазон серии разведений зависит от установленных критериев чувствительности, она может быть начата и закончена на различных этапах. Пользуются отдельной пипеткой для приготовления основного раствора и его добавления к 1-й пробирке, затем отдельной пипеткой для каждой группы разведений: 2-3-4 пробирки, 5-6-7 пробирки и т.д. Полученные растворы антибиотиков разливают в стерильные пробирки по 1мл. Для этого может быть использована одна пипетка - сначала разливают растворы более разведенные, затем более концентрированные. Можно готовить и двукратные разведения антибиотиков в бульоне в объеме 1 мл, но обязательно использовав отдельную пипетку для каждого разведения.

Ход определения. Для заражения применяют бульонную культуру в логарифмической или ранней стационарной фазе роста, т.е. для большинства видов микроорганизмов 18-часовую культуру. Для видов микроорганизмов, рост которых замедлен, используют 48-часовую культуру. Можно пользоваться агаровыми культурами. Культуру стандартизуют и разводят бульоном до 10 в 5 степени - 10 в 6 степени м.т./мл. 1 мл такой культуры добавляют к 1 мл каждого разведения антибиотика, при этом антибиотик разводится еще в два раза (таблица 2). После заражения пробирки инкубируют при 37 град. С в течение 16-20 часов или более в зависимости от появления роста в контроле.

Контрольная пробирка содержит 1 мл бульона без антибиотика и 1 мл культуры для каждого испытуемого штамма.

 

Таблица 2

 

Схема приготовления разведений антибиотиков

для метода серийных разведений в бульоне

 

┌───┬─────────────────────────────────────┬────────────┬─────────┐

│NN │Указания для приготовления разведения│Концентрация│Оконча-  │

│п/п│           антибиотиков              │антибиотика │тельная  │

│   │                                     │в полученном│концентр.│

│   │                                     │р-ре в ед/мл│антибио- │

│   │                                     │или мкг/мл  │тика в   │

│   │                                     │            │мкг/ мл  │

│   │                                     │            │или ед/мл│

│   │                                     │            │в смеси 1│

│   │                                     │            │мл р-ра  │

│   │                                     │            │антиб. и │

│   │                                     │            │1 мл ино-│

│   │                                     │            │кулята в │

│   │                                     │            │бульоне  │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 1 │2 мл р-ра с конц.антиб. 2000 мкг/мл  │    256     │ 128     │

│   │или ед/мл + 13,62 мл бульона         │            │         │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 2 │2 мл р-ра с конц.антиб. 256 мкг/мл   │    128     │  64     │

│   │или ед/мл + 2 мл бульона             │            │         │

│ 3 │1 мл  -"- + 3 мл   -"-               │     64     │  32     │

│ 4 │1 мл  -"- + 7 мл   -"-               │     32     │  16     │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 5 │2 мл р-ра с конц.антиб. 32 мкг/мл    │     16     │   8     │

│   │или ед/мл + 2 мл бульона             │            │         │

│ 6 │1 мл  -"- + 3 мл   -"-               │      8     │   4     │

│ 7 │1 мл  -"- + 7 мл   -"-               │      4     │   2     │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 8 │2 мл р-ра с конц.антиб. 4 мкг/мл     │      2     │   1     │

│   │или ед/мл + 2 мл бульона             │            │         │

│ 9 │1 мл  -"- + 3 мл   -"-               │      1     │   0,5   │

│10 │1 мл  -"- + 7 мл   -"-               │      0,5   │   0,25  │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│11 │2 мл р-ра с конц.антиб. 0,5 мкг/мл   │      0,25  │   0,125 │

│   │или ед/мл + 2 мл бульона             │            │         │

│12 │1 мл  -"- + 3 мл   -"-               │      0,125 │   0,063 │

│13 │1 мл  -"- + 7 мл   -"-               │      0,063 │   0,031 │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│14 │2 мл р-ра с конц.антиб. 0,063 мкг/мл │      0,031 │   0,016 │

│   │или ед/мл + 2 мл бульона             │            │         │

└───┴─────────────────────────────────────┴────────────┴─────────┘

 

Оценка результатов. Отмечают последнюю пробирку с полной видимой задержкой роста микробов. Количество антибиотика в этой пробирке является минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к данному антибиотику. В ответе, выдаваемом лабораторией, указывается минимальная ингибирующая концентрация антибиотика.

