"Методические рекомендации по определению устойчивости шигелл к воздействию высоких температур" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

Утверждаю

Заместитель министра

здравоохранения РСФСР

К.И.АКУЛОВ

12 июня 1985 года

Согласовано

Заместитель начальника

Главного управления НИИ и КНИ

В.М.ХРИСТЮК

7 июня 1985 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ УСТОЙЧИВОСТИ ШИГЕЛЛ К ВОЗДЕЙСТВИЮ

ВЫСОКИХ ТЕМПЕРАТУР

Методические рекомендации разработаны в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского МЗ РСФСР.

Введение

Заболеваемость острыми кишечными инфекциями, в том числе дизентерией, продолжает оставаться в настоящее время на относительно высоком уровне. Для современной дизентерии, обусловленной в основном шигеллами Зонне, характерно облегчение клинического проявления инфекции, что влечет за собой дополнительные возможности ее неконтролируемого распространения. Этому способствует также заметное повышение устойчивости шигелл к различным факторам внешней среды и к более длительному сохранению микроба вне человеческого организма.

В связи с этим особую актуальность представляет изучение свойств возбудителя, способствующих сохранению его во внешней среде. Одним из таких свойств является устойчивость шигелл к воздействию высоких температур. Однако, имеющиеся данные об устойчивости дизентерийных бактерий к воздействию высоких температур весьма противоречивы (см. табл. 1). Так, по данным Кука Г.А. (1951) гибель дизентерийных бактерий при 60 °С наступает через 1 - 2 минуты. Пяткин К.Д. (1951), Вашков В.И. (1977) указывают, что шигеллы выдерживают прогревание при 60 °С в течение 10 - 20 минут. Вольне И.М. с соавторами (1967) отмечает, что гибель дизентерийных бактерий при 60 °С наступает через 30 - 40 минут. Эти данные свидетельствуют о том, что среди шигелл признак устойчивости к воздействию высоких температур варьирует у различных штаммов в широких пределах.

Таблица 1

ДЛИТЕЛЬНОСТЬ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ШИГЕЛЛ

ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВЫСОКИХ ТЕМПЕРАТУР (ДАННЫЕ ЛИТЕРАТУРЫ)

