Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 января 2008 г.
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2321-08
1. Разработаны: Государственным
учреждением Научно-исследовательским институтом питания Российской Академии
медицинских наук (В.А.Тутельян, С.А.Хотимченко, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина,
Ж.Н.Шурышева), Федеральным Государственным учреждением науки Государственным
научным центром прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
(И.А.Дятлов, М.В.Храмов), Федеральным Государственным учреждением науки
"Федеральный Научный Центр гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана" Роспотребнадзора
(Г.М.Трухина), Управлением Роспотребнадзора по г. Москве (Н.Н.Филатов,
И.И.Пискарева), ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве"
(О.В.Захарова, Н.Я.Салова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией
по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной
службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Протокол от 06.12.2007 N 3.
3. Утверждены и введены в действие
Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека Г.Г.Онищенко 24.01.2008.
4. Введены впервые.
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие Методические указания
устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий рода Campylobacter
- возбудителей пищевых токсикоинфекций и острых кишечных заболеваний в пищевых
продуктах при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического
надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых
отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.
Проведение контроля на бактерии рода
Campylobacter позволит оценить степень загрязненности пищевой продукции и
получить реальную картину ситуации в Российской Федерации, дать оценку
эффективности принимаемых мер в целях обеспечения ее безопасности в плане новых
и вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем передачи для здоровья
и жизни человека.
1.2. Методические указания предназначены
для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и
безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых
в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым
путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими
лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности
пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.
1.3. Настоящие Методические указания
устанавливают методы определения бактерий рода Campylobacter в
продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения на основе
бактериологического анализа (качественного и количественного с идентификацией
до вида), а также фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа
(качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов C.
jejuni, C. coli, C. lari, обусловливающих основную часть ОКИ
кампилобактериозной природы у человека).
2. СУЩНОСТЬ МЕТОДОВ
2.1. Бактериологический метод определения
бактерий рода Campylobacter основан на высеве определенных количеств продукта в
жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с
последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании
посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать
типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением
чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных
условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности
морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность
к видам бактерий рода Campylobacter.
2.2. Метод фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании
бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами,
адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая
фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении
антител, меченных щелочной фосфатазой, и флюоресцентно-меченого субстрата и измерении
флюоресценции продукта гидролиза флюоресцентно-меченого субстрата
(4-метил-умбелиферилфосфата), который катализируется щелочной фосфатазой.
Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм.
2.2.1. Для фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические анализаторы,
позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферона при 450 нм,
и тест-наборы, в состав которых входят сенсибилизированные антителами
наконечники, используемые в качестве пипетирующего устройства, и стрипы из 10
лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа,
зарегистрированные в РФ в установленном порядке. Предел обнаружения бактерий
рода Campylobacter при использовании данного метода соответствует 1 клетке на
25 г (при наличии предобогащения).
2.2.2. Для определения бактерий рода
Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа
используют анализаторы иммуноферментные и тест-наборы, зарегистрированные в РФ
в установленном порядке и обеспечивающие проведение измерений с
характеристиками специфичности и чувствительности, указанными в п.п. 1.3 и
2.2.1.
3. АППАРАТУРА,
МАТЕРИАЛЫ, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА,
РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
3.1. Аппаратура и
инструментарий
Анализатор
потенциометрический, погрешность
ГОСТ 19881-74
измерений pH +/-
0,01
Шкаф сушильный
стерилизационный ШСС-80 П или ТУ
9452-010-00141798-2002
других марок,
позволяющий поддерживать
температуру (160
+/- 5) град. C
Термостат,
позволяющий поддерживать рабочую ТУ
9452-002-00141798-97
температуру 37
град. C с отклонением от
заданной +/- 1
град. C
Термостат,
позволяющий поддерживать рабочую ТУ
9452-002-00141798-97
температуру 42
град. C с отклонением от
заданной +/- 1
град. C
Баня водяная с
подогревом ГОСТ
12026-76
Весы
лабораторные общего назначения, 2 и 4
ГОСТ 24104-88Е
класса точности,
с наибольшим пределом
взвешивания 200
г
Микроскоп
биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, ТУ
9443-076-07502348-96
МБР-1, МБР-3,
МБС
Стерилизаторы
паровые медицинские или ГОСТ Р
500444-92
аналогичные
Дистиллятор,
обеспечивающий качество ТУ
4952-007-33142130-2000
дистиллированной
воды в соответствии
с ГОСТ 6709-90
Облучатель
бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ
16-535-84
или других видов
Холодильник
бытовой электрический с ГОСТ
16317-87
морозильной
камерой
Пинцет
медицинский
ГОСТ 21241-89
Ножницы
медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель
хирургический, 15 см
ГОСТ 21240-89
Штативы для
пробирок
Часы
механические сигнальные
ГОСТ 3145-84
Электроплитка ГОСТ
14919-83
Универсальная лабораторная
центрифуга
(20000 x g) с
охлаждением типа SIGMA 2-16К
Стационарный
анаэробный инкубатор или
CO2-инкубатор
(Flow Lab.)
или система для
анаэробного культивирования
с манометром
(анаэростат) (HiMedia LE 001)
Отсасыватель
хирургический типа ХО-450-1 ТУ
РЯГК 941624.001
ТУ АО
"Элема" (г. Новосибирск)
или стерильные
газонепроницаемые пакеты
для
контейнеров-анаэростатов HiMedia LE 010
Зажимы для
контейнеров анаэростатов HiMedia
LE 011
Контейнеры для
анаэробного культивирования
HiMedia LE 007,
LE 008 или LE 009
Гомогенизатор
перистальтического типа "Микс-2",
"Сломайкер"
или других наименований AES Lab.,
Cat.N AESAP
1066.
Автоматический
ИФА-анализатор для
фермент-связанного
флюоресцентного
иммуноанализа
типа VIDAS(R) или
miniVIDAS(R),
или с аналогичными
характеристиками,
подобный BioMerieux,
Франция, или
аналог.
3.2. Лабораторная
посуда и материалы
Бумага
фильтровальная лабораторная ГОСТ 120260-76
Бутылки
стеклянные для химических реактивов ГОСТ 15844-92
Кастрюли
эмалированные ГОСТ
24778-81
Марля
медицинская ГОСТ
9412-77
Колбы
плоскодонные конические или круглые разной ГОСТ 1770-74
вместимости
Флаконы
стеклянные ТУ
64-2-281-84
Воронки
стеклянные ГОСТ
25336-82
Вата медицинская
гигроскопическая
ГОСТ 5556-81
Пипетки емкостью
1, 2, 5 и 10 куб. см
ГОСТ 29227-91
Пробирки типов
П1, П2
ГОСТ 25336-82
Стекла
предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Спиртовки
лабораторные стеклянные ГОСТ 23932-90
Термометр
ртутный с диапазоном измерения от 0 до ГОСТ 13646-68
100 град. C
(цена деления шкалы 1 град. C)
Термоконтейнер
(сумка-холодильник)
Петли
бактериологические
Чашки
биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Маркеры по
стеклу
Отраслевой
стандартный образец мутности ОСО 42-28-85-04П
на 10 ед. НИИ
СКМБП им. Тарасевича Роспотребнадзора
Газогенераторные
пакеты для кампилобактерий объемом 3,5
литра HiMedia LE
002 D
Смесь газов:
кислорода (O2) - 5%, двуокиси углерода
ТУ 6-16-2956-92
(CO2) - 10%,
азота (N2) - 85% в баллонах
Обхваты
резиновые
Пакет для
гомогенизации с фильтром, подобный
BioMerieux,
Франция, или аналог
Набор реагентов
для определения бактерий рода
Campylobacter типа VIDAS(R) Campylobacter (CAM)
или с
аналогичными характеристиками, подобный
BioMerieux,
Франция, или аналог.
Допускается использование другой
аппаратуры, инструментария, лабораторной посуды и материалов аналогичного
назначения для проведения исследований в соответствии с данным документом.
Аппаратура, инструментарий, лабораторная посуда и материалы импортного
производства должны иметь разрешение уполномоченных органов Российской
Федерации на их применение.