 

1.1.3. Определение чувствительности микроорганизмов

к антибиотикам методом разведений в питательном агаре

 

Принцип. Тот же, что в методе разведений в бульоне.

Компоненты.

1. Питательные среды : мясо-пептонный агар или агар на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота, 1-2% агара, pH 7,2-7,4. В случае необходимомсти к питательному агару может быть добавлено 5% дефибринированной крови. Перед постановкой опыта необходимое количество питательного агара (из расчета 20-25 мл на одну чашку Петри диаметром 10 см) расплавляют на водяной бане и остужают до 48-50 град. С.

2. Основные растворы антибиотиков. Те же, что в методе разведений в бульоне.

Подготовка к определению. Приготовление разведений антибиотиков. Сначала готовят разведения антибиотиков в стерильной дистиллированной воде согласно представленной схеме (табл.3). Затем берут 1 часть соответствующего разведения антибиотика и 9 частей питательного агара, хорошо перемешивают и выливают в чашку Петри. Дают агару застыть. Можно готовить двукратные разведения антибиотиков, но с обязательным использованием отдельной пипетки для каждого разведения. Чашки Петри, залитые питательным агаром с антибиотиками, можно хранить в холодильнике не более суток.

 

Таблица 3

 

Схема приготовления

для метода серийных разведений в агаре

 

┌───┬─────────────────────────────────────┬────────────┬─────────┐

│NN │Указания для приготовления разведений│Концентрация│Оконча-  │

│п/п│          антибиотиков               │антибиотика │тельная  │

│   │                                     │в полученном│концентр.│

│   │                                     │р-ре в ед/мл│антибио- │

│   │                                     │или мкг/мл  │тика в   │

│   │                                     │            │мкг/мл   │

│   │                                     │            │или ед/мл│

│   │                                     │            │в смеси 1│

│   │                                     │            │мл р-ра  │

│   │                                     │            │антиб. и │

│   │                                     │            │9 мл пит.│

│   │                                     │            │агара    │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 1 │6,4 мл р-ра с конц.антиб. 2000 мкг/мл│   1280     │ 128     │

│   │или ед/мл + 3,6 мл стер.дист.воды    │            │         │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 2 │2 мл р-ра с конц.антиб. 1280 мкг/мл  │    640     │  64     │

│   │или ед/мл + 2 мл стер.дист.воды      │            │         │

│ 3 │1 мл  -"- + 3 мл     -"-             │    320     │  32     │

│ 4 │1 мл  -"- + 7 мл     -"-             │    160     │  16     │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 5 │2 мл р-ра с конц.антиб. 160 мкг/мл   │     80     │   8     │

│   │или ед/мл + 2 мл стер.дист.воды      │            │         │

│ 6 │1 мл  -"- + 3 мл     -"-             │     40     │   4     │

│ 7 │1 мл  -"- + 7 мл     -"-             │     20     │   2     │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│ 8 │2 мл р-ра с конц.антиб. 20 мкг/мл    │     10     │   1     │

│   │или ед/мл + 2 мл стер.дист.воды      │            │         │

│ 9 │1 мл  -"- + 3 мл     -"-             │      5     │   0,5   │

│10 │1 мл  -"- + 7 мл     -"-             │      2,5   │   0,25  │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│11 │2 мл р-ра с конц.антиб. 2,5 мкг/мл   │      1,25  │   0,125 │

