"Экспериментальное доклиническое изучение аддиктивного потенциала фармакологических средств. Методические рекомендации N 2000/112" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

Утверждаю

Первый заместитель

Министра здравоохранения

Российской Федерации

А.И.ВЯЛКОВ

29 июня 2001 г.

Согласовано

Начальник Управления

научно-исследовательских

медицинских учреждений

С.Б.ТКАЧЕНКО

29 июня 2001 г.

Согласовано

И. о. руководителя

Департамента государственного

контроля качества, эффективности,

безопасности лекарственных средств

и медицинской техники

Т.И.ШЕЛАЕВА

26 июня 2001 г.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

АДДИКТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

N 2000/112

АННОТАЦИЯ

Настоящее издание "Методических рекомендаций" представляет собой новую редакцию документа "Методические рекомендации по доклинической оценке способности психотропных препаратов вызывать симптомы патологического привыкания" (Москва, МЗ СССР, 1982 г.). Предложена эффективная и научно обоснованная программа оценки аддиктивного потенциала фармакологических средств. В программу включены тесты на наличие у фармакологических веществ первично-подкрепляющих свойств (реакция внутривенного самовведения), вторично-подкрепляющих свойств (условная реакции предпочтения места, ассоциированного с действием фармакологического средства) и способности вызывать активацию системы положительного подкрепления (система "награды"; реакция электрической самостимуляции мозга). При максимально возможной технологической простоте данная программа удовлетворяет современным требованиям и может быть использована как для первичных и углубленных скрининговых, так и для расширенных доклинических исследований. Рекомендации предназначены для работников научно-исследовательских и научно-производственных учреждений, а также кафедр ВУЗов, занимающихся изысканием и доклиническим изучением новых фармакологических средств.

Организация-разработчик: Институт фармакологии им. А.В.Вальдмана Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова (СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова).

Составители: д.м.н., проф. Э.Э.Звартау, д.м.н. А.В.Кузьмин, к.м.н. А.Ю.Беспалов, к.м.н. Н.А.Паткина.

ВВЕДЕНИЕ

Под аддиктивным потенциалом фармакологических средств понимают их способность вызывать патологическое пристрастие. Теоретической основой доклинической оценки аддиктивного потенциала фармакологических средств является физиологическая концепция патогенеза наркотоксикоманий, согласно которой нейробиологическая природа аддиктивного эффекта фармакологических средств связана с их влиянием на мозговые системы "награды" и "наказания". На основе экспериментальных исследований выделены фармакологические свойства, которые рассматриваются как специфические предикторы способности психоактивных соединений вызывать пристрастие:

1. Наличие у вещества первично-подкрепляющих свойств. Эти свойства выявляются в опытах по выработке и поддержанию поведенческой реакции внутривенного самовведения (РВС), при которой безусловным подкрепляющим раздражителем является исследуемое вещество.

2. Наличие вторично-подкрепляющих свойств у условных раздражителей, которые сочетались с действием фармакологического безусловного раздражителя. Эти свойства выявляются в опытах по выработке условнорефлекторной реакции на место (обстановку), ассоциированное с действием фармакологического средства (условная реакция предпочтения места - УРПМ).

3. Наличие у вещества способности вызывать активацию системы положительного подкрепления (система "награды"). Данная способность выявляется по изменению показателей реакции электрической самостимуляции (РСС).

Наличие этих свойств позволяет прогнозировать потенциал пристрастия (аддиктивный потенциал) данного соединения. Сопоставление активности и эффективности главного (терапевтического) эффекта исследуемого вещества с его активностью и эффективностью в тестах оценки аддиктивного потенциала позволяет делать заключение о наркологической безопасности фармакологического средства.

Заключение об аддиктивном потенциале и степени наркологической безопасности фармакологического средства на основе предлагаемых экспериментальных тестов будет более уверенным, если выполнены все предлагаемые исследования, т.е. оценены первично- и вторично-подкрепляющие эффекты, а также влияние вещества на систему "награды". Каждый из тестов имеет свои преимущества и ограничения, которые в сравнительном плане охарактеризованы в таблице 1.