3.3. Реактивы и
питательные среды
3.3.1. Реактивы, компоненты сред
Натрий гиппурат
(содержание основного вещества
99%) Acros 41170
Нингидрин
(содержание основного вещества 99%)
Riedel-de Haen
33437
Раствор перекиси
водорода 3%-й водный
Дистиллированная
вода ГОСТ
6709-90
Диски для
выявления оксидазы HiMedia DD018
Натрий
фосфорнокислый двухзамещенный Na2HPO4
ГОСТ 4193-75
(безводный), чда
Натрий
фосфорнокислый однозамещенный гидрат
ГОСТ 4198-75
NaHPO4 х H2O
Натрия
хлорид
ГОСТ 4233-77
Набор реактивов
для окраски по Граму
Масло
иммерсионное для микроскопии
ГОСТ 31739-78
Спирт этиловый
ректификованный ГОСТ
5962-67
Агар-агар
микробиологический
ГОСТ 17206-96
Пептон ГОСТ
13805-76
Мясной экстракт
Кровь баранья
дефибринированная стерильная
ЗАО
"Эколаб", Россия
Натрий
пировинограднокислый, ч
ТУ 6-09-08-990-75
Железо (II)
сернокислое
ГОСТ 4148-66
Натрий
метабисульфит
ГОСТ 10.575-76
Или ростовая
(аэротолерантная) добавка для
кампилобактерий
следующего состава:
натрия пируват -
125,0 мг, натрия
метабисульфит -
125,0 мг, железа (II) сульфат -
125,0 мг HiMedia
FD 009
Добавка
антибиотиков для кампилобактерий-I
(по
Блэйзер-Вонг): полимиксин В - 1250 МЕ,
ванкомицин - 5,0
мг, триметоприм - 2,5 мг,
амфотерицин В -
1,0 мг, цефалотин - 7,5 мг
HiMedia FD006
Добавка
антибиотиков для кампилобактерий-II
(по Бутцлеру),
модифицированная, следующего
состава:
банутрацин -
12500 МЕ, колистина сульфат - 5000
ЕД, амфотерицин
В - 5,0 мг, цефазолина натриевая
соль - 7,5 мг,
новобиоцин - 2,5 мг HiMedia FD165
Добавка
антибиотиков модифицированная III
(по Дойлу): ванкомицин
- 7,50 мг, триметоприма
лактат - 2,50
мг, амфотерицин В - 5,00 мг,
полимиксина В
сульфат - 10000 МЕ HiMedia FD159
Добавка
антибиотиков для кампилобактерий-IV
(по Престону)
модифицированная: полимиксина В
сульфат - 2500
МЕ, рифампицин - 5,00 мг,
триметоприма
лактат - 5,00 мг, амфотерицин В -
5,00 мг HiMedia
FD158
Добавка
антибиотиков для кампилобактерий-V:
цефоперазон -
16,00 мг HiMedia FD067
Добавка
антибиотиков для селективного выделения
термофильных
кампилобактерий (САТ): цефоперазон -
4,0 мг, тейкопланин
- 2,0 мг, амфотерицин В -
5,0 мг HiMedia
FD145
Селективная
добавка антибиотиков для ТУ
9398-057-7895326-2007
кампилобакагара:
полимиксин В - 1 мг,
рифампицин - 5
мг, амфотерицин В - 1,5 мг,
ристомицин - 5
мг, ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск)
Диски с
цефалотином (Ch 30) HiMedia SD050
Диски с
налидиксовой кислотой (Na 30)
HiMedia SD050
Тетраметил-пара-фенилендиамин
(гидрохлорид) ТУ 6-09-1903-77
(C10H16N2 х
2HCl)
Ацетон
ГОСТ 2768-84
Спирт бутиловый
нормальный, чда ГОСТ
6006-51
Кислота соляная,
хч ГОСТ
3118-77
Натрия
гидроокись, чда
ГОСТ 4328-77.
3.3.2. Среды питательные
3.3.2.1. Обогащающие бульоны
Основа бульона
для накопления кампилобактерий
(Престона)
HiMedia M 899
Основа бульона
для накопления кампилобактерий
(Дойла) HiMedia
M 916
Основа бульона
для бруцелл HiMedia M 348.
3.3.2.2. Агаровые среды
Основа агара
Престон HiMedia M 939
Основа угольного
селективного агара для
кампилобактерий
HiMedia M 887
Основа
колумбийского кровяного агара HiMedia
тм
M 144 BD BBL
Основа агара
Мюллера-Хинтона HiMedia M 173
тм
BD BBL
Кампилобакагар ТУ
9398-057-7895326-2007
"Питательные
среды", ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск)
Трехсахарный
железосодержащий агар (ТСА)
HiMedia M 021/М
0211
Или среда N 13
Трехсахарный железосодержащий ТУ
9398-013-7895326-2006.
агар ФГУН ГНЦ
ПМБ (Оболенск)
Допускается использование других
коммерческих питательных сред и диагностических препаратов аналогичного состава
и назначения для проведения исследований в соответствии с данным документом.
Питательные среды и диагностические препараты импортного производства должны
иметь разрешение уполномоченных органов Российской Федерации на их применение.
При их приготовлении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.
3.3.2.3. Тест-системы биохимические для
видовой идентификации API CAMPY, BioMerieux (или тест-системы аналогичного
назначения других изготовителей, обеспечивающие выполнение видовой
идентификации кампилобактерий).
3.4. Тест-штаммы
микроорганизмов
Тест-штаммы Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli, Campylobacter lari, типичные по культуральным,
морфологическим и биохимическим свойствам, паспортизированные и депонированные
в установленном порядке, ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск).
Штаммы необходимо сохранять в лиофильно
высушенном виде. При регулярном использовании допускается сохранять в
полужидком агаре для бруцелл в пробирках с плотно притертыми пробками, в
защищенном от света месте, при температуре (5 +/- 1) град. C с еженедельным
пересевом.
3.5. Состав
тест-набора для фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа
В состав тест-набора входят материалы и
реагенты в количестве, достаточном для исследования 26 проб и 4 контрольных
образцов, состоящий из следующих компонентов:
|
30 стрипов для
определения
бактерий рода
Campylobacter
|
STR
|
Готовы к
использованию
|
|
30 наконечников
|
SPR
|
Готовы к
использованию. На внутреннюю
поверхность наконечников нанесены антитела
к поверхностным антигенам Campylobacter
|
|
Стандарт
(1 фл. по 6 мл)
|
S1
|
Готов к
использованию. Очищенный и инактиви-
рованный антиген Campylobacter + консервант
+ белковые стабилизаторы. Доверительный
интервал указан на калибровочной карте
|
|
Положительный
контроль
определения
(1 фл. по 6 мл)
|
C1
|
Готов к
использованию. Очищенный и инактиви-
рованный антиген Campylobacter + консервант
+ белковые стабилизаторы. Доверительный
интервал указан на калибровочной карте
|
|
Отрицательный
контроль
определения
(1 фл. по 6 мл)
|
C2
|
Готов к
использованию. Забуференный
физиологический раствор - твин + консервант.
Максимальное приемлемое значение указано на
калибровочной карте
|
|
1
калибровочная
карта
|
Лист спецификаций
с фабричными установками
для калибровки тестов
|
|
1 инструкция
|
3.5.1. Состав стрипа для
фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Каждый стрип в тест-наборе
состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код,
несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга
перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет
собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат
реактивы для анализа. Распределение лунок в стрипе:
|
Лунка
|
Реактивы
|
|
1
|
Лунка для
внесения образца: внесите 0,5 куб. см
бульона обогащения (обогащенной культуры), стандарта
или контроля
|
|
2
|
Предпромывочный
буфер (400 куб. мм): забуференный
физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л)
pH 7,6 + консервант
|
|
3 - 4 - 5 -
7 - 8 - 9
|
Промывочный буфер
(600 куб. мм): забуференный
физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л)
pH 7,6 + консервант
|
|
6
|
Конъюгат (400
куб. мм): антитела (IgG) к
Campylobacter, меченные щелочной фосфатазой +
консервант
|
|
10
|
Кювета,
содержащая субстрат (300 куб. мм):
4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 М/л) + диэтаноламин
(0,62 М/л или 6,6%, pH 9,2) + консервант
|
3.5.2. Для определения бактерий рода
Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа
допускается использование другого оборудования и тест-наборов аналогичного
назначения, зарегистрированных в РФ в установленном порядке, с аналогичными
характеристиками чувствительности и специфичности.