│   │или ед/мл + 2 мл стер.дист.воды      │            │         │

│12 │1 мл р-ра -"- + 3 мл    -"-          │      0,63  │   0,063 │

│13 │1 мл   -"-  7 мл     -"-             │      0,31  │   0,031 │

├───┼─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────┤

│14 │2 мл р-ра с конц.антиб. 0,31 мкг/мл  │      0,16  │   0,016 │

│   │или ед/мл + 2 мл стер.дист.воды      │            │         │

└───┴─────────────────────────────────────┴────────────┴─────────┘

 

Ход определения. Для заражения применяют 18-часовую бульонную культуру для большинства видов микроорганизмов, а для медленно растущих микроорганизмов - 48-часовую культуру. Можно пользоваться агаровыми культурами. Культуру стандартизуют и разводят до 10 в 7 степени м.т./мл. Наносят ее на поверхность питательного агара, которая на должна быть влажной, бактериологической петлей (0,001-0,002-мл) или штампом-репликатором. На одну чашку наносят до 20-25 штаммов. Инкубация при 37 град. С в течение 16-20 часов для большинства видов микроорганизмов, для медленно растущих - 48-72 часа или более в зависимости от проявления роста в контроле.

Контроль - агар без антибиотиков.

Оценка результатов. Отмечают последнюю чашку Петри с полной видимой задержкой роста микробов. Количество антибиотика в питательном агаре в этой чашке является минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к данному антибиотику. В ответе, выдаваемом лабораторией, указывается минимальная ингибирующая концентрация антибиотика.

 

1.1.4. Определение чувствительности микроорганизмов

к антибиотикам ускоренным методом с химическим

RH2-индикатором трифенилтетразолхлоридом (ТТС)

 

Принцип. Бесцветная форма окислительно-восстановительного индикатора трифенилтетразолхлорида переходит в ярко-красную форму под действием продуктов жизнедеятельности микробов при их размножении.

Компоненты.

1. Питательные среды:

а) Среда на переваре Хоттингера с содержанием 130-140 мг% аминного азота,1% глюкозы, 1-2% агара, pH 7,3-7,4.

б) Мясо-пептонная среда с тем же содержанием глюкозы и агара и значением pH.

кровь и сыворотку к средам не добавляют.

Среду разливают по 13,5 мл в пробирки.

2. 1% раствор трифенилтетразолхлорида. Готовят на дистиллированной воде pH 7,3-7,4. Правильно приготовленный раствор ТТС бесцветный или бледно-желтый. Раствор стабилен при хранении в холодильнике не более 6-12 часов.

Ход определения. В качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру или суспензию, приготовленную с агаровой культуры. В отдельных случаях допускается постановка теста непосредственно с испытуемым материалом (гноем, раневым отделяемым и др.).

1,5 мл 2-млрд суспензии исследуемой культуры вносят в 13,5 мл расплавленного и охлажденного до 45-50 град. С питательного агара в пробирке (из расчета 200 млн микробных тел на 1 мл среды), тщательно перемешивают и выливают в стерильные чашки Петри диаметром 10 см, расположенные на горизонтальной поверхности. На застывшую поверхность агара накладывают диски с антибиотиками как это описано в методе диффузии в агар с применением дисков. Чашки помещают в термостат, не переворачивая их кверху дном, при 37 град. С на 4-4,5 часа. По истечении срока 1-й инкубации чашки вынимают, поверхность питательного агара обрабатывают индикатором (3-5 мл на каждую чашку) и вновь помещают в термостат на 20-30 минут (2-я инкубация).

Оценка результатов. Участки питательного агара с бактериальным ростом приобретают ярко-красное окрашивание, а зоны подавления роста вокруг дисков с антибиотиками остаются бесцветными. Они измеряются и оцениваются как в методе диффузии в агар с применением дисков.

 

1.1.5. Определение чувствительности микроорганизмов

к антибиотикам ускоренным методом с биологическим

RH2-индикатором гемоглобином крови

 

Принцип. В процессе жизнедеятельности большинство штаммов микроорганизмов создает в питательной среде условия, способствующие переводу гемоглобина в метгемоглобин, что сопровождается изменением цвета крови, добавленной к питательному агару.