Протокол исследования целесообразно разделить на две фазы. В первую фазу целесообразно использовать тесты, наиболее удобные для первичного скрининга, т.е. позволяющие получить максимально быстрый ответ и наиболее простые по выполнению. Этим требованиям удовлетворяют экспресс-метод инициации РВС у мышей и выработка УРПМ у мышей и крыс. Задачей исследования является получение кривых зависимости "доза-эффект" для 5-6 доз (при заданном пути введения) в сравнении с эффектом растворителя и (или) препарата сравнения.

Вторая фаза исследований позволяет подтвердить первично-подкрепляющие свойства исследуемого соединения на втором виде животных (крысы) и исследовать на этапе поддержания характер РВС при изменении разовой дозы соединения, эффект его замены растворителем. Оценка влияния вещества на РСС мозга позволяет исследовать также зависимость "время-эффект" по влиянию вещества на возбудимость нервного субстрата системы "награды".

Следует подчеркнуть, что выявление предикторов потенциала пристрастия во всех тестах позволяет сделать вывод только о подкрепляющем эффекте соединения и его влиянии на мозговой субстрат системы "награды", но не о его непосредственной способности вызывать наркоманию, токсикоманию или психологическую зависимость. Данные нозологические единицы и синдромы являются сложным клиническим феноменом, который формируется в течение достаточно продолжительного времени и при участии не только биологических, но и других, в том числе социальных факторов. Вместе с тем, как показывает клинический опыт, подкрепляющее действие является "общим знаменателем" аддиктивных соединений и его выявление в эксперименте на животных действительно является предиктором, т.е. позволяет предсказать, что на основе этого подкрепляющего эффекта может сформироваться патологическое влечение к данному веществу.

ФОРМУЛА МЕТОДА

Методические рекомендации предлагают эффективную и технологически простую программу доклинических экспериментальных исследований для оценки аддиктивного потенциала (потенциала пристрастия) фармакологических средств. Программа включает экспериментальные процедуры, которые в наибольшей степени подтвердили свою прогностическую ценность в исследованиях многочисленных фармакологических лабораторий в нашей стране и за рубежом. Впервые в программу исследования включены методики "первичного" скрининга, позволяющие быстро и с высокой степенью надежности выявить аддиктивный потенциал фармакологических веществ (реакция внутривенного самовведения у мышей, условная реакция предпочтения места).

МЕТОДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ПЕРВОЙ ФАЗЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ (МЕТОДЫ "ПЕРВИЧНОГО СКРИНИНГА")

Выработка реакции внутривенного самоввведения (РВС) у мышей

Главное достоинство метода - быстрота получения результатов определяется использованием естественной ориентировочно-исследовательской реакции (выглядывание в отверстие при помещении в затененную камеру), хорошо выраженной у мышей. При сочетании с инфузией раствора аддиктивного соединения исследовательская реакция не угашается, а, напротив, оживляется, так как исследуемый препарат обладает "аттрактивными" мотивационными свойствами. Важным элементом метода является использование пары мышей, одна из которых является "активной" (АМ) и ее выглядывания в отверстие приводят к внутривенной самоинфузии исследуемого раствора, а также к инфузии той же дозы в вену второй, контрольной мыши (КМ). Последняя, таким образом, получает инфузии исследуемого соединения в том же режиме, что и АМ, но это введение является принудительным, а не "самовведением", так как оно не зависит от собственной ориентировочно-исследовательской реакции контрольного животного. Использование КМ позволяет оценивать влияние исследуемого препарата на общее поведение, в частности на уровень исследовательской реакции.

Материально-техническое обеспечение метода.

Экспериментальные животные: Мыши-самцы массой 18-24 г.

Установка: Экспериментальная установка должна обеспечивать возможность размещения двух мышей в смежных камерах, размеры которых (например, 8x8x8 см) позволяют животным сохранять относительную свободу движений, в частности выглядывания в отверстия на передней стенке камеры, несмотря на фиксацию хвоста. Передняя стенка каждого бокса имеет отверстие диаметром 1.2 см на высоте 0.5 см от пола, снабженное инфракрасным датчиком для регистрации реакции выглядывания. Фотодатчик через интерфейс связан с компьютером, который по соответствующей программе управляет работой двухшприцевого микроинъектора с шаговыми двигателями, осуществляя кратковременную инъекцию заданного объема раствора исследуемого препарата (1.6 мкл/инъекцию) в ответ на каждое выглядывание. Задняя стенка каждого бокса прорезана вертикальной щелью, шириной 0,5 см. Размещение животного в боксе производят с учетом следующих условий: 1) мышь может свободно выглядывать в отверстие на передней стенке; 2) доступ для пункции к латеральным хвостовым венам не затруднен (хвост выводят через щель на задней стенке за пределы бокса и фиксируют к горизонтальной поверхности липкой лентой); 3) исключается возможность выдергивания иглы и повреждения катетера животным во время эксперимента. По данным литературы и нашему опыту мыши сравнительно легко переносят данную форму частичной иммобилизации.