┌──────────────┬──────────┬──────────┬────────────────────────────────────┐

│ Автор, год │Вид и тип │Количество│ Срок выживаемости в минутах при │

│ │ шигелл │ изучен. │ температурах: │

│ │ │ штаммов ├────────┬───────┬───────┬─────┬─────┤

│ │ │ │59 - 60°│ 70° │ 80° │ 85° │ 90° │

├──────────────┼──────────┼──────────┼────────┼───────┼───────┼─────┼─────┤

│Кук Г.А. │дизентер. │не указано│1 - 3 │- │- │- │- │

│1951 г. │бактерии │ │ │ │ │ │ │

├──────────────┼──────────┼──────────┼────────┼───────┴───────┴─────┼─────┤

│Пяткин К.Д. │-"- │-"- │10 - 20 │не изучались │ │

│1951 г. │ │ │ │ │ │

├──────────────┼──────────┼──────────┼────────┼───────┬───────┬─────┼─────┤

│Вольне И.М. │-"- │-"- │30 - 40 │ │-"- │ │ │

│1967 г. │ │ │ │ │ │ │ │

│Вашков В.И. │-"- │-"- │10 │ │-"- │ │ │

│1977 г. │ │ │ │ │ │ │ │

│Троп И.Е. │шигеллы │ │ │ │ │ │ │

│1973 г. │Зонне │60 │- │30 - 60│15 - 45│ │ │

│ │Флекснер │90 │- │5 - 30 │1 - 30 │ │ │

│ │Ньюкестл │30 │- │15 - 45│5 - 45 │ │ │

│Соколова Н.Ф. │шигеллы │110 │до 85 │5 - 15 │ │ │ │

│1977 г. │Зонне │ │ │ │ │ │ │

│Гриценко Т.Т. │шигеллы │160 │60 мин. │ │30 - 45│- │2 - 3│

│ │Зонне │ │11% │ │11% │ │11% │

│ │ │ │культур │ │ │ │ │

│Васильева И.Б.│шигеллы, │ │ │ │ │ │ │

│1980 г. │выдел. в │ │ │ │ │ │ │

│ │1976 г. │ │ │ │ │ │ │

│ │Флекснер │166 │- │15 - 60│ │ │ │

│ │ │ │ │30% │ │ │ │

│ │ │ │ │культур│ │ │ │

│ │Зонне, │72 │- │16,7% │ │ │ │

│ │выделенные│ │ │ │ │ │ │

│ │в 1967 г. │ │ │ │ │ │ │

│ │Флекснер │65 │- │9,2% │ │ │ │

│ │Зонне │35 │- │42,8% │ │ │ │

│Данные авторов│шигеллы │ │ │ │ │ │ │

│1982 г. │Зонне, │12 │90 │30 │30 │2 - 3│ │

│ │Флекснер, │13 │90 │30 │30 │3 - 5│ │

│ │выделенные│ │ │ │ │ │ │

│ │при груп- │ │ │ │ │ │ │

│ │повых за- │ │ │ │ │ │ │

│ │болеваниях│ │ │ │ │ │ │

└──────────────┴──────────┴──────────┴────────┴───────┴───────┴─────┴─────┘

Согласно рекомендации Вашкова В.И. (1952), к термоустойчивым следует относить бактерии кишечной группы, сохраняющие жизнеспособность после прогревания при 59 °С выше 15 - 20 минут.

В течение последнего десятилетия описаны штаммы шигелл, обладающие высокой терморезистентностью. Так, они выдерживали прогревание при 59 °С в течение 60 - 85 минут, при 70 °С в течение 15 - 80 минут. Описаны штаммы, выдерживающие прогревание при 80 °С в течение 30 - 45 минут. Были даже выявлены штаммы, выдерживающие несколько секунд прогревание при 90 °С (Троп И.Е., Филимонова Т.В., 1973; Соколова Н.Ф. с соавт., 1977; Гриценко Т.Т. с соавт., 1977; Тарадий А.К. с соавт., 1977; Васильева И.В., 1980 г.).

Отмечено, что доля термоустойчивых штаммов, циркулирующих на отдельной территории, может быть различной в разные годы. Так, Васильева И.Е. с соавт. (1980 г.), изучая шигеллы Зонне, выделенные в 1967 и 1976 гг. в г. Харькове, обнаружила среди них 42,8 и 16,7% терморезистентных культур соответственно.

Устойчивость дизентерийных бактерий к воздействию высоких температур зависит от концентрации микробных тел в исследуемом субстрате: чем выше концентрация, тем длительнее сохраняется жизнеспособность бактерий (Гриценко Т.Т. с соавт., 1977). Представляют интерес данные о том, что при прогревании в молоке шигеллы сохраняют жизнеспособность дольше, чем при прогревании в физиологическом растворе, и что шигеллы Зонне, находящиеся во II фазе, были менее устойчивыми к нагреванию, чем шигеллы Зонне, находившиеся в I фазе (Соколова Н.Ф. с соавт., 1977 г.).

Имеются сведения о том, что терморезистентные штаммы являются полиантибиотикорезистентными и обладают трансмиссивным R-фактором (Троп И.Е., Филимонова Т.В., 1973; Васильева И.Б. с соавт., 1980 г.).

Терморезистентные штаммы, типичные по культуральным, биохимическим и серологическим свойствам, обладают высокой вирулентностью при испытании на животных (Гриценко Т.Т. с соавт., 1977; Соколова Н.Ф. с соавт., 1977 г.).

