Письмо Департамента госконтроля качества, эффективности, безопасности лексредств и медтехники Минздрава РФ от 29.10.2001 N 291-22/144 // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ДЕПАРТАМЕНТ ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА,

ЭФФЕКТИВНОСТИ, БЕЗОПАСНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И

МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ

ПИСЬМО

29 октября 2001 г.

N 291-22/144

Департамент государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники направляет к сведению и руководству изменение N 2 к статье Государственной фармакопеи XI издания "Методы микробиологического контроля лекарственных средств" (ГФХI, вып. 2, с. 187) и просит предусмотреть с 1 января 2002 года разделы "Микробиологическая чистота" и "Стерильность" в стандартах качества лекарственных средств, направляемых на регистрацию (перерегистрацию), в соответствии с указанным изменением.

Заместитель руководителя Департамента

Д.В.РЕЙХАРТ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель руководителя Департамента

государственного контроля качества,

эффективности, безопасности

лекарственных средств и

медицинской техники

Д.В.РЕЙХАРТ

ИЗМЕНЕНИЕ N 2

К СТАТЬЕ ГОСФАРМАКОПЕИ XI ИЗДАНИЯ "МЕТОДЫ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ"

(ГФ ХI, вып. 2, с. 187)

Срок введения Изменения с 01.01.2002 г.

РАЗДЕЛ 1

ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ

ЧИСТОТЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, СУБСТАНЦИЙ

И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Таблица 1

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

┌──────────┬───────────────────────────┬─────────────────────────┐

│ Категория│ Применение │ Рекомендуемые нормы для │

│ │ │Госфармакопеи XII издания│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 1. │- Для парентерального │ Стерильность │

│ │ введения │ │

│ │- Глазные лекарственные │ │

│ │ средства │ │

│ │- Для нанесения на открытые│ │

│ │ раны и ожоги │ │

│ │- Другие лекарственные │ │

│ │ средства, к которым │ │

│ │ предъявляется требование │ │

│ │ "стерильность" │ │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 2. │- Для применения местно, │- Общее число аэробных │

│ │ трансдермально │ бактерий и грибов │

│ │- Для применения │ (суммарно) - не более │

│ │ интравагинально │ 2 │

│ │- Для введения в полости │ 10 в 1 г или в 1 мл │

│ │ уха, носа │- Отсутствие бактерий │

│ │- Для введения в │ семейства │

│ │ дыхательные пути (за │ Enterobacteriaceae в 1 │

│ │ исключением тех │ г или в 1 мл │

│ │ лекарственных средств, │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ которые должны │ aeruginosa в 1 г или в │

│ │ быть стерильными) │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие │

│ │ │ Staphylococcus aureus в│

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 3. │Для приема внутрь или │- Общее число аэробных │

│ │введения ректально │ 3 │

│ │А. Лекарственные средства │ бактерий не более 10 в│

│ │из субстанций │ 1 г или в 1 мл │

│ │синтетического │- Общее число грибов - не│

│ │происхождения │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в 1│

│ │ │ мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia │

│ │ │ coli в 1 г или в 1 мл │

│ ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ │Б. Лекарственные средства │- Общее число аэробных │

│ │из субстанций природного │ 4 │

│ │происхождения │ бактерий не более 10 в│

│ │(растительного, животного │ 1 г или в 1 мл │

│ │или минерального), за │- Общее, число грибов - │

│ │исключением лекарственных │ 2 │

│ │средств, включенных в │ не более 10 в 1 г или│

│ │Категорию 4 │ в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia │

│ │ │ coli в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Salmonella в│

│ │ │ 10 г или в 10 мл │

│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ │ aeruginosa в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие │

│ │ │ Staphylococcus aureus в│

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Энтеробактерий - не │

│ │ │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ │В. Детские лекарственные │- Общее число аэробных │