4. ПОДГОТОВКА К
АНАЛИЗУ
4.1. Приготовление
растворов и реактивов
4.1.1. Изотонический раствор хлорида
натрия
Натрия хлорид - 85,0 г.
Дистиллированная вода - 1,0 л.
Растворить натрия хлорид в дистиллированной
воде, стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15
мин.
4.1.2. Реактив для обнаружения оксидазы
Тетраметил-пара-фенилендиамин
(гидрохлорид) - 0,1 г.
Стерильная дистиллированная вода - 10 мл.
Растворить тетраметил-пара-фенилендиамин
(гидрохлорид) в дистиллированной воде, использовать непосредственно после
приготовления.
4.1.3. Фосфатный буферный раствор для
приготовления раствора гиппурата натрия
Двухзамещенный фосфорнокислый натрий
Na2HPO4 (безводный) - 12,0 г.
Однозамещенный фосфорнокислый натрий
NaHPO4 х H2O - 2,2 г.
Натрия хлорид - 85,0 г.
Дистиллированная вода - 1,0 л.
Растворить ингредиенты в небольшом объеме
дистиллированной воды в колбе. После растворения довести объем дистиллированной
водой до 1,0 литра. В случае необходимости довести pH до 7,4-7,5 с помощью 0,1
н HCl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град.
C в течение 15 мин.
4.1.4. Раствор гиппурата натрия
Натрий гиппурат (содержание основного
вещества 99%) - 10,0 г.
Фосфатный буферный раствор - 1,0 л.
Растворить гиппурат натрия в стерильном
буферном растворе. Разлить в пробирки по 0,4 мл. Хранить при температуре минус
20 град. C не более 1 месяца. Перед использованием разморозить при комнатной
температуре.
4.1.5. Раствор нингидрина
Нингидрин (содержание основного вещества
99%) - 10,0 г.
Ацетон - 25 мл.
Бутиловый спирт - 25 мл.
Растворить нингидрин в смеси ацетона и
бутилового спирта. Хранить в защищенном от света месте при температуре (5 +/-
1) град. C не более 3 месяцев.
4.1.6. Аэротолерантная добавка
Натрий пировинограднокислый - 6,25 г.
Железо (II) сернокислое - 6,25 г.
Натрий метабисульфит - 6,25 г.
Стерильная дистиллированная вода - 100
мл.
Растворить натрий пировинограднокислый в
10-20 мл стерильной дистиллированном воды, после растворения довести объем воды
до 100 мл. Добавить железо (II) сернокислое и натрия метабисульфит. Разлить в
пробирки по 4 мл. Хранить в защищенном от света месте при температуре минус 20
град. C не более 1 месяца. Раствор чрезвычайно чувствителен к воздействию
света, после добавления в питательные среды рекомендуется сохранять их в
защищенном от света месте.
4.1.7. Приготовление растворов и
реактивов для окраски препаратов по Граму
Производят согласно требованиям ГОСТ
10444.1 или в соответствии с инструкцией по применению.
4.2. Приготовление
питательных сред
Селективность сред для выделения бактерий
рода Campylobacter по отношению к сопутствующей микрофлоре достигается путем
включения в их состав антибиотиков: цефоперазона, колистина, амфотерицина В,
ванкомицина, триметоприма, полимиксина и других. С целью повышения
аэротолерантности и снижения окислительно-восстановительного потенциала сред в
них добавляют дефибринированную баранью кровь в количестве не менее 7% к объему
или древесный уголь, а также восстанавливающие агенты: натрия пируват, натрия
метабисульфит, железо (II) сульфат.
Так как бактерии рода Campylobacter
являются микроаэрофильными микроорганизмами, крайне важно предотвращать
попадание кислорода в питательные среды для их культивирования, для чего
необходимо соблюдать следующие правила:
- предпочтительней использовать
свежеприготовленные среды, срок хранения питательных сред не должен превышать
двух недель в условиях холодильника;
- перемешивание компонентов готовых сред
(при растворении добавок антибиотиков, перемешивании крови), самих сред после добавления
в них компонентов проводить способом, исключающим попадание в них пузырьков
воздуха;
- подсушивание поверхности чашек перед
посевом в термостате осуществлять с закрытыми крышками при температуре 42 град.
C в течение 2-3 часов.
Среды промышленного изготовления,
поименованные в п. 3.3.2, готовятся согласно прилагаемым инструкциям или
прописям на этикетках. Допускается применение сред лабораторного приготовления
по п.п. 4.2.1.1, 4.2.2.1 из отдельных компонентов.
4.2.1. Приготовление бульонов
4.2.1.1. Селективный бульон (Престона)
для накопления кампилобактерий.
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г
|
|
Пептон
|
10,0
|
|
Мясной
экстракт
|
10,0
|
|
Натрия
хлорид
|
5,0
|
|
Агар
|
1,0
|
|
Вода
|
1000,0
|
Растворить основные компоненты в
дистиллированной воде. При необходимости подогреть до кипения для полного
растворения частиц. В случае необходимости установить pH 7,5 +/- 0,2 с помощью
0,1 н HCl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121
град. C в течение 15 мин. Остудить до 45-50 град. C.
Приготовление полной среды:
перед использованием в 1000 мл бульона
асептически добавить: 70 мл стерильной дефибринированной крови барана;
растворенное в 50%-ном растворе ацетона содержимое двух флакончиков с добавкой
антибиотиков для кампилобактерий IV (по Престону) или I (по Блэйзер-Вонг) или
растворенное в 50%-ном растворе этанола содержимое двух флакончиков с добавкой
антибиотиков II (по Бутцлеру) и растворенное в стерильной дистиллированной воде
содержимое двух флакончиков ростовой добавки для кампилобактерий, или 4 мл
аэротолерантной добавки по п. 4.1.6 тщательно перемешать и разлить среду в
соответствующие емкости в количествах, необходимых для проведения исследования.
4.2.1.2. Селективный бульон (Дойла) для
накопления кампилобактерий.
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г/л
|
|
Гидролизат
казеина
|
10,0
|
|
Пептический
перевар животной ткани
|
10,0
|
|
Дрожжевой
экстракт
|
2,0
|
|
Глюкоза
|
1,0
|
|
Натрия
хлорид
|
5,0
|
|
Натрия
бисульфит
|
0,1
|
|
Натрия
сукцинат
|
3,0
|
|
L-цистеина
гидрохлорид
|
0,1
|
|
pH (при 25 град.
C) 7,0 +/- 0,2
|
|
Используют готовую основу среды
промышленного изготовления указанного состава.
Приготовление осуществляют согласно
прописи на этикетке. Растворить сухую основу порошка в дистиллированной воде.
При необходимости подогреть до кипения для полного растворения частиц.
Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин.
Остудить до температуры 45 град. C.
Приготовление полной среды:
перед использованием в 500 мл бульона
асептически добавить 35 мл стерильной дефибринированной крови барана, а также
растворенное в 50%-ном растворе этанола содержимое 1 флакончика с добавкой
антибиотиков модифицированной III (по Дойлу). Тщательно перемешать и разлить в
соответствующие емкости в количествах, необходимых для проведения исследования.
4.2.1.3. Бульон для бруцелл
(неселективный).
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г/л
|
|
Гидролизат
казеина
|
10,0
|
|
Пептический
перевар животной ткани
|
10,0
|
|
Дрожжевой
экстракт
|
2,0
|
|
Глюкоза
|
1,0
|
|
Натрия
хлорид
|
5,0
|
|
Натрия
бисульфит
|
0,1
|
|
pH (при 25 град.
C) 7,0 +/- 0,2
|
|
Используют готовую основу среды
промышленного изготовления указанного состава.
Приготовление осуществляют согласно
прописи на этикетке. Растворить порошок сухой основы в дистиллированной воде.
При необходимости подогреть до кипения для полного растворения частиц.
Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин.
Разлить по пробиркам из расчета 10 мл на 1 пробирку.
4.2.2. Приготовление агаровых сред
4.2.2.1. Селективный агар Престона.
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г
|
|
Пептон
|
10,0
|
|
Мясной
экстракт
|
10,0
|
|
Натрия
хлорид
|
5,0
|
|
Агар-агар
|
12,0
|
|
Вода
|
1000,0
|
|
pH (при 25 град.