Нами были изучены штаммы шигелл Зонне и Флекснера, выделенные в 1979 - 81 гг. во время четырех групповых заболеваний дизентерией. Культуры были выделены лабораториями СЭС от больных острой дизентерией, а также из сырого молока, из пастеризованных молочных продуктов, на фильтре после контроля сырого молока на механическую загрязненность и в смывах с поверхности оборудования в цехе молочного завода.

Все культуры были типичны по культуральным, биохимическим и серологическим свойствам.

Изучение устойчивости этих культур к воздействию высоких температур показало, что они сохранили жизнеспособность при прогревании при 59 °С в течение 90 минут, выдерживали прогревание при температурах 70 °С и 80 °С в течение 20 - 30 минут, при температуре 85 °С 2 - 5 минут.

При испытании на чувствительность к II антибиотикам было установлено, что все полученные штаммы были полиантибиотикорезистентными. Все культуры, выделенные от больных, были вирулентными при испытании на модели шигеллезного кератоконъюнктивита у морских свинок. Культуры, выделенные из объектов окружающей среды, были в этой пробе невирулентными.

Изучение эпидемиологических материалов 4-х расшифрованных групповых заболеваний дизентерией, обусловленных инфицированием молочных продуктов термоустойчивыми штаммами, позволило выявить их некоторые эпидемиологические особенности.

1) Установлено, что в первые дни начала заболеваемости резко снижена интенсивность эпидемического процесса. Число больных при этом в 3 - 5 раз меньше обычного для аналогичных условий заражения.

2) Характерно, что за медицинской помощью в первые дни обращались преимущественно дети с клиническим проявлением начала заболевания по типу пищевой токсикоинфекции. Однако, несмотря на острое начало, течение заболевания у основной массы этих больных легкое.

3) При лабораторном обследовании контактных лиц в очагах выявлено большое число бактериовыделителей среди взрослых и детей без клинических проявлений заболевания, т.е. процент бактериологически подтвержденных заражений был выше обычного для групповых заболеваний, обусловленных молочным фактором. Остальные эпидемиологические признаки групповых заболеваний соответствовали обычным представлениям.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что в настоящее время среди возбудителей дизентерии имеются штаммы, устойчивые к воздействию высоких температур, что эти штаммы представляют реальную эпидемиологическую опасность, т.к. способны вызывать групповые заболевания при попадании в пищевые, особенно молочные продукты.

Этим определяется необходимость изучения устойчивости к воздействию высоких температур культур шигелл, выделяемых не только при расследовании групповых заболеваний дизентерией, но и при единичных случаях заболеваний.

В литературе описано несколько методик определения термоустойчивости бактерий, отличающихся объемом, в котором производят прогрев микробной взвеси, временем выдержки и температурой нагрева, способом нагрева и способом высева прогретой суспензии на различные питательные среды, а также оценкой результатов.

Настоящие методические рекомендации имеют целью предложить для бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологических станций методику определения устойчивости шигелл к воздействию высоких температур с тем, чтобы унифицировать метод их выявления и изучить частоту выделения.

В настоящих методических рекомендациях предлагается методика, апробированная авторами и практическими лабораториями СЭС. В основу методики положена методика ВНИИДиС с некоторыми изменениями с целью сделать ее более удобной для использования практическими лабораториями СЭС.

Использование данных методических рекомендаций лабораториями СЭС при расследовании групповых заболеваний и отдельных случаев заболеваний дизентерией должно способствовать выяснению вопросов о частоте распространения термоустойчивых штаммов шигелл на различных территориях страны в различные времена года, их роли в эпидемиологии современной дизентерии, а также возможности использования этого признака как дополнительного маркера при расследовании эпидемических очагов.

Методика исследования

Методика исследования устойчивости шигелл к воздействию высоких температур основана на выдерживании микробной взвеси шигелл в физиологическом растворе или молоке при заданной температуре в течение определенных промежутков времени. По окончании экспозиции проводят посев микробной взвеси на соответствующие питательные среды.

Для проведения исследования необходимы:

1. Водяная баня с терморегулятором, с подогревом до 85 °С. Можно использовать аппарат для инактивирования сыворотки или ультратермостат.