Описание метода.

Протокол исследования включает исходное тестирование ориентировочно-исследовательской активности и последующую сессию инициации (выработки) РВС.

Задачей исходного тестирования является оценка индивидуальной ориентировочно-исследовательской реакции мышей и основанный на ней подбор пар для сессии РВС. Группы, которые формируются после предварительного тестирования продолжительностью 10 мин., должны содержать не менее 6-8 пар мышей на каждую дозу (концентрацию) и рандомизированы таким образом, чтобы средний уровень исследовательской активности в каждой группе был по возможности близким.

Как показывает опыт инициация РВС как "больших" (морфин, кокаин, амфетамин, эфедрон), так и "малых" (никотин, кофеин, этанол) аддиктивных средств происходит в течение 10-20 минут. Поэтому общая продолжительность сессии с выработкой РВС составляет 30 минут. Предварительно отобранные пары мышей помещают в экспериментальные боксы и после 3-4 минут адаптации в латеральные хвостовые вены обеих мышей вводят иглы, подсоединенные к инъектору через полиэтиленовые катетеры. Во время тридцатиминутной сессии выработки РВС "активная мышь" (АМ) получает в/в инъекции исследуемого раствора после каждого выглядывания. Контрольная "пассивная мышь" (КМ) получает инъекции в ритме выглядываний АМ, но вне связи с собственными выглядываниями. Таким образом, оба животных получают одинаковое число инъекций с одинаковым распределением инъекций во времени и, соответственно, одинаковую дозу препарата, что позволяет при оценке эффекта и сравнении данных у АМ и КМ "уравнять" влияние препаратов на двигательную и исследовательскую активность. По окончании 30 минут иглы извлекают и животных возвращают в общую клетку.

Заключение о положительно-подкрепляющем эффекте исследуемого соединения основывают на расхождении количества выглядываний (КВ) АМ и КМ. Если за период сессии КВ АМ превышает КВ ПМ, то делают заключение о мотивационно-позитивном (положительно-подкрепляющем) эффекте соединения. Если КВ АМ в период сессии меньше по сравнению с КВ ПМ, то эффект соединения расценивают как "аверсивный" ("наказующий").

Эффективность использования метода.

Кривая зависимости "концентрация-эффект" (эффект оценивается по разности КВ АМ и КМ) при инициации РВС имеет характерную для данной модели куполообразную форму с максимальным значением показателя при определенной концентрации(иях)/разовой дозе(ах), характеризующих наиболее активный мотивационный эффект соединений. Модель инициации РВС у мышей проявила высокую чувствительность и селективность. Так, на этой модели в течение одной экспериментальной сессии выявляются подкрепляющие свойства не только эталонных аддиктивных средств (опиаты, кокаин, амфетамин, эфедрон), но и таких веществ как этанол, никотин, кофеин. Опиоидные аналгетики, которые лишены выраженного аддиктивного потенциала (буторфанол, налбуфин, трамадол) не проявляют подкрепляющих свойств на данной модели.

В таблице 1 суммированы сравнительные достоинства и ограничения данной модели. Таким образом, метод инициации РВС у мышей является чувствительным и быстрым способом оценки аддиктивного потенциала, удовлетворяющим требованиям первичного скринингового теста.