C) 7,5 +/- 0,2
|
|
Растворить основные компоненты в
дистиллированной воде. При необходимости довести до кипения для полного
растворения частиц. В случае необходимости установить pH 7,5 +/- 0,2 с помощью
0,1 н HCl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121
град. C в течение 15 мин. Остудить до 45-50 град. C.
Приготовление полной среды:
перед использованием в 1000 мл
расплавленного и остуженного до 45-50 град. C агара асептически добавить: 70 мл
стерильной дефибринированной крови барана; растворенное в 50%-ном растворе
ацетона содержимое двух флакончиков с добавкой антибиотиков для кампилобактерий
IV (по Престону) или I (по Блэйзер-Вонг), или растворенное в 50%-ном растворе
этанола содержимое двух флакончиков с селективной добавкой для кампилобактерий
II (по Бутцлер) и растворенное в воде содержимое двух флакончиков ростовой
добавки для кампилобактерий, или 4 мл аэротолерантной добавки по п. 4.1.6,
тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри слоем толщиной
4-5 мм.
4.2.2.2. Угольный селективный агар для
кампилобактерий.
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г/л
|
|
Гидролизат
казеина
|
3,0
|
|
Пептический
перевар животной ткани
|
10,0
|
|
Мясной
экстракт
|
10,0
|
|
Натрия
хлорид
|
5,0
|
|
Железа
сульфат
|
0,25
|
|
Натрия
пируват
|
0,25
|
|
Уголь древесный
бактериологический
|
4,0
|
|
Агар-агар
|
12,0
|
|
pH (при 25 град.
C) 7,0 +/- 0,2
|
|
Используют готовую основу среды
промышленного изготовления указанного состава.
Приготовление осуществляют согласно
прописи на этикетке. Растворить порошок сухой основы в дистиллированной воде.
Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать
автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до
45-50 град. C.
Приготовление полной среды:
в 500 мл расплавленного и остуженного до
45-50 град. C агара асептически добавить растворенное в 2 мл стерильной
дистиллированной воды содержимое 1 флакончика с добавкой антибиотиков САТ или
растворенное в 2 мл стерильной дистиллированной воды содержимое 1 флакончика с
добавкой антибиотиков-V. Тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки
Петри слоем толщиной 4-5 мм.
4.2.2.3. Кампилобакагар.
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г/л
|
|
Панкреатический
гидролизат казеина
|
5,0
|
|
Кислотный
гидролизат казеина
|
20,0
|
|
Агар
|
15,0 +/- 3,0
|
|
Натрий
углекислый
|
0,1 - 0,4
|
Используют готовую основу среды
промышленного изготовления указанного состава.
Приготовление осуществляют согласно
прописи на этикетке. Растворить порошкообразную сухую основу в дистиллированной
воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать
автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до
45-50 град. C.
Приготовление полной среды:
перед использованием в 1000 мл
расплавленного и остуженного до 45-50 град. C агара асептически добавить 70 мл
стерильной дефибринированной крови барана. Содержимое флакона с селективной
добавкой антибиотиков для кампилобакагара растворить в 1,5 мл стерильной
дистиллированной воды с добавлением 5-7 капель 96%-ного этилового спирта.
Полученную смесь антибиотиков в количестве двух флаконов добавить в агар,
тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри слоем толщиной 4-5 мм.
4.2.2.4. Полужидкий бульон для бруцелл
(неселективный).
Состав основы бульона:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г/л
|
|
Гидролизат
казеина
|
10,0
|
|
Пептический
перевар животной ткани
|
10,0
|
|
Дрожжевой
экстракт
|
2,0
|
|
Глюкоза
|
1,0
|
|
Натрия
хлорид
|
5,0
|
|
Натрия
биосульфат
|
0,1
|
|
pH (при 25 град.
C) 7,0 +/- 0,2
|
|
К готовой основе среды промышленного
изготовления указанного состава добавить агар из расчета 2,0 г/л среды, далее
приготовление осуществлять согласно прописи на этикетке. Растворить
порошкообразную сухую основу в дистиллированной воде. Довести до кипения для
полного растворения частиц, тщательно перемешать, разлить по пробиркам из
расчета 5 мл на 1 пробирку. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121
град. C в течение 15 мин.
4.2.2.5. Колумбийский кровяной агар
(неселективный).
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г/л
|
|
Пептон
(специальный)
|
23,0
|
|
Крахмал
кукурузный
|
1,0
|
|
Натрия
хлорид
|
5,0
|
|
Агар-агар
|
15,0
|
|
pH (при 25 град.
C) 7,3 +/- 0,2
|
|
Используют готовую основу среды
промышленного изготовления указанного состава.
Приготовление осуществляют согласно
прописи на этикетке. Растворить порошкообразную сухую основу в дистиллированной
воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать
автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до
40-50 град. C и асептически внести 70 мл стерильной дефибринированной крови
барана, тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри слоем 4-5 мм.
4.2.2.6. Агар Мюллера-Хинтона.
Состав основы среды:
|
Ингредиенты
|
Количество,
г/л
|
|
Мясной
настой
|
300,0
|
|
Гидролизат
казеина
|
17,5
|
|
Крахмал
|
1,5
|
|
Агар-агар
|
17,0
|
|
pH (при 25 град.
C) 7,3 +/- 0,2
|
|
Используют готовую основу среды
промышленного изготовления указанного состава.
Приготовление осуществляют согласно
прописи на этикетке. Растворить порошкообразную сухую основу в дистиллированной
воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать
автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до
45-50 град. C. Добавить 70 мл стерильной дефибринированной крови барана,
тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри.
4.2.2.7. Трехсахарный железосодержащий
агар (для идентификации).
Допускается использование двух
модификаций среды: ТСА и среды N 13.
Состав сред:
┌────────────────────────────────────────────┬────────────────────────────┐
│ Ингредиенты, г/л │ Среды: │
│ ├──────────────┬─────────────┤
│ │ N 13
│ ТСА │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Пептический
перевар животной ткани │10,0 │20,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Гидролизат
казеина │10,0 │- │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Дрожжевой
экстракт │3,0 │3,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Мясной
экстракт │3,0 │3,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Лактоза │10,0 │10,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Сахароза │10,0 │10,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Глюкоза │1,0 │1,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Натрия
хлорид │5,0 │5,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Железа
сульфат │0,2 │- │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Железа
(III) цитрат │- │0,3 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Натрия
тиосульфат │0,3 │- │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Натрия
тиосульфат (х 5H O) │- │0,3 │
│ 2 │ │ │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Феноловый
красный │0,024 │0,024 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│Агар-агар │12,0 │12,0 │
├────────────────────────────────────────────┼──────────────┼─────────────┤
│pH
(при 25 град. C) 7,4 +/- 0,2 │ │ │
└────────────────────────────────────────────┴──────────────┴─────────────┘
Используют готовые основы сред
промышленного изготовления с указанным составом.
Приготовление осуществляют согласно
прописям на этикетках. Растворить порошкообразную сухую основу в
дистиллированной воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц.
Тщательно перемешать и разлить в пробирки для тестирования. Стерилизовать
автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить среду
в наклонном положении при комнатной температуре для формирования скоса и
столбика высотой 2,5 см.
4.3. Требования к
выполнению фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа
4.3.1. Условия безопасного проведения
работ
При выполнении анализов необходимо
соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами
по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и
электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической
документации на прибор.
Анализатор должен находиться в помещении,
приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с
тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:
- не использовать наконечники с
поврежденной упаковкой;
- не использовать поврежденные стрипы;
- не использовать набор по истечении
срока годности;
- не смешивать реактивы из различных
партий;
- пролитые жидкости необходимо тщательно
вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием
натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие
отбеливатель;
- анализаторы необходимо регулярно
чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации
приборов.
Тест-набор содержит едкий реактив
диэтаноламин, а также натрия азид, который со свинцом и медью образует
взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в
водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их
накопления.
4.3.2. Требования к квалификации специалистов
Выполнение измерений может проводить
специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и
приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов
оперативного контроля погрешности.
4.3.3. Условия выполнения измерений
Измерения проводятся в нормальных
лабораторных условиях:
- температура окружающего воздуха (20 +/-
5) °С;
- атмосферное давление (97 +/- 10) кПа;
- относительная влажность (65 +/- 15)%.
