"Рекомендации для фармацевтических компаний по изучению биотрансформации и транспортеров новых лекарственных средств: дизайн исследований, анализ данных и внесение информации в инструкции по применению" // Портал о здоровье, заболеваниях и лечении, о лекарствах, о докторах и больницах.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфефре

здравоохранения и

социального развития

Н.В.ЮРГЕЛЬ

5 февраля 2009 г.

РЕКОМЕНДАЦИИ

ДЛЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПАНИЙ ПО

ИЗУЧЕНИЮ БИОТРАНСФОРМАЦИИ И ТРАНСПОРТЕРОВ НОВЫХ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ: ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЙ, АНАЛИЗ

ДАННЫХ И ВНЕСЕНИЕ ИНФОРМАЦИИ В ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

Составитель:

Сычев Д.А. - д.м.н., главный научный сотрудник Института клинической фармакологии ФГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Росздравнадзора.

Научный редактор:

Кукес В.Г. - академик РАМН, д.м.н., профессор, директор Института клинической фармакологии ФГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Росздравнадзора.

Доложено на коллегии Министерства здравоохранения и социального развития 18 сентября 2008.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AUC - площадь под фармакокинетической кривой

BCRP - белок резистентности к раку молочной железы

Cmax - максимальная концентрация

CYP - цитохром Р-450

MRP - протеины, ассоциированные с множественной лекарственной устойчивостью

OAT - транспортеры органических анионов

ОСТ - транспортеры органических катионов

P-gp - гликопротеин-Р

Т1/2 - период полувыведения

Тmax - время наступления максимальной концентрации

ЛС - лекарственные средства

НЛР - нежелательные лекарственные реакции

ТКФС - типовая клинико-фармакологическая статья

I. ВВЕДЕНИЕ

Рекомендации переназначены для фармацевтических компаний, регистрирующих новые лекарственные средства (ЛС), которые проводят изучение их биотрансформации для оценки межлекарственного взаимодействия. Потребность в подобных исследованиях соответствует статье 16 Федерального закона о лекарственных средствах, регламентирующей содержание в инструкцию по применению ЛС данных о межлекарственном взаимодействии <*>. Это руководство отражает мнение экспертов Росздравнадзора, что пути биотрансформации нового ЛС должны быть изучены в ходе его разработки, и что его взаимодействия с другими ЛС на уровне биотрансформации должны исследоваться на предмет возможных клинических последствий в виде снижения эффективности или развития нежелательных лекарственных реакций (НЛР) при межлекарственном взаимодействии. Кроме того, следует отметить, что в последнее время стало известно, что межлекарственное взаимодействие может происходить на уровне транспортеров, участвующих в процессах всасывания, распределения и выведения. Поэтому в ходе разработки нового ЛС необходимо рассматривать возможность развития межлекарственного взаимодействия и на уровне транспортеров. Мнение о необходимости изучения биотрансофрмации и транспортеров новых ЛС основано на международном опыте снятия с регистрации ряда ЛС в связи с многочисленными случаями развития серьезных заболеваний, причиной которых являлись межлекарственные взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров. Подобные исследования по отношению к новым ЛС проводятся в США перед его регистрацией, поэтому целью представленных рекомендаций является также гармонизация российских требований к регистрации новых ЛС. Исследования биотрансофрмации и транспортеров необходимы для регистрации всех новых лекарственных средств, содержащих новую молекулу (для синтетических и иммунобиологических ЛС) или новые компоненты (для ЛС природного происхождения). Исследования биотрансформации и транспортеров необходимы для перерегистрации ЛС, если такие данные отсутствовали. Данные рекомендации гармонизированы с аналогичными рекомендациями FDA <**>.

--------------------------------

<*> Федеральный закон от 22 июня 1998 г. N 86-ФЗ "О лекарственных средствах" (с изменениями от 2 января 2000 г., 30 декабря 2001 г., 10 января, 30 июня 2003 г., 22 августа, 29 декабря 2004 г.).