Компоненты.

1. Питательная среда на переваре Хоттингера с содержанием 130-140 мг% аминного азота, 1% глюкозы, 1-2% агара, 10% цитратной донорской крови любой группы, pH 7,3-7,4.

2. Та же питательная среда, но без добавления крови. Разливают в пробирки по 9 мл.

Ход определения. Питательную среду в стерильные чашки Петри, установленные горизонтально, заливают в два слоя: нижний слой - 15-20 мл среды N 1 (с добавлением крови), которая обязательно должна быть ярко-красного цвета; верхний слой - среда N 2 (без добавления крови), к которой после расплавления и охлаждения до 45-50 град. С добавляют 1 мл 2-млрд испытуемой культуры микроорганизмов (из расчета 200 млн. м.т./мл) или 1 мл (или меньше) непосредственно исследуемого материала (гной, раневое отделяемое и др.), тщательно перемешивают и выливают в чашку Петри на поверхность питательного агара с кровью.

На застывшую поверхность второго слоя накладывают диски с антибиотиками как это описано в методе диффузии в агар с применением дисков и чашки помещают в термостат при 37 град. С на 5-6 часов.

Оценка результатов. Участки питательного агара с бактериальным ростом становятся из ярко-красных коричнево-бурыми, а зоны подавления роста вокруг дисков с антибиотиками остаются окрашенными в ярко-красный цвет. Они измеряются и оцениваются как в методе диффузии в агар с применением дисков.

 

1.1.6. Определение чувствительности микроорганизмов

к сульфамидам методом разведений в жидких средах

 

Принцип. Готовят разведения одного из растворимых в воде препаратов сульфамидов в жидкой питательной среде, пригодной для исследуемой группы бактерий, и вносят в каждый из приготовленных растворов исследуемую культуру. После определенного периода инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Метод позволяет определить минимальную ингибирующую рост исследуемого штамма микроорганизмов концентрацию сульфамида.

Компоненты.

1. Питательные среды:

а) Среда для энтеробактерий (Биргера и Зац):

    К2НРО4                          - 3,0 г

    NaCl                            - 5,0 г

    (NH4)2SO4                       - 3,0 г

    Желатина                        - 3,0 г

    Глюкоза                         - 2,0 г

    (стерилизуется отдельно)

    Никотиновая кислота             - 10 мг

    Дистиллированная вода           - до 1000 мл

    pH 7,2-7,4 устанавливают 4% NaOH

    б) Среда для бактерий кокковой группы (Ланди):

    Тиогликолят натрия              - 0,1 г

    Триптофан                       - 0,05 г

    Глюкоза                         - 1,0 г или

    Глюкоза ампулированная,

    40% раствор                     - 2,5 мл

    (стерилизуется отдельно)

    Тиамина хлорид или бромид       - 10 мкг

    Рибофлавин                      - 25 мкг

    Пантотенат кальция              - 25 мкг

    Никотиновая кислота             - 25 мкг

    Пиридоксина гидрохлорид         - 40 мкг

    Биотин                          - 0,1 мкг

    2% раствор бакто-триптозы,

    обработанный активированным

    углем, взятым в количестве

    2% от веса раствора             - 100 мл

    K2HPO4                          - 50 мг

    KH2PO4                          - 50 мг

    MgSo4.7H2O                      - 20 мг

    NaCl                            - 1 мг

    FeSo4.7H2O                      - 1 мг

    pH 7,6 после стерилизации.

2. Один из водорастворимых сульфамидных препаратов в порошке (например, норсульфазол).

 

Подготовка к определению. Приготовление разведений сульфамидов. Разведения сульфамидного препарата готовят путем разведения основного раствора препарата стерильной дистиллированной водой согласно представленной схеме (таблица 4). Для получения необходимых концентраций препарата в среде к 100 мл питательной среды добавляют 1 мл соответствующего раствора препарата.