5. ОТБОР И
ПОДГОТОВКА ПРОБ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
5.1. Общие
положения по отбору и подготовке проб
Отбор и подготовку проб продукции
производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для
микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и
вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96
"Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания
и их компонентов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с
действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.
Масса или объем отбираемых проб должны
быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать
размер аналитического(их) образца(ов).
Учитывая, что кампилобактерии чрезвычайно
чувствительны к воздействию факторов окружающей среды, таких как высушивание,
снижение pH, нагревание, воздействие УФ-лучей и длительное хранение, при отборе
проб пищевых продуктов на наличие бактерий рода Campylobacter необходимо
соблюдать следующие правила:
- отбор проб и их доставку в лабораторию
для исследования проводят в максимально короткие сроки, по возможности не более
1 часа;
- отбор проб твердых пищевых продуктов
осуществляют в стерильные газонепроницаемые пакеты, удаляют избыток воздуха,
герметизируют путем перекручивания свободных краев пакета и фиксации при помощи
обхвата. Пробы жидких продуктов отбирают в герметично закрывающуюся стерильную
стеклянную посуду;
- доставку проб в лабораторию
осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими вкладышами (сумке-холодильнике);
- до проведения анализа пробы сохраняют в
защищенном от света месте при температуре (5 +/- 1) град. C. Пробы замороженных
продуктов размораживают в защищенном от света месте при температуре (5 +/- 1)
град. C в течение не более 18 ч. или в течение 1 ч. при температуре (19 +/- 1)
град. C;
- после вскрытия упаковки пробы
подвергают исследованию немедленно, приготовление объединенной пробы, навесок
продукта и посев осуществляют в максимально короткие сроки. Для приготовления
объединенной пробы продукт измельчают, но активное перемешивание измельченной
пробы не рекомендуется.
5.2. Отбор и
подготовка проб мяса птицы и птицепродуктов,
мяса, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий
и других мясопродуктов
Отбор и подготовку проб мяса птицы и
птицепродуктов, мяса, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других
мясопродуктов проводят по ГОСТ Р 50396.0-92 "Мясо птицы, субпродукты и
полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим
исследованиям".
Отбор и подготовку проб мяса,
субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных
продуктов проводят по ГОСТ 21237 "Мясо. Методы бактериологического
анализа", ГОСТ 4288 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленного
мяса", ГОСТ 9958, ГОСТ 9792 "Колбасные изделия и продукты из свинины,
баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц".
Отобранные образцы измельчают в
перистальтическом гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке, доводят до
однородной консистенции по ГОСТ 26669-85, из измельченной суспензии составляют
навеску необходимой массы.
5.3. Отбор и
подготовка проб молока,
молочных продуктов, сыров, мороженого
Отбор и подготовку проб проводят согласно
ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического
анализа".
Кисломолочные продукты, сыр, творог,
творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают и подвергают
нейтрализации; масло сливочное и мороженое растапливают при температуре не выше
45 град. C до сметанообразной консистенции, после чего от пробы отбирают
навеску не менее 50 г, которую центрифугируют при 20000 х g (с охлаждением) в
течение 40 мин. Удаляют супернатант и слой жира, исследованию подвергают
седимент (осадок).
6. СОЗДАНИЕ
МИКРОАЭРОФИЛЬНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Оптимальная газовая среда для
культивирования бактерий рода Campylobacter имеет состав: двуокись углерода
(CO2) - 10%, кислород (O2) - 5%, азот
(N2) - 85%. Для ее создания можно использовать следующие способы.
6.1. С использованием газовой смеси
вышеуказанного состава заводского изготовления.
6.1.1. Вариант 1. Посевы помещают в
систему для анаэробного культивирования (анаэростат), закрывают, откачивают
воздух до уровня, соответствующего отметкам минус 0,9-1,0 атмосфера по шкале
манометра. Процедуру откачивания содержимого и заполнения пространства газовой
смесью необходимо повторить дважды, после чего анаэростат помещают в термостат
с температурой (42 +/- 1) град. C.
6.1.2. Вариант 2. Посевы помещают в
контейнеры для анаэробного культивирования определенного объема, затем в
стерильные газонепроницаемые пакеты. Пакеты заполняют газовой смесью, вручную
вытесняют избыток смеси из пакета. Заполнение-вытеснение повторяют дважды,
оканчивают заполнением, после чего пакет герметизируют, перекручивая свободные
края с последующей фиксацией их специальным зажимом или резиновым обхватом и
помещают в термостат с температурой (42 +/- 1) град. C.
6.2. С использованием газогенераторных
пакетов для кампилобактерий, которые после вскрытия помещают либо в анаэростат,
либо в газонепроницаемые пакеты. Газогенераторные пакеты рассчитаны на
определенный объем анаэростата (газонепроницаемых пакетов), что необходимо
учитывать при их применении. Инкубирование посевов проводят при температуре (42
+/- 1) град. C.
6.3. Культивирование посевов допускается
осуществлять также в анаэробном инкубаторе или CO2-инкубаторе, позволяющем
поддерживать температуру (42 +/- 1) град. C.
7. ПРОВЕДЕНИЕ
АНАЛИЗА
7.1. Качественное
определение
Метод определения бактерий рода
Campylobacter предусматривает определение их наличия или отсутствия в навеске
(порции) пищевых продуктов определенной массы или объема (10, 25 или 50 г (куб.
см)), для чего необходимое количество подготовленной пробы вносят в 9-кратный
объем обогащающего бульона по п.п. 4.2.1.1 или 4.2.1.2 (при исследовании жидких
молочных продуктов супернатант, приготовленный согласно п. 5.3, предварительно
растворяют в 10 мл обогащающего бульона и добавляют к 90 мл обогащающего
бульона). Полученное разведение предварительно инкубируют в течение 4 ч. при 37
град. C, а в случае посевов замороженных продуктов или продуктов, которые
хранились более 10 дней, - в течение 3 ч. при температуре 32 град. C, потом 2
ч. при температуре 37 град. C. Затем посевы продолжают инкубировать в течение
18-24 ч. при температуре 42 град. C. После этого делают пересев петлей на
поверхность агара по п.п. 4.2.1.1, 4.2.2.2 или 4.2.2.3 и вновь инкубируют при
температуре 42 град. C. Длительность инкубации посевов может составлять до 48
ч. при необходимом ежесуточном контроле роста культуры. Инкубация на всех
этапах осуществляется в микроаэрофильных условиях.
Основные этапы исследования пищевых
продуктов для качественного определения бактерий рода Campylobacter
представлены в табл. 1.
Таблица 1
СХЕМА ПРОЦЕДУРЫ КАЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
КАМПИЛОБАКТЕРИЙ
|
N
этапа
|
Название
этапа
|
Суть
процедуры
|
|
1
|
Приготовление
навески
|
Асептическое
взвешивание или отмеривание
необходимого объема пробы
|
|
2
|
Посев
|
В 9-кратный объем
жидкой среды - обогащающего
бульона, инкубация в микроаэрофильных условиях
|
|
3
|
Предварительное
обогащение (в
микроаэрофильных
условиях)
|
3.1. Для
продуктов, замороженных и хранившихся
более 10 дней, - 3 ч. при 32 град. C, затем 2 ч.
при 37 град. C;
3.2. Для прочих продуктов - 4 ч. при 37 град. C
|
|
4
|
Обогащение
(в
микроаэрофильных
условиях)
|
Изменение
температуры инкубации на 42 град. C -
термостатирование в течение 18-24 ч.
|
|
5
|
Пересев
|
Инокуляция на
поверхность селективного агара и
инкубация в микроаэрофильных условиях 24-48 ч.
при 42 град. C
|
|
6
|
Подтверждение
|
Идентификация
выросших колоний до рода и
выдача предварительного ответа
|
|
7
|
Учет результатов
|
Идентификация
колоний до вида и выдача
окончательного ответа
|
7.2. Количественное
определение
При количественном анализе общая масса
(объем) навески должна быть не менее 100 г (куб. см).
Из подготовленной по п. 5.2 пробы
отбирают 4 навески (порции) продукта массой 10 г (куб. см) каждая для анализа.
Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 90 мл обогащающего бульона,
осторожно перемешивают. Перемешивание продукта производят способом, исключающим
попадание пузырьков воздуха. Перемешивание пипеткой путем вдувания и выдувания
воздуха не допускается.