<**> Drug Interaction Studies-Study Design, Data Analysis, and Implications for Dosing and Labeling. http://www.fda.gov/cder/guidance/6695dft.htm

II. ПРЕДПОСЫЛКИ

А. Биотрансформация

Известно, что эффективность и безопасность ЛС в большинстве случаев зависит от концентрации ЛС в области молекул-мишеней, которая чаще всего связана с концентрацией ЛС в плазме крови. В свою очередь, концентрация ЛС в плазме крови зависит от процессов всасывания, распределения и элиминации. Элиминация ЛС происходит путем биотрансформации (чаще всего в печени и/или слизистой кишечника), и/или экскреции ЛС (чаще почками с мочой и/или печенью с желчью). Кроме того, белковые ЛС могут элиминироваться вследствие специфического взаимодействия с клеточными поверхностными рецепторами, последующей интернализации и лизосомальной деградации в клетках-мишенях. Биотрансформация в печени происходит в основном при участии изоферментов цитохрома Р450 (CYP) в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов (I фаза биотрансформации), но может также происходить с участием ферментных систем, не связанных с Р-450, таких как N-ацетил- и глюкуронозилтрансферазы (II фаза биотрансформации). Многие факторы могут изменять биотрансформацию ЛС. К таким факторам относятся:

- наличие заболеваний;

- сопутствующее применение других ЛС;

- прием определенных пищевых продуктов, например, грейпфрутового сока;

- генетические особенности человека в виде носительства определенных аллельных вариантов гена фермента биотрансформации.

В то время как большинство факторов являются относительно стабильными, сопутствующее применение других ЛС может резко изменять биотрансформацию ЛС, а через нее и концентрацию ЛС в плазме крови, что может иметь клинические последствия в виде неэффективности ЛС (при снижении концентрации ЛС в плазме крови) или развитию НЛР (при повышении концентрации ЛС в плазме крови). Таким образом, сопутствующее применение других ЛС может быть опасным. Межлекарственное взаимодействие усложняется, если взаимодействующее ЛС является пролекарством или подвергается биотрансформации с образованием одного или более активных метаболитов. В этом случае эффективность и безопасность ЛС определяется не только действием исходного ЛС, но и действием активных метаболитов. Таким образом, адекватная оценка эффективности и безопасности ЛС включает описание его биотрансформации, а также вклада биотрансформации в процесс элиминации ЛС. По этой причине разработка высоко чувствительных и специфических методов определения концентрации ЛС и его важнейших метаболитов в биологических жидкостях (чаще всего в плазме крови) является особо важной для исследования путей его биотрансформации и межлекарственных взаимодействий на уровне биотрансформации.

Б. Межлекарственные взаимодействия

1. Межлекарственные взаимодействия на уровне биотрансформации

Многие реакции биотрансформации ЛС, осуществляемые изоферментами цитохрома Р-450, могут быть индуцированы или ингибированы при сопутствующим применением других ЛС. Это может приводить к увеличению или уменьшению концентрации ЛС или его метаболитов (включая активные или токсические метаболиты) в плазме крови, а, следовательно в области молекул-мишеней, что может приводить к изменению профиля эффективности и безопасности ЛС. Это имеет наибольшее клиническое значение при применении ЛС с узким терапевтическим диапазоном, однако также возможно и для ЛС с широким терапевтическим диапазоном (например, статины).

В ходе исследований межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации важно установить вероятность возникновения влияния изучаемого ЛС на биотрансформацию уже зарегистрированных и применяемых ЛС, совместное применение которых с ним наиболее вероятно в клинической практике. Также необходимо оценить вероятность возникновения влияния уже зарегистрированных и применяемых ЛС на биотрансформацию изучаемого ЛС. Следует отметить, что даже те ЛС, которые не подвергаются биотрансформации, могут оказывать влияние на биотрансформацию других ЛС. По этой причине межлекарственные взаимодействия на уровне биотрансформации должны исследоваться, даже если исследуемое ЛС не подвергается значительной биотрансформации.