Выработка условнорефлекторной реакции предпочтения места (УРПМ) у крыс и мышей

Нейтральные обстановочные раздражители при сочетании с "награждающим" эффектом аддиктивных средств могут приобретать собственные "аттрактивные" свойства, на базе которых вырабатываются инструментальные реакции второго и более высоких порядков, которые подкрепляются этими условнорефлекторными раздражителями. Если эффект аддиктивного вещества испытывается животным в определенном месте, например в одной из камер двух- или многокамерной установки или участке "открытого поля", имеющем специфические дискриминативные стимульные свойства (тактильные, световые, обонятельные и т.п.), то животное предпочитает находится в этом месте, если ему предоставляется выбор. Условнорефлекторная реакция предпочтения места (УРПМ) получила широкое распространение при изучении аддиктивных средств с конца 70-х, начала 80-х гг. Если вещество проявляет противоположный (аверсивный) эффект, то вырабатывается условнорефлекторная реакция избегания места (УРИМ). Таким образом, условный рефлекс на место может иметь противоположную направленность (УРПМ или УРИМ) и отражать итоговое взаимодействие исследуемого вещества с мозговым субстратом мотивационных реакций. Выработка условного рефлекса на место является технически простым тестом доклинической оценки аддиктивного потенциала фармакологических средств, имеющим свои достоинства и недостатки (таблица 1).

Методика выработки УРПМ у крыс существует в двух модификациях: а) с исходным предпочтением животными одного из экспериментальных отсеков (biased procedure) и б) с исходно сбалансированным выбором отсеков экспериментальной камеры (unbiased procedure). При первом варианте метода легче получить четкую кривую зависимости "доза-эффект", однако при этом трудно исключить вклад антиаверсивных свойств исследуемого вещества в окончательный эффект обусловливания. При использовании второй модификации уверенность в определении избирательных "награждающих" (УРПМ) или аверсивных (УРИМ) эффектов препаратов выше. В настоящих методических рекомендациях рассматривается методика выработки УРПМ при исходно сбалансированном выборе отсеков экспериментальной камеры (unbiased procedure).

Материально-техническое обеспечение метода.

Экспериментальные животные - крысы-самцы массой 150-250 гр. Рекомендуется содержать животных при инвертированном режиме освещения (12 часовой цикл темнота/свет) для активации поведения во время экспериментов в темновой фазе. Эксперименты начинают примерно через час после начала темнового цикла. Предварительно формируются группы (не менее восьми в группе) для изучения эффекта каждой дозы препарата и растворителя.

Экспериментальная установка обычно состоит из 2 или более камер различной формы и размера, которые отличаются по текстуре пола, окраске стенок и т.п., что позволяет животным дифференцировать разные камеры. Важно, чтобы при свободном исследовании камер, в группе крыс не проявлялось предпочтения одной из них. Желательна автоматическая регистрация с помощью механических или оптических датчиков времени нахождения животных в отсеках установки и количества переходов.

Описание метода.

Протокол исследования предусматривает периоды обусловливания и тестирования. Период фармакологического обусловливания продолжается 4 дня. Каждый день проводят две сессии выработки условного рефлекса на место. Первая сессия является дифференцировочной. Перед помещением в один из отсеков (отсеки камеры разделены перегородкой) на 20-45 мин. (в зависимости от сроков действия препарата) животным вводят растворитель. Во время второй сессии вводят исследуемое соединение (в контрольной группе - растворитель) перед помещением животного в противоположный отсек на 20-45 минут. Размещение животных после инъекции в том или ином отсеке производят в случайном порядке таким образом, что половину группы размещают в данном отсеке после инъекции препарата, а другую половину - после введения растворителя. После каждого опыта камеры обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Заключительное тестирование выработки условного рефлекса на место проводят через 72 часа после последнего обусловливания. Из камеры вынимается перегородка между отсеками и в течение 15 минут крысы свободно исследуют экспериментальную камеру.

Регистрируют время нахождения в отсеках и количество переходов из одного отсека в другой. Время, проводимое в отсеке, ассоциированном с действием препарата, сравнивают со временем нахождения в отсеке, ассоциированном с растворителем. Положительное значение разности двух величин указывает на выработку УРПМ, а отрицательное на УРИМ. В качестве альтернативного (квантового) показателя используют количество животных в группе с выработанной УРПМ или УРИМ. За критерий предпочтения условно принимается время нахождения в данном отсеке более 2/3 (более 600 сек) или, соответственно менее 1/3 (300 сек) от общего времени теста (900 сек). Этот критерий примерно соответствует диапазону доверительных границ для животных контрольной группы, получающих изотонический раствор.

Эффективность использования метода.