 

Таблица 4

 

NN пп	Указания для приготовления растворов сульфамидов	Концентрация  препарата в полу- ченном растворе в мкг/мл	Окончательная  конц. препарата в мкг/мл в смеси 1 мл р-ра преп. и 100 мл среды
1	Основной раствор	1000000
2	1 мл р-ра N 1 + 9 мл воды	100000	1000
3	2 мл р-ра N 2 + 2 мл воды	50000	500
4	1 мл р-ра N 2 + 9 мл воды	10000	100
5	1 мл р-ра N 4 + 9 мл воды	1000	10
6	1 мл р-ра N 5 + 9 мл воды	100	1

 

После добавления соответствующего раствора препарата среду стерильно разливают по 2 мл в пробирки.

Ход определения. Для заражения применяют 18-часовую культуру, стандартизованную и разведенную физиологическим раствором до 10 в 7 степени микробных тел в 1 мл. К 2 мл питательной среды с сульфамидным препаратом в соответствующей концентрации добавляют 0,1 мл культуры. Контрольная пробирка содержит 2 мл среды без сульфамида.

После заражения пробирки инкубируют при 37 град. С в течение 18-24 часов или более в зависимости от появления роста микробов в контроле.

Оценка результатов. Отмечают последнюю пробирку с полной видимой задержкой роста микробов. Количество препарата в этой пробирке является минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к сульфамидам. В ответе, выдаваемом лабораторией, указывается минимальная ингибирующая концентрация препарата. При приеме обычных терапевтических доз сульфамидов наиболее вероятный максимальный уровень препаратов в крови составляет 10-50 мкг/мл. В соответствии с этим, а также сообразуясь с устойчивостью большинства диких штаммов бактерий, выделенных до введения сульфамидов в клиническую практику, следует считать клинически устойчивыми к сульфамидам штаммы, растущие при концентрации препарата 10-50 мкг/мл и выше.

 

1.1.7. Определение чувствительности микроорганизмов

к сульфамидам методом разведений в плотных средах

 

Принцип. Тот же, что и в методе разведений в жидких средах.

Компоненты.

1. Питательные среды:

а) Мюллер-Хинтон агар:

    Мясной настой                  - из 300 г мяса,

    Пептон казеиновокислый

    (кислотный перевар казеина)    - 17,5 г

    Крахмал                        - 1,5 г

    Агар очищенный                 - 17,0 г

    Дистиллированная вода          - до 1000 мл

pH после стерилизации 7,4

б) Те же, что в методе разведений в жидких средах, но с добавлением 1,5-2% очищенного агара.

Очистка агара производится следующим образом: необходимое количество агара помещают в марлевый мешочек и промывают проточной водопроводной водой в течение 18-24 часов, а затем трижды ополаскивают дистиллированной водой.

Приготовленные питательные среды разливают по колбам по 100 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 45 минут. Затем стерильно добавляют необходимое количество заранее приготовленного раствора глюкозы.

Перед постановкой опыта необходимое количество питательного агара расплавляют на водяной бане и охлаждают до 60 град. С.

2. Один из водорастворимых сульфамидных препаратов в порошке (например, норсульфазол).

Подготовка к определению. Приготовление разведений сульфамидов. Приготовление различных концентраций сульфамидного препарата производят путем разведения основного раствора препарата стерильной дистиллированной водой согласно представленной схеме для метода разведений в жидких средах (таблица 4). Для получения необходимых концентраций препарата в среде 100 мл питательного агара добавляют 1 мл соответствующего раствора препарата.

Расплавленный и охлажденный до 60 град. С питательный агар и раствор сульфамида хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри по 15 мл в каждую. Дают агару застыть.

Контрольная чашка Петри содержит питательный агар без сульфамидного препарата.

Ход определения. Для заражения применяют 18-часовую культуру, стандартизованную и разведенную физиологическим раствором до 10 в 7 степени м.т./мл. Ее наносят на поверхность питательного агара бактериологической петлей или штампом-репликатором полоской - до 20-25 штаммов на одну чашку.