Специфическая цель исследования межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации - это определить достаточно ли значимо взаимодействие для того, чтобы требовать изменения дозировки самого ЛС, или ЛС, с которыми он может быть использован, а также может ли взаимодействие потребовать дополнительного контроля за эффективностью и безопасностью включая терапевтический лекарственный мониторинг.

В некоторых случаях, понимание того, как изменять дозировку или режим дозирования при применении взаимодействующего ЛС, или того, каким образом можно избежать межлекарственных взаимодействий на уровне биотрансформации, может позволить вывести на рынок ЛС, применение которого в противном случае было бы связано с развитием серьезных НЛР. В редких случаях, высокая значимость межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации, вызванного ЛС, или степень изменения его биотрансформации под влиянием другого ЛС может привести к невозможности выпуска препарата на рынок по соображениям безопасности.

2. Межлекарственные взаимодействия на уровне транспортеров

К настоящему времени накоплено большое количество данных о существовании клинически значимых взаимодействий ЛС на уровне транспортеров. Примерами подобных взаимодействий могут служить ингибирование или индукция таких транспортеров как P-гликопротеин (P-gp), транспортеры органических анионов (ОАТ), полипептид, транспортирующий органические анионы (ОАТР), транспортеры органических катионов (ОСТ), протеины, ассоциированные с множественной лекарственной устойчивостью (MRP), а также белок резистентности к раку молочной железы (BCRP). Примеры взаимодействий на уровне транспортеров, включают взаимодействие между дигоксином и хинидином, фексофенадином и кетоконазолом (или эритромицином) и т.д. Из всех известных к настоящему моменту транспортеров, наиболее хорошо изученным является P-gp и оценка межлекарственного взаимодействия на его уровне может быть осуществлена в ходе разработки новых ЛС. Поэтому в представленных рекомендациях изложена методология изучения новых ЛС в качестве субстратов, ингибиторов и индукторов P-gp. Исследования транспортеров новых ЛС, и, особенно P-gp, не является в настоящее время обязательным, но желательно.

III. ОБЩИЕ СТРАТЕГИИ

Изучение биотрансформации и транспортеров ЛС должно соответствовать определенной последовательности. Сначала необходимо провести исследования in vitro. Если по данным исследования in vitro, ЛС окажется субстратом и/или ингибитором/индуктором изоферментов цитохрома Р-450 и/или транспортеров, затем, для подтверждения этих фактов, необходимо проведение исследований in vivo у человека <*>. Если ЛС, исходя из своих фармакологических эффектов, может часто применяться в комбинации с другими ЛС (например, в составе комбинированных схем лечения онкологических заболеваний, ВИЧ-инфекции, туберкулеза и т.д.), и возможно при этом межлекарственное взаимодействие на уровне биотрансформации и транспортеров, то необходимо проведение клинического исследования, для разработки тактики по изменению режимов дозирования ЛС или других вариантов ведения пациентов в подобных ситуациях.

--------------------------------

<*> Фитопрепараты рекомендуется изучать in vitro и in vivo только на предмет того являются они ингибиторами/индукторами изоферментов цитохрома Р-450 и/или транспортеров.

Если же информация о биотрансформации и транспортерах ЛС по результатам исследований in vivo и in vitro, стала известна уже после проведения клинических исследований ЛС, то рекомендуется ретроспективно проанализировать результаты этих клинических исследований на предмет выявления случаев межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров, что позволит выявить его клинические последствия, а также тактику по изменению режимов дозирования ЛС или других вариантов ведения пациентов в подобных ситуациях. В этих случаях проведение дополнительных клинических исследований не требуется.