Положительный условный рефлекс на место, ассоциированное с фармакологическим эффектом, оценивается как косвенное свидетельство положительных мотивационных свойств изучаемого соединения. Метод выработки УРПМ в рассмотренной модификации достаточно чувствителен и позволяет выявить аддиктивный потенциал как "больших" (кокаин, морфин), так и малых (кофеин, никотин, этанол) аддиктивных средств. Он также специфичен и не выявляет положительного условного рефлекса на место при сочетании с эталонными веществами, не имеющими аддиктивного потенциала (ненаркотические анальгетики, нейролептики и др.), т.е. не дает ложноположительных реакций. Вместе с тем выработка УРПМ, ассоциированного с фармакологическим эффектом, при отсутствии предпочтения какого-либо из отсеков экспериментальной камеры в контрольной группе (unbiased procedure) не позволяет с уверенностью количественно разделить исследуемые вещества по эффективности (максимуму) подкрепляющего эффекта, а также получить стабильные и воспроизводимые кривые зависимости "доза-эффект".

Для сравнения аддиктивного потенциала соединений можно использовать вариант выработки УРПМ, при котором помещение в один отсек камеры сочетается с действием эталонного наркотика (например, кокаина), а в другой - с действием исследуемого соединения. В этих условиях можно видеть, что животные предпочитают отсек, ассоциированный с инъекцией кокаина по сравнению с местом, где вводились, например, кофеин, никотин или этанол. С другой стороны, животные не отдают явного предпочтения отсеку, ассоциированному с кофеином, перед местом, где они испытывали действие никотина или этанола.

Основные требования к установке для выработки УРПМ у мышей аналогичны таковым для крыс. По сравнению с крысами мыши, как правило, проявляют более высокую двигательную активность в камере и временная асимметрия выражена слабее или отсутствует. Поэтому протокол исследования может предусматривать протесты для оценки исходного предпочтения отсеков камеры животными, и эффект препарата можно оценивать по изменению (приросту в случае УРПМ) времени пребывания животного в данном отсеке после периода фармакологического обусловливания. Исследование может проводится также и по схеме, изложенной выше для выработки условной реакции на место у крыс.

МЕТОДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ВТОРОЙ ФАЗЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ (МЕТОДЫ "УГЛУБЛЕННОГО СКРИНИНГА")

Инициация и поддержание реакции внутривенного самовведения (РВС) у крыс

Материально-техническое обеспечение метода.

Экспериментальные животные: крысы-самцы линии Wistar массой 180-200 гр.

Установка. Камеры, в которые помещают животных, имеют размер 30x30x30 см и снабжены двумя педалями. Одна из них при замыкании контактов включает инъектор, а вторая необходима для контроля неспецифической оперантной активности животного. Возможно использование камер, снабженных не педалями, а двумя отверстиями диаметром 1.5 см на высоте 2.0 см от пола и на расстоянии 15 см друг от друга. В оба отверстия вмонтированы инфракрасные датчики связанные через интерфейс с компьютером типа PC, причем одно из отверстий является "активным" и выглядывание в него ведет к инфузии исследуемого раствора. Оперантный ответ типа выглядывания является более естественным для крыс, чем нажатие на педаль и вырабатывается быстрее.

Для инфузии веществ используют микродозаторы с регулируемыми скоростью подачи растворов (от долей секунды до 10-20 секунд) и объемом разовых инфузии (от 10 до 400 мю л/кг). Оптимальные параметры (объем разовой инфузии и болюсная доза) подбираются индивидуально для каждого препарата. Инфузию сочетают со световым раздражителем, сигнализирующем о фармакологическом подкреплении инструментальной реакции. Инфузии производятся автоматически в ответ на выглядывание в одно из отверстий или в ответ на нажатие на соответствующую педаль. Соответственно, оперантные реакции на протяжении срабатывания инъектора (от 2 до 13 секунд в зависимости от марки и типа микродозатора) фиксируются, однако не ведут к активации инъектора.

Для обеспечения свободы перемещения животных в эксперименте применяют шарнирное соединительное устройство ("swivel joint"), предупреждающее перекручивание соединительных трубок от катетера к инъектору.

Описание метода.

Крысам под общей анестезией через наружную яремную вену в ушко правого предсердия имплантируют силиконовые катетеры, которые фиксируют на черепе животного акриловым цементом. Через 3-4 суток после операции крыс переводят в виварий с инвертированным световым режимом и им ограничивают пищевой рацион с целью снижения массы на 10-15% от исходной. Через 3 дня после этого приступают к выработке РВС. Перед началом тестирования проверяют проходимость катетера путем введения 0.1-0.2 мл изотонического солевого раствора.