Инкубация при 37 град. С в течение 18-24 часов, или более в зависимости от появления роста микроорганизмов в контроле.

Оценка результатов. Такая же, как в методе разведений в жидких средах.

 

1.1.8. Определение чувствительности микроорганизмов

к нитрофурановым препаратам методом разведений в

жидких средах

 

Принцип. Готовят разведения нитрофурановых препаратов в бульоне и вносят в каждый из приготовленных растворов исследуемую культуру. После инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Метод позволяет определить минимальную ингибирующую рост исследуемого штамма микроорганизмов концентрацию нитрофурана.

Компоненты.

1. Питательные среды: мясо-пептонный бульон или бульон на переваре Хоттингера. Если исследуемые микроорганизмы не растут на простых средах, допускается использование специальных сред.

2. Основные растворы нитрофуранов готовятся в соответствии с растворимостью этих препаратов в воде (таблица 5); раствор фурагина, фуразолина, фурацилина, фурадонина с концентрацией 200 мкг/мл готовят растворением 10 мг чистого порошкооборазного препарата (можно и при нагревании до 60-80 град. С) в 50 мл бульона;

фурагина с концентрацией 75 мкг/мл готовят растворением 20 мг чистого препарата в 267 мл бульона;

фуразолидона с концентрацией 40 мкг/мл готовят растворением 10 мг чистого препарата в 250 мл бульона.

Стабильны при хранении в холодильнике в стерильных условиях в течение месяца. При нарушении стерильности пригодны для применения в течение 5-7 дней при условии хранения в холодильнике.

 

Таблица 5

 

Максимальная растворимость в воде

нитрофурановых препаратов

 

Препарат	Максимальная растворимость в воде
Фурагин растворимый	1 : 500 = 2000 мкг/мл
Фуразолин	1 : 3000 = 333 мкг/мл
Фурацилин	1 : 4200 = 238 мкг/мл
Фурадонин	1 : 5200 = 192 мкг/мл
Фурагин	1 : 13000 = 77 мкг/мл
Фуразолидон	1 : 25000 = 40 мкг/мл

 

Подготовка к определению. Приготовление разведений нитрофурановых препаратов. Разведения нитрофурановых препаратов готовят путем разведения основного раствора препарата бульоном согласно представленной схеме (таблица 6).

 

Таблица 6

 

Окончательная  концентрация  препарата в   мкг/мл в смеси основного р-ра нитрофурана и  бульона	Фуразолидон		Фурагин		Остальные более растворимые    нитрофураны
	бульон в мл	основной р-р в мл	бульон в мл	основной р-р в мл	бульон в мл	основной р-р в мл
5	2	0,3	2	0,15	2	0,05
10	2	0,7	2	0,3	2	0,1
15	1	0,6	2	0,5	2	0,15
20	1	1,0	2	0,75	2	0,22
25	1	1,7	2	1,0	2	0,3
30	0,5	1,5	2	1,3	2	0,35
40	-	2,0	1	1,1	2	0,5
50			1	2,0	1,5	0,5
75			-	2,0	1,25	0,75
100					1,0	1,0
150					0,5	1,5
200					-	2,0

 

Питательная среда с нитрофурановыми препаратами стерильно разливается в пробирки по 2 мл в каждую.

Ход определения. Для заражения применяют 18-часовую культуру, стандартизованную и разведенную до 10 в 8 степени м.т. в 1 мл бульоном. К 2 мл питательной среды с соответствующей концентрацией в ней нитрофуранового препарата добавляют 0,1 мл культуры и помещают в термостат при 37 град. С на 18-24 часа, а для медленно растущих микробов - на 48-72 часа. Контроль - питательная среда без нитрофурана.

Оценка результатов. Отмечают последнюю пробирку с полной видимой задержкой роста микроорганизмов. Количество препарата в этой пробирке является минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к препарату. В ответе, выдаваемом лабораторией, указывается минимальная ингибирующая концентрация препарата.