2. Термометры от 0° до 100 °С.

3. Пробирки, пипетки мерные на 10 мл и 1 мл и пастеровские.

4. Питательные среды: мясопептонный бульон, сухой питательный агар с эозином и метиленовым синим.

Подготовка материала для исследования

Устанавливают в водяной бане заданную температуру. Пробирки соответственно числу испытуемых культур с 9 мл стерильного молока или физиологического раствора помещают в водяную баню таким образом, чтобы уровень воды в водяной бане был на 2 - 3 см выше уровня жидкости в пробирках. Одна из пробирок служит контролем. В нее помещают термометр для наблюдения за уровнем температуры в пробирке. Через несколько минут, когда температура в пробирках достигает заданного уровня, можно начинать определение термоустойчивости бактериальных культур.

Для приготовления микробной взвеси суточную бульонную культуру шигелл в концентрации 100 млн. микробных клеток в мл вносят в пробирки с 9 мл молока или физиологического раствора, находящиеся в водяной бане, в количестве 1 мл с таким расчетом, чтобы в испытуемой взвеси содержалось 10 млн. микробных тел в мл.

Ход исследования

После того как температура в пробирках, помещенных в водяную баню, достигла заданного уровня, в них аккуратно вносят испытуемые культуры шигелл. Следует обращать особое внимание на то, чтобы капля культур не попала на стенки пробирки, т.к. это может исказить полученные результаты. Через определенные промежутки времени из прогретых пробирок с микробной взвесью производят высев 0,5 - 1,0 мл микробной взвеси в мясопептонный бульон. Материал забирают каждый раз стерильной пастеровской пипеткой. После термостатирования посевов при 37 °С в течение 18 - 20 часов просматривают пробирки на наличие бактериального роста. Для дальнейшей идентификации культур проводят высев из бульона на плотную питательную среду Левина (агар с эозин-метилен синий). Исследование выросших колоний проводят по обычной бактериологической методике.

В связи с тем, что к термоустойчивым относят бактерии кишечной группы, выдерживающие прогревание при 59 °С в течение 15 - 20 минут, начинать исследование следует с этой температуры. Это позволит выявить терморезистентные штаммы. Затем выявленные термоустойчивые штаммы следует испытать на степень их термоустойчивости.

Рекомендуемые сроки экспозиции:

При температуре 59 °С - 10, 20, 30 и 40 минут.

При температуре 70 °С - 5, 15, 30 минут.

При температуре 80 °С - 5, 15, 30 минут.

При температуре 85 °С - 1, 3, 5 и 10 минут.

Учет результатов

Результаты учитывают через 18 - 20 часов термостатирования при 37 °С по помутнению или наличию придонного роста в пробирках с мясопептонным бульоном, в которые была внесена взвесь культуры бактерий после прогревания.

Окончательный ответ дают после идентификации культур, выросших после пересева из бульона на плотные питательные среды.

Пример формы ответа:

1. Культура шигелл Зонне не является термоустойчивой и погибает при прогревании при температуре 59 °С через 10 минут.

2. Культура шигелл Зонне является термоустойчивой и сохраняет жизнеспособность после прогревания при температуре:

59 °С - 30 минут;

70 °С - 15 минут;

30 °С - 5 минут.

Заключение

Необходимость издания настоящих методических рекомендаций обусловлена тем, что в последние годы на некоторых территориях нашей страны выделены и описаны штаммы шигелл, устойчивые к воздействию высоких температур. Выделение таких штаммов во время групповых заболеваний дизентерией свидетельствует об их реальной эпидемиологической опасности. Унификация методики определения термоустойчивости шигелл и использование ее в широкой практике поможет выяснить вопросы о частоте распространения этих штаммов при групповых заболеваниях и при спорадической заболеваемости дизентерией и может оказать помощь эпидемиологам при расшифровке причин заболеваемости дизентерией и разработке соответствующих профилактических мероприятий.