Протокол опыта предусматривает повторные ежедневные посадки животного в экспериментальную камеру и регистрацию количества оперантных реакций за время эксперимента. Практически удобнее использовать ограниченную во времени сессию РВС (1-3 часа). Задачи исследования определяют повторность и регулярность сессий. При выработке РВС обычно к пятой сессии выясняется, способно ли животное обучиться РВС при избранной разовой дозе исследуемого соединения. Рекомендуется исследовать несколько разовых доз (не менее 4-5) исследуемого соединения.

Показателями РВС являются количество самовведений препарата в каждый из тестовых дней, а также количество выглядываний в неактивное отверстие (или нажатий на "неактивную" педаль). Регистрируют также суммарную дозу вещества, введенную за сессию. В случае использования протокола выработки РВС после окончания эксперимента (5 дней) животных забивают и положение в/в канюли верифицируют гистологически. В опытах с поддержанием РВС после периода тренировки (5-8 дней) большинство животных (60-70%) обучается самовведению эталонных аддиктивных соединений (кокаина, морфина, этанола). В дальнейших опытах используют только животных со стабильным уровнем потребления эталонного аддиктивного препарата (колебания не более 15% от среднего уровня на протяжении 3 последовательных экспериментальных сессий).

Эффективность использования метода.

РВС у крыс используется для предсказания аддиктивного потенциала физиологически активных соединений почти сорок лет. Модель подтвердила свою чувствительность и специфичность. С ее помощью выявляются подкрепляющие свойства практически всех психоактивных соединений, которые известны свои аддиктивным потенциалом у человека. Соответственно, вещества, не являющиеся объектом злоупотребления у человека, не поддерживают РВС у крыс.

В таблице 1 суммированы сравнительные достоинства и ограничения данной модели.

Реакция электрической самостимуляции (РСС) системы "награды" мозга

Активация реакции самостимуляции (РСС) при введении аддиктивного вещества является неотъемлемым звеном доказательств единой мишени для электрической (РСС) и фармакологической (исследуемое вещество) стимуляции и рассматривается как экспериментальный эквивалент эйфоризирующего действия фармакологических веществ.

Существует большое количество модификаций метода электрического самораздражения мозга, основанных как на особенностях оперантного (инструментального) поведения, так и на требованиях, диктуемых необходимостью исследования конкретного фармакологического агента. Несмотря на многообразие экспериментальных подходов, для обычных скрининговых целей при исследовании аддиктивного потенциала фармакологических агентов с помощью РСС наиболее информативным и корректным признано использование методик, позволяющих оценивать возбудимость нервного субстрата системы "награды" по минимальной (пороговой) интенсивности "награждающей" стимуляции, достаточной для поддержания условной инструментальной реакции.

Существуют две основные методики определения пороговой интенсивности стимуляции ("титрование порога"): "аутотитрование", при котором пороговая интенсивность контролируется самим животным, и титрование порога, которое производится по определенному алгоритму исследователем. Несмотря на исключительную объективность методики "аутотитрования", ее практическое использование сопряжено со значительными затратами времени и ресурсов и не может быть избрано для скрининга фармакологических агентов. Поэтому рекомендуется использовать методику титрования порога РСС, которое осуществляет исследователь.

Материально-техническое обеспечение метода.

Опыты проводятся на самцах крыс массой 150-300 г в зависимости от используемого атласа мозга крыс. РСС исследуют в стандартной камере Скиннера, оборудованной двумя - "награждающей" и "ненаграждающей", педалями. Для РСС необходим источник электрических импульсов (например, стимулятор ЭС-51), который позволяет осуществлять стимуляцию по постоянному току в широком амплитудном и/или частотном диапазоне.

Описание метода.

Электроды имплантируют по стереотаксическим координатам в медиальный переднемозговой пучок или вентральную тегментальную область (вентральная покрышка) среднего мозга. Имплантация электродов в вентральную тегментальную область рекомендуется в связи с низкой вероятностью возникновения аверсивных реакций при электрическом раздражении этой структуры. Могут использоваться моно- или биполярные электроды. Последние предпочтительны из-за более высокой селективности стимуляции. При использовании монополярных электродов устанавливают дополнительный индифферентный электрод в несквозном отверстии в лобной кости.