Из четвертой навески (порции) массой
(объемом) 10 г (куб. см) готовят разведение 1:10, для посевов десятикратно
убывающих количеств продукта - 1,0, 0,1 и ниже. Для этого из колбы с полученным
разведением 1:10 переносят последовательно по 10 мл в три колбы с 90 мл и по 1
мл в три пробирки с 9 мл обогащающего бульона. При необходимости (при
предполагаемом высоком содержании кампилобактерий в продукте) производят посев
по 0,1 мл из разведения 1:10 в три пробирки с 9 мл обогащающего бульона.
Производят перемешивание вышеупомянутым способом. Для каждого разведения
используют новую стерильную пипетку.
Соотношение между количеством высеваемого
продукта или его разведения с питательной средой должно составлять не менее
1:9.
Таким образом, от каждого из испытуемых
образцов должно быть засеяно не менее трех масс (объемов) продукта в
трехкратной повторности: 10 г (куб. см) х 3; 1 г (куб. см) х 3; 0,1 г (куб. см)
х 3; а при необходимости - четвертая в количестве 0,01 г (куб. см) х 3 раза.
Допускается использовать для посева
только разведения продукта, при этом засеянные массы будут составлять 1 г (куб.
см) (трехкратно); 0,1 г (трехкратно); 0,01 г (трехкратно).
Дальнейший анализ всех исследуемых масс
(объемов) проводят по схеме качественного определения кампилобактерий (см.
табл. 1, этапы 3-7), при этом пересев каждой из засеянных колб (пробирок) на
плотные среды допускается осуществлять на одну чашку Петри с делением на 3
сектора. Схема процедуры посева приведена в Прилож. 1.
7.3. Проведение
фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа
7.3.1. Подготовка анализатора к работе:
- Перед использованием реактивов новой
партии в анализатор вводят (автоматически или вручную) спецификации реактивов,
используя калибровочную карту, входящую в каждый набор. Процедуру необходимо
проводить только один раз для каждой партии реактивов.
- Для каждой новой партии реактивов
проводят калибровку прибора, используя стандарт, входящий в состав набора.
Калибровку проводят после ввода данных партии, но не реже одного раза в 14
дней. Для этого в отдельные стрипы вносят по 0,5 куб. см реактива C1, C2 и в
два стрипа реактив S1 из тест-набора. Необходимо ввести информацию об образце и
контролях в анализатор для создания рабочего листа. Установить стрипы и
наконечники в анализатор и запустить программу.
Эта операция необходима для построения
точной калибровочной кривой и компенсации вариаций, которые могут возникнуть
при хранении набора. Стандарт S1 необходимо тестировать в двукратной
повторности согласно руководству по эксплуатации прибора. Результаты должны
находиться в пределах установленного диапазона, указанного на калибровочной
карте. Если результат не соответствует диапазону, следует повторить калибровку.
7.3.2. Подготовка образцов к
фермент-связанному флюоресцентному иммуноанализу
Отобрать в пробирку 1-2 куб. см бульона
обогащения, инкубированного по п. 7.1 МУК 4.2.2321-08, закрыть и нагревать на
водяной бане (15 +/- 1) мин. при 95 - 100 град. С. Охладить 10 мин., перемешать
и внести 0,5 куб. см в стрип из тест-набора.
Оставшуюся часть бульона хранят в
холодильнике при 2-4 град. С для подтверждения положительных образцов.
7.3.3. Проведение фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа
Перед проведением анализа необходимое
количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30
мин.
Для каждого анализа используется 1 стрип
и 1 наконечник из тест-набора. В открытую лунку стрипа вносят 0,5 куб. см
термостатированного образца по п. 7.3.2. Далее стрипы и наконечники
устанавливают в анализатор, вводят название соответствующих образцов и
запускают анализ. Время анализа приблизительно 70 мин.
7.3.4. Интерпретация результатов
Оптический сканер прибора измеряет
флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз
измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз
флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования
флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности
конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную
величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого
образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно
формуле:
[Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта]
|
Результат
теста
|
Интерпретация
|
|
< 0,1
|
Отрицательный
|
|
>= 0,1
|
Положительный
|
Результат теста со значением меньше
порогового указывает на то, что образец не содержит антигена Campylobacter либо
содержит его в концентрации ниже порога определения. Результат теста со
значением, равным или больше порогового, свидетельствует о том, что образец
загрязнен бактериями рода Campylobacter. В этом случае следует провести
подтверждение положительного результата по п. 7.3.5.
Результаты также считаются
недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2)
нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение
субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с
новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той
же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту.
На принтер выводится информация - тип
теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока
годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация.
7.3.5. Подтверждение положительного
результата
Подтверждение положительного результата
проводят путем высева 0,1 мл хранившегося в холодильнике бульона обогащения,
полученного по п. 7.3.2, на поверхность одной из селективных сред (по п.
4.2.2). Инкубацию образцов проводят при температуре (42 +/- 1) град. С в
течение 20-24 ч, при отсутствии роста инкубировать еще 24 ч.
При наличии характерных колоний
необходимо провести идентификацию до 5 подозрительных колоний на принадлежность
к бактериям рода Campylobacter по п. 8.1.
При получении противоречивых результатов
(положительных альтернативным методом, не подтвержденных стандартным методом)
для проверки следует использовать дополнительные методы.
8. ОТБОР КОЛОНИЙ И
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР
Манипуляции по отбору колоний для
исследования и их пересев необходимо проводить в максимально короткие сроки.
Кампилобактерии при росте в
микроаэрофильных условиях на поверхности селективного агара образуют мелкие
округлые колонии или колонии средних размеров, неправильной формы, как бы
растекающиеся по ходу штриха, серые или полупрозрачные с сероватым оттенком,
гладкие, влажные, блестящие (в жидких и полужидких средах кампилобактерии дают
гомогенное помутнение или голубовато-серую пленку).
Отбирают 5 типичных или подозрительных на
принадлежность к Campylobacter spp. изолированных колоний (если число таких
колоний менее пяти, то отбирают все колонии), суспендируя каждую из колоний в 1
мл бульона для бруцелл или любой жидкой среды без антибиотиков и крови.
Идентификацию осуществляют в два этапа:
для подтверждения принадлежности к роду (I) и определения вида (II)
кампилобактерий.
8.1. Определение
принадлежности к роду Campylobacter
8.1.1. Окраска по Граму. Бактерии рода
Campylobacter - грамотрицательные мелкие, тонкие палочки с одним или более
завитками. В мазке имеют вид запятой, буквы S, либо галочки при соединении двух
клеток. В стареющих культурах (через 48-72 ч. инкубации на твердой среде) могут
обнаруживаться кокковидные клетки.
8.1.2. Подвижность. Определяют при
микроскопии раздавленной капли с помощью фазово-контрастного устройства. Не
следует разводить образец в дистиллированной воде, т.к. кампилобактерии теряют
в ней подвижность, разводить необходимо изотоническим раствором хлорида натрия
или любой жидкой средой без антибиотиков и крови. Кампилобактерии, взятые с
агара, имеют волнообразную подвижность, из бульона - спиралевидную. До 10%
штаммов могут быть неподвижны.
Обнаружение в пересевах на твердой селективной
среде колоний с типичными культуральными свойствами, в которых обнаруживаются
клетки с типичной для кампилобактерии морфологией, обладающие подвижностью,
позволяет дать предварительный ответ о наличии бактерий рода Campylobacter в
исследуемой пробе на 3-4 сутки от начала исследования (I этап).
Для выдачи окончательного ответа
необходимо проведение тестов идентификации, которые включают в себя
подтверждение принадлежности к роду и определение принадлежности к
термотолерантным видам Campylobacter: на способность к росту при температуре
(+) 25 град. C, наличие каталазы, оксидазы, способности гидролизовывать
гиппурат, утилизировать углеводы и продуцировать сероводород при росте на
трехсахарном агаре с солями железа, а также определение чувствительности к
налидиксовой кислоте и цефалотину (II этап).
Колонии, в которых обнаружены типичные
клетки кампилобактерий, пересевают петлей из взвеси в бульоне для бруцелл на
поверхность кровяного Колумбийского агара для получения чистой культуры и
инкубируют при 42 град. C в течение 24-48 ч. в микроаэрофильной атмосфере.