│ │средства │ бактерий не более 500 в│

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Общее число грибов - не│

│ │ │ более 50 в 1 г или в 1 │

│ │ │ мл │

│ │ │- Отсутствие бактерий │

│ │ │ семейства │

│ │ │ Enterobacteriaceae в 1 │

│ │ │ г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ │ aeruginosa в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие │

│ │ │ Staphylococcus aureus в│

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 4. │Лекарственные средства, │ │

│ │состоящие из одного вида │ │

│ │сырья (фасованная │ │

│ │продукция) или нескольких │ │

│ │(сборы), а также │ │

│ │растительное сырье │ │

│ │"ангро" │ │

│ │А. Лекарственные │- Общее число аэробных │

│ │растительные средства или │ 7 │

│ │лекарственное сырье │ бактерий не более 10 │

│ │"ангро", применяемые в │ в 1 г или в 1 мл │

│ │виде настоев и отваров, │- Общее число грибов - не│

│ │приготовленные с │ 5 │

│ │использованием │ более 10 в 1 г или в │

│ │термической обработки │ 1 мл │

│ │ │- Escherichia coli - не │

│ │ │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ ├───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ │Б. Лекарственные │- Общее число аэробных │

│ │растительные средства │ 5 │

│ │или растительное сырье │ бактерий не более 10 │

│ │"ангро", применяемые без │ в 1 г или в 1 мл │

│ │термической обработки │- Общее число грибов - не│

│ │ │ 4 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia │

│ │ │ coli - в 1 г или в 1 мл│

│ │ │- Отсутствие Salmonella в│

│ │ │ 10 г или в 10 мл │

│ │ │- Энтеробактерий - не │

│ │ │ 3 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

└──────────┴───────────────────────────┴─────────────────────────┘

Таблица 2

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА

СУБСТАНЦИЙ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ

ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

┌──────────┬───────────────────────────┬─────────────────────────┐

│ Категория│ Применение │ Рекомендуемые нормы для │

│ │ │Госфармакопеи XII издания│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│1.2. │Субстанции для │ │

│ │производства: │ │

│ │- Стерильных │- Общее число аэробных │

│ │ лекарственных, средств │ бактерий и грибов │

│ │ │ (суммарно) │

│ │- Нестерильных │ 2 │

│ │ лекарственных средств, │ не более 10 в 1 г или │

│ │ относящихся к Категории 2│ в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие бактерий │

│ │ │ семейства │

│ │ │ Enterobacteriaceae в │

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │ │

│ │- Нестерильных │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ лекарственных средств, │ aeruginosa в 1 г или в │

│ │ относящихся к Категории │ 1 мл │

│ │ 3 В │- Отсутствие │

│ │ │ Staphylococcus │

│ │ │ aureus в 1 г или в 1 мл│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│2.2. │Субстанции синтетического │- Общее число аэробных │

│ │происхождения для │ 3 │

│ │производства нестерильных │ бактерий не более 10 в│

│ │лекарственных средств │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Общее число грибов - не│

│ │ │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в 1│

│ │ │ мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia │

│ │ │ coli - в 1 г или в 1 мл│

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│3.2. │Субстанции природного │- Общее число аэробных │

│ │происхождения │ 4 │

│ │(растительного, животного │ бактерий не более 10 в│

│ │или минерального) │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Общее число грибов - не│

│ │ │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Escherichia │

│ │ │ coli - в 1 г или в 1 мл│

│ │ │- Отсутствие Salmonella в│

│ │ │ 10 г или в 10 мл │

│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ │ aeruginosa в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие │

│ │ │ Staphylococcus aureus │

│ │ │ в 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Энтеробактерий - не │