Концентрация нитрофуранов в крови обычно редко превышает 5 мкг/мл, поэтому при септических инфекциях следует рассматривать как чувствительные те бактерии, которые подавляются при концентрации препарата 5 мкг/мл и менее. Таким образом, при септических инфекциях достаточно определять действие нитрофуранов в концентрациях 10, 20 и 40 мкг/мл. Культуры, рост которых задерживается всеми тремя разведениями, рассматриваются как чувствительные; при отсутствии роста только в двух последних разведениях - как слабо чувствительные, а если действие препарата отмечается только при его концентрации в растворе 40 мкг/мл - как устойчивые.

Концентрация нитрофуранов в моче может быть значительно выше, чем в крови, достигая иногда - 100 мкг/мл и более, поэтому при инфекциях в мочевыводящих органах следует определять действие нитрофуранов в концентрациях 20, 40, 75, 100 и 150 мкг/мл (в соответствии с растворимостью препарата). Действие даже одного из двух последних разведений указывает на слабую чувствительность микробов.

 

1.1.9. Определение чувствительности микроорганизмов

к неграму методом разведений в жидких средах

 

Принцип. Готовят разведения неграма (невиграмон или налидиксовая кислота) в питательной среде и вносят в каждый из приготовленных растворов исследуемую культуру. После инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Метод позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию неграма для исследуемого штамма микроорганизмов.

Компоненты.

1. Питательные среды: мясо-пептонный бульон или бульон на переваре Хоттингера. Если исследуемые микроорганизмы не растут на простых средах, допускается использование специальных сред.

2. Растворы неграма: N 1 - раствор с концентрацией 1000 мкг/мл, готовят растворением 10 мг чистого препарата в 9 мл 0,01 н раствора едкого натра при периодическом встряхивании. Через 3-4 часа стерильной пипеткой по каплям добавляют 1 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (pH раствора должно быть 8,3-8,5).

N 2 - раствор с концентрацией 200 мкг/мл, готовят из 1 мл раствора N 1 и 4 мл стерильной дистиллированной воды.

Растворы неграма стабильны при хранении в холодильнике в течение месяца.

Ход определения. Для исследования одного штамма микроорганизмов берут 5 пробирок с 2 мл среды в каждой. Стерильной пипеткой в 4 из них добавляют растворы неграма: сначала в первые две пробирки 0,1 мл и 0,2 мл раствора неграма N 2, а затем той же пипеткой в две следующие пробирки 0,1 мл и 0,2 мл раствора неграма N 1. Получаются растворы неграма в бульоне с концентрациями 10, 20, 50 и 100 мкг/мл. В пятую пробирку - контрольную - неграм не добавляют.

Заражение производят 18-часовой культурой, стандартизованной и разведенной до 10 в 8 степени м.т. в 1 мл. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл культуры, осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 град. С на 18-24 часа, а для медленнорастущих микробов - 48-72 ч.

Оценка результатов. Отмечают последнюю пробирку с полной видимой задержкой роста микроорганизмов. Количество препарата в этой пробирке является минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к препарату. В ответе, выдаваемом лабораторией, указывается минимальная ингибирующая концентрация препарата.

При отсутствии роста бактерий во всех четырех опытных пробирках культура высокочувствительна к действию неграма. При наличии роста только в первой пробирке - чувствительна, в первых двух пробирках - слабо чувствительна. Рост в третьей пробирке (при 50 мкг/мл) указывает на слабую чувствительность, а развитие бактерий во всех четырех опытных пробирках - на устойчивость к действию неграма.

 

1.1.10. Определение чувствительности микроорганизмов к

энтеросептолу методом разведений в жидких средах

 

Принцип. Готовят серию разведений энтеросептола (5-хлор-7-йод-8-оксихинолин) в бульоне и вносят в каждый из приготовленных растворов исследуемую культуру. После инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Метод позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию энтеросептола для исследуемого штамма микроорганизмов.