Через 5-7 дней после операции приступают к выработке и стабилизации РСС при следующих параметрах раздражения: прямоугольные биполярные импульсы частотой 100 Гц, длительность импульса 0.1 мсек., продолжительность серии импульсов 300 мсек., амплитуда импульсов в примерном диапазоне 70-300 мкА для монополярной стимуляции или 10-100 мкА для биполярной стимуляции. Выработка реакции РСС осуществляется с помощью методов "последовательного приближения" к необходимой поведенческой реакции (например, нажатие на педаль). Например, после помещения животного в оперантную камеру последовательно подкрепляют "награждающей" стимуляцией сначала нахождение в части камеры, наиболее близкой к "подкрепляющей" педали, затем каждое движение по направлению к педали, исследование педали, касание педали, и т.д. После выработки навыка нажатия на педаль (1-2 сессии), на протяжении 3-4 ежедневных сессий определяют амплитуду стимуляции, которая поддерживает частоту оперантной реакции 40-60 нажатий в минуту. Как правило, при удачной имплантации электродов на выработку и стабилизацию РСС требуется 4-6 экспериментальных сессий длительностью 30-40 минут.

Для анализа подкрепляющих свойств РСС используется процедура определения пороговой интенсивности электрической стимуляции (по амплитуде или частоте импульсов). В первом случае интенсивность стимуляции регулируют изменением амплитуды импульсов при фиксированной частоте, а во втором - фиксируют амплитуду стимуляции и изменяется частота. Ниже приводится пример рекомендуемой процедуры определения пороговой интенсивности стимуляции.

Ежедневные тренировочные сессии состоят из двух блоков, следующих один за другим и разделенных интервалом в 1 час. Каждый блок начинается с трех независимых от поведения животного стимуляций, которые отделены 1-секундными интервалами и предназначены для "разогрева" животного. Исходно амплитуду стимуляции устанавливают на уровне, использованном на этапе стабилизации РСС и приблизительно соответствующем частоте оперантной реакции 40-60 нажатий на педаль в минуту. Затем амплитуду стимуляции снижают каждую минуту на 2 мкА (этот шаг изменения амплитуды подобран эмпирически и оказался удобным в практическом определении порогов РСС). После достижении порогового значения амплитуду стимуляции начинают увеличивать с тем же шагом. Пороговая интенсивность стимуляции для получения РСС определяется как амплитуда, при которой поддерживается ЧСР не менее 10 нажатий на педаль в минуту. Для каждого блока стимуляции пороговое значение амплитуды определяют два раза - при снижении амплитуды и затем при повышении, после чего рассчитывают среднее значение.

В начале следующего блока стимуляции или новой сессии амплитуду стимуляции устанавливают на уровне, определенном во время предыдущей сессии или блока и соответствующем ЧСР 40-60 нажатий на педаль в минуту. Частота импульсов постоянно поддерживается на уровне, использованном на этапе стабилизации самостимуляции (100 Гц).

При проведении экспериментальных сессий после первого блока стимуляции вводится фармакологическое средство. При необходимости исследования зависимости "время-эффект" экспериментальные сессии удлиняются, и после введения фармакологического средства следуют 2-3 блока стимуляции в заданные экспериментатором интервалы времени.

Изменение пороговой интенсивности стимуляции под действием фармакологического средства или его растворителя выражают в процентах к значению пороговой интенсивности, определенной во время первого блока экспериментальной сессии. При расчете среднеэффективных доз фармакологических средств используется такой параметр, как количество животных в группе (в процентах), у которых снижение пороговой интенсивности стимуляции выходит за пределы нижней границы доверительного интервала колебаний пороговой интенсивности в контроле, т.е. после введения индифферентного растворителя. ЭД50 определяют по методу Литчфильда-Вилкоксона или с помощью пробит-анализа. Анализ зависимостей "доза-эффект" и "время-эффект" проводят с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа для повторных измерений. Для получения достаточного объема данных для анализа зависимостей "доза-эффект" и "время-эффект" достаточны группы из 5-6 животных (при введении различных доз препаратов по схеме "латинский квадрат").

Эффективность использования метода.