│ │ │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

├──────────┼───────────────────────────┼─────────────────────────┤

│4.2. │Вспомогательные материалы │- Общее число аэробных │

│ │(мука пшеничная, крахмал, │ 3 │

│ │тальк и т.д.) │ бактерий не более 10 в │

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Общее число грибов - не│

│ │ │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие │

│ │ │ Escherichia coli - в │

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Отсутствие Salmonella в│

│ │ │ 10 г или в 10 мл │

│ │ │- Отсутствие Pseudomonas │

│ │ │ aeruginosa в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

│ │ │- Отсутствие │

│ │ │ Staphylococcus aureus в│

│ │ │ 1 г или в 1 мл │

│ │ │- Энтеробактерий - не │

│ │ │ 2 │

│ │ │ более 10 в 1 г или в │

│ │ │ 1 мл │

└──────────┴───────────────────────────┴─────────────────────────┘

Примечания к таблицам 1 и 2:

- В фармакопейных статьях предприятия (ФСП) могут быть указаны в виде исключения и другие нормативы

- При обнаружении других патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательного материала не соответствует требованиям по показателю "Микробиологическая чистота"

РАЗДЕЛ 2

ИСПЫТАНИЕ НА Enterobacteriaceae

Дополнение к разделу: "Выявление и идентификация семейства Enterobacteriaceae" общей ФС "Испытание на микробиологическую чистоту" ГФXI издания, выпуск 2, стр. 197-198.

2.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ Escherichia coli и Salmonella

10 г или 10 мл испытуемого образца помещают в 100 мл среды N 11, гомогенизируют и инкубируют при температуре 32.5 +/- 2.5 град. C в течение, как правило, двух часов, но не более пяти. В случае, если лекарственное средство - суппозитории или растворы в маслах, в среду N 11 добавляют стерильный Твин-80 в количестве не более 5% и стеклянные бусы для эмульгирования.

Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, используя для этого среду N 3. В три пробирки с 10 мл среды N 3 вносят 1 мл гомогената в первую, 1 мл разведения 1:10 во вторую и 1 мл разведения 1:100 в третью, то есть соответственно 0.1 г, 0.01 г, 0.001 г образца. Посевы инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на плотную среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае появления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамотрицательных палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по Таблице 3.

Таблица 3

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Количество испытуемого образца			Вероятное количество бактерий в 1 г (мл)
0.1 г (мл)	0.01 г (мл)	0.001 г (мл)
1 мл гомогената	1 мл гомогената в разведении 1:10	1 мл гомогената в разведении 1:100
+	+	+	Более 1000
+	+	-	От 100 до 1000
+	-	-	От 10 до 100
-	-	-	Менее 10

Обозначения: + - наличие роста бактерий

- - отсутствие роста бактерий

Количество клеток E.coli в 1 г (мл) исследуемого лекарственного средства определяют, пользуясь также данной таблицей.

2.2. ИСПЫТАНИЕ НА НАЛИЧИЕ Escherichia coli и Salmonella

10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл питательной среды N 11 (лактозный бульон). В случае, если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубируют при температуре (32.5+2.5) град. С в течение 2-5 ч. 10 мл среды N 11 переносят в 100 мл среды N 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде N 3 (среда прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испытания продолжают.

2.2.1. ИСПЫТАНИЕ НА E.coli

Со среды N 3 делают пересев петлей на среду N 4 (агар Эндо) и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. C в течение 18-24 ч. На среде N 4 E.coli образуют, как правило, характерные малиновые колонии с металлическим блеском или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к E.coli колонии микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках среду N 1 и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч. Из пробирок с чистой культурой делают пересевы на среды N 14 (агар Симмонса) и N 15 (бульон Хоттингера), а также используют для теста на цитохромоксидазу. Через 18-24 ч инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах N 14 и N 15. Утилизацию цитрата устанавливают по изменению цвета среды N 14 из зеленого в синий. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды N 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

2.2.2. ИСПЫТАНИЕ НА ВИДЫ Salmonella

1 мл обогащенной культуры на среде N 3 вносят в пробирку с 10 мл среды N 12 (селенитовая среда) и инкубируют при (32,5 +/- 2,5) град. С в течение 16-18 ч. Делают пересев петлей на среду N 5 (висмут - сульфит агар) и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2.5) град. С в течение 24-48 часов. На среде N 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на принадлежность к Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на среду N 13 (трехсахарный агар с солями железа), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру со среды N 1. Через 18-24 часа инкубации при (32,5 +/- 2.5) град. С отмечают изменение цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной среды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода - типичном признаке видов Salmonella.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.