8.2. Подтверждающие
тесты родовой и видовой идентификации
8.2.1. Рост при 25 град. C. Для
определения способности к росту при температуре 25 град. C исследуемую культуру
засевают петлей в пробирку с бульоном для бруцелл, инкубируют при температуре
25 град. C в микроаэрофильных условиях в течение 3-5 сут. Учет проводят по
наличию или отсутствию видимого роста. Термофильные бактерии рода Campylobacter
не способны к росту при температуре 25 град. C.
8.2.2. Тест на оксидазу. Постановку
реакции можно осуществлять двумя нижеописанными способами:
1. Полоску фильтровальной бумаги
смачивают 2-3 каплями оксидазного реагента. На обработанную реактивом полоску
платиновой петлей наносят исследуемую культуру. При появлении сиреневой,
фиолетовой или глубокой синей окраски в течение 10 с реакцию считают положительной.
2. Используют готовые бумажные диски,
пропитанные оксидазным реагентом. Учет результатов реакции проводят согласно
инструкции изготовителя.
Бактерии рода Campylobacter
оксидазоположительны. Не рекомендуется проводить постановку данной реакции с
колониями, выращенными на угольном агаре, т.к. они могут не давать характерной
окраски (сиреневой, фиолетовой или синей).
8.2.3. Тест на каталазу. В каплю перекиси
водорода на чистом предметном стекле вносят петлю исследуемой культуры.
Появление пузырьков воздуха свидетельствует о положительной реакции. Бактерии
рода Campylobacter каталазоположительны, за исключением редко встречающегося
вида C.upsaliensis.
8.2.4. Гидролиз гиппурата. В пробирку с
0,4 мл раствора гиппурата вносят полную петлю исследуемой чистой культуры. Для
исследования берут только хорошо изолированные колонии. Для полного смешивания
инкубируют на водяной бане при температуре 37 град. C в обычной атмосфере.
Через 2 ч. добавляют 0,2 мл нингидринового реактива, перемешивают и
дополнительно инкубируют на водяной бане в течение 10 мин. О положительной
реакции свидетельствует появление фиолетового или темно-синего окрашивания. К
гидролизу гиппурата способны Campylobacter jejuni, представители других видов
рода Campylobacter не ферментируют гиппурат.
8.2.5. Утилизация глюкозы, лактозы,
сахарозы и продукция сероводорода (H2S). Способность выделенных бактерий
утилизировать сахара и продуцировать сероводород изучают по росту на скошенном
столбике трехсахарного железосодержащего агара. Обильно засевают чистой
культурой исследуемого микроорганизма поверхность скошенной части ТСА с
последующим уколом в столбик среды. Инкубирование осуществляют в микроаэробных
условиях при температуре 42 град. C в течение 24 ч. и продолжают, если
необходимо, до 5 дней. Учет результатов проводят по наличию изменения цвета
поверхности скошенной части ТСА и цвета столбика среды в пробирке, формированию
газа в среде. При неспособности к утилизации сахаров и продукции H2S цвет
поверхности скошенной части ТСА и самого столбика остается неизменным, пузырьки
газа и расслоение среды отсутствуют. Появление желтого окрашивания столбика
либо поверхности скошенной части ТСА свидетельствует об утилизации одного из
сахаров, газообразования - об утилизации глюкозы, а появление черного окрашивания
в толще столбика - о формировании H2S. Бактерии рода Campylobacter не
утилизируют углеводы. Продуцировать сероводород могут штаммы вида C.coli
(11-89% случаев).
8.2.6.
Определение
чувствительности к налидиксовой кислоте
и
цефалотину. Двухсуточную агаровую культуру Campylobacter
spp. суспендируют
в стерильном
физиологическом растворе и
стандартизуют по оптическому
стандарту мутности
на 10 ед. Полученную
бактериальную взвесь, содержащую
9
10 КОЕ/мл, в количестве 1 мл наносят на
поверхность агара Мюллера-Хинтона
с добавлением
7% крови барана,
равномерно распределяют покачиванием,
избыток взвеси
отсасывают пастеровской пипеткой.
Чашки подсушивают при
комнатной температуре
в течение 10-15 мин. На поверхность инокулированной
чашки накладывают
диски с цефалотином
и налидиксовой кислотой. Чашки
инкубируют в
микроаэробных условиях при
температуре 37 град. C в течение
48-72 ч.
Рост в
контакте с диском расценивается как устойчивость, наличие
зоны
задержки роста любых
размеров - как чувствительность. Бактерии рода
Campylobacter устойчивы
к цефалотину (за
исключением видов
С.hyointestinalis
и C.upsaliensis) и к налидиксовой кислоте (за исключением
C.coli и
C.upsaliensis). Среди C.jejuni могут быть штаммы как
устойчивые,
так и
чувствительные к налидиксовой кислоте.
8.2.7. Обобщение результатов
идентификации
При обобщении результатов идентификации и
подтверждении выделенных бактерий к термотолерантным видам Campylobacter spp.
пользуются табл. 2.
Таблица 2
СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER
┌───────────────────┬────────┬──────┬──────┬─────────────────┬─────────────┐
│Признак \
Вид│C.jejuni│C.coli│C.lari│C.hyointestinalis│C.upsaliensis│
├───────────────────┼────────┼──────┼──────┼─────────────────┼─────────────┤
│Рост
при 25 град. C│- │- │- │V │- │
├───────────────────┼────────┼──────┼──────┼─────────────────┼─────────────┤
│Гидролиз
гиппурата │+ │- │- │- │- │
├───────────────────┼────────┼──────┼──────┼─────────────────┼─────────────┤
│Продукция
H2S │- │V │- │+ (1) │- │
├───────────────────┼────────┼──────┼──────┼─────────────────┼─────────────┤
│Продукция
каталазы │+ │+ │+ │+ │- │
├───────────────────┼────────┼──────┼──────┼─────────────────┼─────────────┤
│Продукция
оксидазы │+ │+ │+ │+ │+ │
├───────────────────┼────────┼──────┼──────┼─────────────────┼─────────────┤
│Устойчивость: │S (2) │S
│R │R │S │
│к
налидиксовой │ │ │ │ │ │
│кислоте │ │ │ │ │ │
├───────────────────┼────────┼──────┼──────┼─────────────────┼─────────────┤
│к
цефалотину │R │R │R │S │S │
├───────────────────┴────────┴──────┴──────┴─────────────────┴─────────────┤
│ Обозначения: "+" - штаммы
положительны в 90% и более случаев; "-" - │
│штаммы
отрицательны в 90% и более случаев; "V" - штаммы положительны от │
│11
до 89% случаев; "S" - все штаммы чувствительны; "R" - все
штаммы │
│устойчивы;
(1) - слабое образование H2S в ТСА за срок менее 3 дней; (2) │
│-
есть сообщения о штаммах, устойчивых к налидиксовой кислоте. │
└──────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
Если бактерии с указанными
характеристиками присутствуют по меньшей мере в одной из изученных колоний,
считают, что термотолерантные виды Campylobacter в анализируемом образце
обнаружены.
Для видовой дифференциации выделенных
культур кампилобактерий допускается использовать биохимические тест-системы API
CAMPY либо другие аналогичного назначения, имеющие разрешение уполномоченных
органов Российской Федерации на их применение. При их использовании следует
руководствоваться рекомендациями изготовителя.
8.3. Учет
результатов и выдача ответа
8.3.1. Учет результатов и выдача ответа
при качественном определении. Результат оценивают по каждой исследованной пробе
продукта определенной массы или объема (10, 25 или 50 г (куб. см)) отдельно.
Предварительный ответ выдается с учетом идентификационных тестов по п. 8.1.
Окончательный - с учетом идентификационных тестов по п. 8.2. Если в результате
проведенного исследования бактерии рода Campylobacter обнаружены, то результат
выражают следующим образом: "Бактерии рода Campylobacter обнаружены в 10,
25 или 50 г (куб. см) продукта". Если не обнаружены: "Бактерии рода
Campylobacter не обнаружены в 10, 25 или 50 г (куб. см) продукта".
При необходимости в ответе указывается
вид бактерий рода Campylobacter.
8.3.2. Учет результатов и выдача ответа
при количественном определении. Результат оценивают по каждой исследованной
пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах
и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта,
в которых подтверждено наличие бактерий рода Campylobacter при пересеве на
твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от
получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого
значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по
которому, используя табл., приведенную в Прилож. 2, находят наиболее вероятное
число (НВЧ) кампилобактерий, соответствующее их содержанию в 1 г (куб. см)
продукта.