К настоящему времени практически для всех известных веществ с аддиктивным потенциалом доказана способность активировать РСС. Список изученных аддиктивных средств включает опиаты (морфин, героин), психостимулянты (кокаин, амфетамины), галлюциногены (фенциклидин, ЛСД), барбитураты, бензодиазепины, этанол, никотин и др. Под влиянием фармакологических агентов принципиально возможно несколько вариантов изменения параметров реакции электрической самостимуляции. После введения различных аддиктивных средств наблюдается снижение пороговой интенсивности реакции РСС, что отражает повышение возбудимости нейронального субстрата. В то же время, другие параметры реакции РСС, такие как частота самораздражений за экспериментальную сессию, могут как повышаться (психостимулянты, низкие дозы опиатов), так и снижаться (этанол, барбитураты).

Результаты экспериментов по РСС позволяют анализ зависимостей "доза-эффект" и "время-эффект" для исследуемых веществ, а также сравнения эффективности между отдельными веществами и в особенности по отношению к эталонным препаратам.

Ввиду того, что вживление электродов для исследования РСС производится в строго контролируемых условиях (стереотаксическая методика, гистологическая верификация положения электрода после эксперимента), данная методика позволяет интерпретировать эффекты исследуемого вещества как способность активировать нейроанатомический субстрат, общий для всех известных наркотиков.

Таблица 1

Сравнительная характеристика методов оценки

аддиктивного потенциала

Метод	Достоинства	Условия и ограничения
Электрическая самостимуляция мозга	- Возможность повторного тестирования группы животных - Возможность оценки зависимости "доза-эффект" и "время-эффект" на одном и том же животном и оценки параметров активности и эффективности фармакологического средства - Возможность оценки эффектов повторного введения веществ (толерантность, зависимость, сенситизация)	- Владение методами стереотаксической имплантации электродов - Наличие адекватной аппаратуры для исследования оперантных реакций и электростимуляции мозга - Обязательность этапов выработки и стабилизации оперантной реакции - Возможность ошибки в оценке эффекта веществ из- за фармакогенного влияния на выполнение оперантной реакции вне связи с изменением функции системы "награды"
Условнорефлекторное предпочтение места	- Эффект соединения оценивается после его выведения из организма (исключается непосредственное влияние вещества на поведение во время теста) - Нет ограничений в путях введения исследуемых веществ - Одновременно оцениваются как "аттрактивные", так и аверсивные свойства исследуемого вещества - Возможность параллельного наблюдения за индивидуальным поведением животного в периоде обусловливания - Техническая простота, дешевизна, высокая производительность метода	- Значительная вариабельность индивидуальных данных - Преимущественно качественная ("да-нет") оценка результатов теста при сбалансированной по исходному предпочтению отсеков экспериментальной камеры процедуре исследования (unbiased prodedure) - Необходимость проведения дополнительного исследования по специальному протоколу для сравнения мотивационной "ценности" исследуемого и эталонного соединений
Внутривенное самовведение: инициация (мыши)	- Техническая простота: исключаются имплантация сосудистых катетеров, предварительное обучение животных. - Малые затраты времени: средняя продолжительность исследования одной дозы - 1 час, исследование одного соединения (полная кривая "доза-эффект") при наличии многоканальной установки - 1-3 дня. - Контролируется влияние исследуемого соединения на ориентировочно- исследовательскую реакцию (контрольное животное)	- Необходимость соответствующего аппаратного и программного обеспечения - Невозможность многократного использования животных для оценки поддержания внутривенного самовведения - Индивидуальная, циркадианная, ультрадианная и сезонная вариабельность базовой оперантной реакции (выглядывания в отверстие)
Внутривенное самовведение: инициация (крысы)	- Прямое доказательство подкрепляющего поведение поиска и потребления эффекта исследуемого вещества	- Необходимость имплантации внутрисосудистого катетера - Необходимость соответствующей аппаратуры и системы управления (оперантные камеры, инъекторы, противоперекручивающие устройства и пр.) - Трудоемкость и сравнительно большая продолжительность исследования
Внутривенное самовведение: поддержание (крысы)	- Возможность длительного изучения потребления аддиктивного вещества и влияния на него фармакологических и иных факторов - Возможность оценки потребления аддиктивных соединений по механизму как положительного, так и отрицательного (у зависимых животных) подкрепления - Возможность оценки способности поддерживать самовведение других веществ при замене ими исходного соединения (тест замены)	- То же, что в схеме инициации - Возможно изменение реакции на исследуемое вещество при повторной экспозиции (толерантность, сенситизация)