2.3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ <*> И РЕАКТИВЫ

1. Среда N 11 (лактозный бульон) - для предварительного

обогащения энтеробактерий

Состав:

Пептон ферментативный сухой - 8 г

Лактоза - 5 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

______________________________________________________________

рН после стерилизации 6,9 +/- 0,1

2. Среда N 12 (селенитовая среда сухая) - для накопления и выделения сальмонелл.

Готовят согласно прописи на этикетке.

3. Среда N 13 (трехсахарный агар с солями железа) - для

выявления сероводорода

Состав:

Мясной экстракт - 3 г

Дрожжевой экстракт - 3 г

Пептон - 20 г

Лактоза - 10 г

Сахароза - 10 г

Глюкоза - 1 г

Железа сульфат - 0,2 г

Натрия хлорид - 5 г

Натрия тиосульфат - 0,3 г

Феноловый красный - 0,024 г

Агар - 15 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

______________________________________________________________

Рн после стерилизации 7.3 +/- 0.2. Разливают в пробирки по 5-7 мл. Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см.

4. Среда N 14 (цитратный агар Симмонса)

Состав:

Натрия хлорид - 5 г

Магния сульфат - 0,2 г

Аммония дигидрофосфат - 1 г

Калия гидрофосфат - 1 г

Натрия цитрат - 3 г

Бромтимоловый синий - 0,08 г

Агар - 20 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

______________________________________________________________

рН после стерилизации 7,2 +/- 0.1

Приготовление: агар расплавляют при нагревании в свежеприготовленной дистиллированной воде. Все соли сначала растворяют в небольшом объеме воды, затем раствор добавляют к расплавленному агару и доводят водой до 1000 мл. Устанавливают рН, добавляют индикатор в виде 0,2% водного раствора в объеме 40 мл, хорошо перемешивают и разливают в пробирки по 5-7 мл. Стерилизуют при 121 град. С 15 мин. При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см.

5. Среда N 15 (бульон Хоттингера) - для определения индола.

Примечание: <*> - для испытания на микробиологическую чистоту можно использовать аналогичные сухие питательные среды отечественных и зарубежных производителей после их валидации.

Тест на индол

В пробирку со средой N 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача или Эрлиха и слегка встряхивают. При наличии индола наблюдают появление красного кольца на поверхности среды в пробирке.

Реактив Ковача:

Спирт амиловый или изоамиловый - 75 мл

Пара - диметиламинобензальдегид - 5 г

Кислота хлористоводородная, конц. - 20 мл

Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (в водяной бане при 50-55 град. С), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте. Реактив должен быть желтого цвета.

Реактив Эрлиха:

Спирт этиловый 96% - 95 мл

Пара - диметиламинобензальдегид - 1 г

Кислота хлористоводородная, конц. - 20 мл

Навеску альдегида растворяют в спирте и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте.

РАЗДЕЛ 3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ

НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, могут подавлять рост отдельных видов бактерий и грибов. Если исследуемое лекарственное средство оказывает ингибирующее действие на микроорганизмы, которые выявляют в нестерильных лекарственных средствах, необходимо адекватно инактивировать его во избежание неправильной оценки результатов испытания на микробиологическую чистоту. Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных средств проводят с использованием тест - микроорганизмов, полученных из Государственных коллекций.