Для окончательного определения НВЧ
бактерий рода Campylobacter в анализируемом образце учитывают значение первой
выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным
наличием кампилобактерий. Так, в случае если расчет ведется от посева массы
(объема) 10 г (куб. см) (х 3) продукта, количество кампилобактерий в 1 г (куб.
см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы
соответственно установленному индексу, на 10. В случае, когда в качестве
первого значения для расчета выбрана масса (объем) 1 г (куб. см) (х 3),
количество кампилобактерий в 1 г (куб. см) образца эквивалентно числу НВЧ по
таблице.
ПРИМЕР: Кампилобактерии обнаружены в трех
повторностях при посеве 1 г (то есть по 10 мл из разведения 1:10), в трех
повторностях - при посеве 0,1 г (по 1 мл из разведения 1:10) и в одной - при
посеве 0,01 г (по 0,1 мл из разведения 1:10).
Изображение не приводится
Результат по числу секторов с
подтвержденным ростом бактерий рода Campylobacter из трех выбранных масс
записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (табл. Прилож.
2). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий рода Campylobacter
составляет 46 КОЕ в 1 г продукта.
Если НВЧ менее чем 0,3 КОЕ и 1 г (куб.
см) (индекс 0:0:0) в случае, когда в качестве первого значения для расчета
выбрана масса (объем) 1 г (куб. см) (х 3), то результат должен выражаться
следующим образом: "Менее 1 КОЕ в 1 г (куб. см)". В случае, когда в
качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (куб. см) (х
3), то число НВЧ должно быть поделено на 10, и результат должен выражаться как:
"Менее 0,1 КОЕ в 1 г (куб. см)".
Если НВЧ составляет величину более чем
110 КОЕ/г (куб. см) (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить,
используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация
продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении.
При необходимости ответа о количестве в
пищевом продукте кампилобактерий определенного вида обязательно проведение
исследований и учет результатов по п. 8.2.
9. ТРЕБОВАНИЯ
БЕЗОПАСНОСТИ
Выявление и определение бактерий рода
Campylobacter в пищевых продуктах проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99
"Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и
гельминтами".
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ
ДАННЫЕ
1. ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб
для микробиологических анализов".
2. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и
вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".
3. ГОСТ Р 50396.0 "Мясо птицы,
субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к
микробиологическим исследованиям".
4. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы
бактериологического анализа".
5. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные
и полуфабрикаты из рубленого мяса. Правила приемки и методы испытания".
6. ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и
продукты из мяса. Методы бактериологического анализа".
7. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и
продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и
птиц. Правила приемки и методы отбора проб".
8. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные
продукты. Методы микробиологического анализа".
9. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96)
"Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".
10. СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность
работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".
11. Пособие для врачей ЦНИИ эпидемиологии.
Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных микроаэрофильными
изогнутыми бактериями. М., 2002. 42 с.
12. ISO 10272:1995 (E) "Microbiology
of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for detection of
thermotolerant Campylobacter" с дополнениями 1996 и 1997 гг. 17 стр.
13. FDA/CFSAN Bacteriological Analytical
Manual. Chapter 7. "Isolation of Campylobacter Species from Food and
Water", 2001, 20 p.
Приложение N 1
СХЕМА ПРОЦЕДУРЫ ПОСЕВА ПО НВЧ
Схема не приводится.
Приложение N 2
Таблица
ТАБЛИЦА
ДЛЯ РАСЧЕТА НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА
МИКРООРГАНИЗМОВ
(ПО ГОСТ Р 51446-99)
|
Число секторов
с
подтвержденным ростом
Campylobacter spp. (из
трех выбранных значений
массы (объема))
|
НВЧ,
КОЕ/г
(куб. см)
|
Действительное
число микроорганизмов
в 1 г (куб. см) с вероятностью
|
|
95%
|
99%
|
|
1,0
|
0,1
|
0,01
|
от
|
до
|
от
|
до
|
|
0
|
0
|
0
|
< 0,30
|
0,00
|
0,94
|
0,00
|
1,40
|
|
0
|
0
|
1
|
0,30
|
0,01
|
0,95
|
0,00
|
1,40
|
|
0
|
1
|
0
|
0,30
|
0,01
|
1,00
|
00
|
1,60
|
|
0
|
1
|
1
|
0,61
|
0,12
|
1,7
|
0,05
|
2,50
|
|
0
|
2
|
0
|
0,62
|
0,12
|
1,70
|
0,05
|
2,50
|
|
0
|
3
|
0
|
0,94
|
0,35
|
3,3
|
0,18
|
4,60
|
|
1
|
0
|
0
|
0,36
|
0,02
|
1,70
|
0,05
|
2,50
|
|
1
|
0
|
1
|
0,72
|
0,12
|
1,70
|
0,05
|
2,50
|
|
1
|
0
|
2
|
1,1
|
0,4
|
3,5
|
0,2
|
4,6
|
|
1
|
1
|
0
|
0,74
|
0,13
|
2,00
|
0,06
|
2,7
|
|
1
|
1
|
1
|
1,1
|
0,4
|
3,5
|
0,2
|
4,6
|
|
1
|
2
|
0
|
1,1
|
0,4
|
3,5
|
0,2
|
4,6
|
|
1
|
2
|
1
|
1,5
|
0,5
|
3,8
|
0,2
|
5,2
|
|
1
|
3
|
0
|
1,6
|
0,5
|
3,8
|
0,2
|
5,2
|
|
2
|
0
|
0
|
0,92
|
0,15
|
3,50
|
0,07
|
4,60
|
|
2
|
0
|
1
|
1,4
|
0,4
|
3,5
|
0,2
|
4,6
|
|
2
|
0
|
2
|
2,0
|
0,5
|
3,8
|
0,2
|
5,2
|
|
2
|
1
|
0
|
1,5
|
0,4
|
3,8
|
0,2
|
5,2
|
|
2
|
1
|
1
|
2,0
|
0,5
|
3,8
|
0,2
|
5,2
|
|
2
|
1
|
1
|
2,0
|
0,5
|
3,8
|
0,2
|
5,2
|
|
2
|
1
|
2
|
2,7
|
0,9
|
9,4
|
0,5
|
14,2
|
|
2
|
2
|
0
|
2,1
|
0,5
|
4,0
|
0,2
|
5,6
|
|
2
|
2
|
1
|
2,8
|
0,9
|
9,4
|
0,5
|
14,2
|
|
2
|
2
|
2
|
3,5
|
0,9
|
9,4
|
0,5
|
14,2
|
|
2
|
3
|
0
|
2,9
|
0,9
|
9,4
|
0,5
|
14,2
|
|
2
|
3
|
1
|
3,6
|
0,9
|
9,4
|
0,5
|
14,2
|
|
3
|
0
|
0
|
2,3
|
0,5
|
9,4
|
0,3
|
14,2
|
|
3
|
0
|
1
|
3,8
|
0,9
|
10,4
|
0,5
|
15,7
|
|
3
|
0
|
2
|
6,4
|
1,6
|
18,1
|
1,0
|
25,0
|
|
3
|
1
|
0
|
4,3
|
0,9
|
18,1
|
0,5
|
25,0
|
|
3
|
1
|
1
|
7,5
|
1,7
|
19,9
|
1,1
|
27,0
|
|
3
|
1
|
2
|
12
|
3
|
36
|
2
|
44
|
|
3
|
1
|
3
|
16
|
3
|
38
|
2
|
52
|
|
3
|
2
|
0
|
9,3
|
1,8
|
36,0
|
1,2
|
43,0
|
|
3
|
2
|
1
|
15
|
3
|
38
|
2
|
52
|
|
3
|
2
|
2
|
21
|
3
|
40
|
2
|
56
|
|
3
|
2
|
3
|
29
|
9
|
99
|
5
|
152
|
|
3
|
3
|
0
|
24
|
4
|
99
|
5
|
152
|
|
3
|
3
|
1
|
46
|
9
|
198
|
5
|
283
|
|
3
|
3
|
2
|
110
|
20
|
400
|
10
|
570
|
|
3
|
3
|
3
|
> 110
|
|
|
|
|