Компоненты.

1. Питательные среды: мясо-пептоный бульон или бульон на переваре Хоттингера. Если исследуемые микроорганизмы не растут на обычных средах, допускается использование специальных сред.

2. Основной раствор энтеросептола с концентрацией 200 мкг/мл. 2 мг чистого энтеросептола помещают в стерильную пробирку, добавляют 2 мл 0,1 н раствора едкого натра, несколько раз тщательно взбалтывают и через 1 час добавляют 8 мл стерильной дистиллированной воды, опять взбалтывают и через несколько часов прозрачный раствор готов к употреблению. При хранении в холодильнике стабилен в течение месяца.

Ход определения. Для определения чувствительности одного штамма микроорганизмов берут 4 пробирки, содержащие по 2 мл стерильной питательной среды. В первую пробирку добавляют 0,1 мл, во вторую - 0,2 мл и в третью - 0,4 мл основного раствора энтеросептола. Четвертая пробирка - контрольная, раствор энтеросептола к ней не добавляют.

Заражение производят 18-часовой культурой, стандартизованной и разведенной до 10 в 8 степени м.т. в 1 мл. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл культуры, осторожно перемешивают и помещают в термостат при 37 град. С на 18-24 часа, а для медленно растущих микробов - на 48-72 часа.

Оценка результатов. Если во всех трех опытных пробирках отмечается обильный рост бактерий, культура рассматривается как устойчивая к действию энтеросептола. Если обильный рост отмечается только в первых двух пробирках - как слабо чувствительная, при росте только в первой пробирке - как чувствительная. Отсутствие или резкая задержка роста во всех трех опытных пробирках указывает на высокую чувствительность исследуемого штамма микроорганизмов.

Примечание. Поскольку в кишечнике или при местном внесении энтеросептола на ранах или в гнойных очагах можно поучить высокие его концентрации в очаге инфекции, дополнительно к указанным можно проверить еще чувствительность бактерий к концентрации энтеросептола 100 мкг/мл (смесь равных количеств основного раствора препарата и питательной среды), при росте бактерий в первых 3-х.

 

1.1.11. Определение чувствительности микроорганизмов

к 5-НОК методом разведений в жидких средах

 

Принцип. Готовят серию разведений 5-НОК (5-нитро-8-оксихинолин) в бульоне и вносят в каждый из приготовленных растворов исследуемую культуру. После инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Метод позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию 5-НОК для исследуемого штамма микроорганизмов.

Компоненты.

1. Питательные среды: мясо-пептонный бульон или бульон на переваре Хоттингера. Если исследуемые микроорганизмы не растут на простых средах, допускается использование специальных сред.

2. Основной раствор 5-НОК с концентрацией 2000 мкг/мл. Готовят растворением 10 мг 5-НОК (чистого препарата) в 5 мл стерильной дистиллированной воды. Стабилен при хранении в холодильнике в течение недели.

Подготовка к определению. Приготовление разведений 5-НОК. Разведения 5-НОК готовят путем разведения основного раствора препарата бульоном согласно представленной схеме для метода серийных разведений в бульоне при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (таблица 2).

Ход определения. Для заражения применяют бульонную культуру 18-часовую, стандартизованную и разведенную бульоном до 10 в 5 степени - 10 в 6 степени м.т. в 1 мл. 1 мл такой культуры добавляют к 1мл каждого разведения 5-НОК, при этом препарат разводят еще в два раза (таблица 2). Контроль - 2 мл питательной среды без 5-НОК. После заражения инкубируют при 37 град. С в течение 16-20 часов, для медленно растущих микроорганизмов срок инкубации увеличивается до 48-72 часов.

Оценка результатов. Отмечают последнюю пробирку с полной видимой задержкой роста микроорганизмов. Количество препарата в этой пробирке является минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к препарату. В ответе, выдаваемом лабораторией, указывается минимальная ингибирующая концентрация препарата.