3.1. ПОДГОТОВКА ТЕСТ - ШТАММОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

СРЕДСТВ

1. Тест - микроорганизмы

1 2

Bacillus cereus ATCC 10702 (NCTC 8035)

Escherichia coli ATCC 25922

Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453

Staphylococcus aureus ATCC 6538-P(FDA 209-P)

Candida albicans ATCC 885-653

Aspergillus niger BKM F-1119

______________________________________________________________

ATCC - Американская коллекция типовых культур

NCTC - Национальная коллекция типовых культур, Великобритания

FDA - Управление по контролю качества пищевых продуктов и

лекарственных средств, США

ГИСК - Всероссийский музей патогенных бактерий (ГИСК им. Л.А.

Тарасевича), Россия

BKM - Всероссийская коллекция микроорганизмов РАН, Россия

Тест - штаммы В. cereus, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus получают из Государственной Коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Штамм C.albicans получают из Российского Микологического Центра (г. Санкт - Петербург), штамм A.niger - из ВКМ - Всероссийской Коллекции микроорганизмов РАН (г. Москва). Культуры тест - микроорганизмов могут быть получены также из ВКПМ - Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов. Используемые тест - штаммы должны быть типичными по культурально - морфологическим и биохимическим свойствам.

Тест - штаммы бактерий хранят при температуре (5 +/- 1) град.

С в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного

вазелинового масла на среде Романова следующего состава:

Панкреатический гидролизат казеина 8.0 г

Натрия хлорид 5.0 г

Агар 10.0 г

Вода дистиллированная 1000.0 г

______________________________________________________________

рН после стерилизации 7.1 +/- 0.1

Тест - культуру C.albicans хранят под слоем вазелинового масла на среде N 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 1%. Тест - культуру A.niger хранят на среде N 2 (агар Сабуро) (Госфармакопея, вып. 2, с. 200), делая пересевы через каждые 3 месяца. Лиофилизированную культуру тест - штамма из ампулы или культуру со среды хранения переносят в пробирки с питательным бульоном: среда N 8 для бактерий, жидкая среда Сабуро - для C.albicans. Посевы на среде N 8 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течении 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро - при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч - для C.albicans. Посевы A.niger на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С до появления черных или темно - коричневых экзогенных спор (конидий) в течении 5-7 сут.

Перед определением антимикробного действия нестерильных лекарственных средств культуры тест - штаммов бактерий отсевают на среду N 8 (питательный бульон) и инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 18-24 ч.

Культуры грибов выращивают заранее: C.albicans - на жидкой среде Сабуро за 48 ч, а A.niger - на среде N 2 за 5-7 сут до начала определения.

3.2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РАСТВОРЫ

(Государственная фармакопея XI издания,

выпуск 2, с. 193, 201, 208-209)

Среда N 8 - для выращивания бактерий.

Жидкая среда Сабуро - для выращивания Candida albicans.

Среда N 2 (агар Сабуро) - для выращивания Aspergillus niger.

Среды NN 3-5 - для идентификации бактерий

семейства Enterobacteriaceae.

Среда N 9 - для идентификации Pseudomonas

aeruginosa.

Среда N 10 - для идентификации Staphylococcus

aureus.

Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном, рН 7.0

3.3. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

Готовят разведения лекарственного средства 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, используя фосфатный буферный раствор (для приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5% Твина-80).

Бульонные культуры бактерий и C.albicans разводят фосфатным буферным раствором не менее, чем 1:1000. Культуру A.niger смывают со скошенного агара фосфатным буферным раствором с 0.05% Твина-80. Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру

Горяева или чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации

3 4

10 - 10 КОЕ/мл.

Испытание проводят представленными в 3.3.1. и 3.3.2. методами определения антимикробного действия.

3.3.1. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ГОСФАРМАКОПЕИ XI

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в чашки Петри диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по 0.2 мл взвеси культуры B.cereus, a в оставшиеся - по 0.2 мл культуры C.albicans и A.niger. В чашки с B.cereus вносят по 7-10 мл расплавленной среды N 1 при температуре (47.5 +/- 2.5) град. С, в чашки с культурами C.albicans и A.niger - то же количество среды N 2.

Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в пробирки с 10 мл жидкой среды - N 3 и N 8. В пробирки со средой N 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры E.coli, в пробирки со средой N 8 - по 1 мл взвеси культур P.aeruginosa и S.aureus, каждую отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений лекарственного средства вносят такое же количество буферного раствора.

Посевы на средах N 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 2 сут (среды N 3, 8) и 5 сут (среда N 1). Посевы на среде N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/-2.5) град. C в течение 5 сут. В случае, если при внесении лекарственного средства в жидкие питательные среды (N 3, N 8) образуется помутнение, препятствующее учету результатов, делают пересев со среды N 3 на среду N 4 (агар Эндо), а со среды N 8 - на среды N 9 и N 10. При росте типичных колоний E.coli (среда N 4), P.aeruginosa (среда N 9) и S.aureus (среда N 10) отмечают наличие роста тест - микроорганизма.

3.3.2. МЕТОД РЕПЛИКАЦИЙ (для водонерастворимых лекарственных средств). В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого лекарственного средства. В контрольные чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют для получения разведения. В чашки Петри (как в эксперименте, так и в контроле) добавляют по 15-20 мл расплавленной и охлажденной до (47.5 +/- 2,5) град. С среды N 1, в другие - такое же количество среды N 2 и быстро перемешивают. После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды.

На поверхность агара бактериологической петлей или репликатором наносят бляшками инокулят каждого тест - штамма бактерий и грибов на среды N 1 и N 2 соответственно.

Чашки со средой N 1 инкубируют при температуре (32.5 +/- 2.5) град. С в течение 48 ч. Чашки со средой N 2 инкубируют при температуре (22.5 +/- 2.5) град. С в течение - 3-5 сут.

Учет результатов. После окончания сроков инкубации посевов (появление типичного роста тест - микроорганизмов в контрольных чашках без лекарственного средства) отмечают наличие или отсутствие роста тест - штаммов бактерий и грибов на средах, в которые вносили различные разведения лекарственного средства.

Наличие такого же роста тест - микроорганизма, как в контроле, обозначают знаком "+", отсутствие роста - знаком "-", слабый или замедленный рост - знаком "+/-".

Отсутствие роста тест - микроорганизма на среде с препаратом свидетельствует о том, что исследуемый препарат в данном разведении обладает антимикробным действием в отношении определенного тест - микроорганизма.

3.3.3. НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ

Для устранения антимикробного действия лекарственного средства используют различные методы: - 1) увеличивают разведение лекарственного средства, 2) добавляют необходимое количество соответствующего специфического инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганизмов - контаминантов (например, бета - лактамазу - для пенициллинов и цефалоспоринов, пара - аминобензойную кислоту - для сульфаниламидов), 3) применяют неспецифический инактиватор следующего состава, используемого в качестве растворителя:

Твин-80 - 30 г

Лецитин яичный - 3 г

L-гистидина гидрохлорид - 1 г

Пептон (мясной или казеиновый) - 1 г

Натрия хлорид - 4.3 г

Калия фосфат однозамещенный - 3.6 г

Натрия фосфат двузамещенный - 7.2 г

Воды дистиллированной - 1000.0 мл

Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. Если антимикробное действие полностью не устраняется, увеличивают концентрацию Твина-80 или лецитина.

Директор ИГКЛС НЦЭГКЛС

Минздрава России

профессор, академик МАИ

Н.С.ЕВТУШЕНКО

10 апреля 2001 г.

Председатель Государственного

Фармакопейного комитета,

профессор, чл.- корр. РАМН

А.П.АРЗАМАСЦЕВ

4 июля 2001 г.

Главный Ученый секретарь

Государственного Фармакопейного

комитета, доктор фарм. наук

В.Л.БАГИРОВА

4 июля 2001 г.