А. Исследования in vitro

Взаимосвязь между результатами исследований биотрансформации и транспортеров ЛС in vitro и in vivo, до конца не выяснена. Тем не менее, исследования in vitro, могут служить скрининговым механизмом для исключения роли биотрансформации в фармакокинетике ЛС, а также ингибирующих/индуцирующих его свойств по отношению к изоферментам цитохрома Р-450. Эта возможность должна основываться на утвержденных экспериментальных методах и рациональном выборе концентраций изучаемого ЛС и взаимодействующего ЛС. Например, если соответствующие исследования in vitro в терапевтических концентрациях показывают, что изоизоферменты цитохрома Р-4501A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 или подсемейства CYP3A <*> не участвуют в биотрансформации изучаемого ЛС, не требуется проведения исследований in vivo для оценки влияния ингибиторов изофермента CYP2D6 или ингибиторов/индукторов изоизоферментов цитохрома Р-4501A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 и подсемейства CYP3A на элиминацию изучаемого ЛС.

--------------------------------

<*> Подсемейство CYP3A включает 3 изофермента: CYP3A4, CYP3A5 и CYP3A7. Последний, активен только в плодной печени и у детей до 1 года. CYP3A5 вносит больший вклад в биотрансформацию ЛС, чем CYP3A5. Однако, в связи с тем, что в большинстве случаев все три изофермента имеют одни и те же субстраты, ингибиторы и индукторы, данные полученные в исследованиях in vitro и in vivo, относятся суммарно ко всем трем изоферментам подсемейства CYP3A.

Сходным образом, если исследования in vitro показывают, что изучаемое ЛС не ингибирует изоизоферменты цитохрома Р-4501A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 или подсемейства CYP3A, не требуется проведения соответствующих исследований взаимодействия in vivo изучаемого ЛС и других ЛС, метаболизирующихся данными изоферментами. На рисунке 1 представлено "дерево" для принятия решения, в каких случаях показано проведение исследований взаимодействия in vivo, основываясь на данных исследования биотрансформации, ингибирования и индукции изоферментов цитохрома Р-450 in vitro.

Рисунок 1. "Дерево" для принятия решения, в каких

случаях показано проведение исследований взаимодействия

in vivo, после проведения исследования in vitro

┌────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Информация о биотрансформации ЛС in vitro │

│ (CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A) │

└────────────────────────────┬───────────────────────────┘

┌─────────────────────┬───────┴──────────┬────────────────┐

┌────────┴─────────┐ ┌─────────┴────────┐ ┌───────┴───────┐ ┌──────┴────────┐

│ По данным │ │ По данным │ │ Поданным │ │ Поданным │

│ исследований │ │ исследований │ │ исследований │ │ исследований │

│ in vitro ЛС не │ │ in vitro ЛС │ │ in vitro ЛС │ │in vitro ЛС не │

│ является │ │ является │ │ является │ │ является │

│ субстратом или │ │субстратом и вклад│ │ингибитором или│ │ ингибитором │

│ ЛС-субстрат, но │ │биотрансформации в│ │ индуктором │ │или индуктором │

│ биотрансформация │ │элиминацию данного│ │ │ │ │

│ не является │ │ ЛС не ясен │ │ │ │ │

│ основным путем │ │ │ │ │ │ │

│элиминации данного│ │ │ │ │ │ │

│ ЛС │ │ │ │ │ │ │

└────────┬─────────┘ └─────────┬────────┘ └───────┬───────┘ └──────┬────────┘

\/ \/ \/ \/

┌────────────────┐ ┌──────────────────┐ ┌───────────────┐ ┌───────────────┐

│ В инструкции к │ │ Провести │ │ Провести │ │В инструкции к │

│ применению ЛС │ │ исследования │ │ исследования │ │ применению ЛС │

│ указываются │ │in vivo с сильными│ │ in vivo с │ │ указываются │

│ данные, │ │ ингибиторами и │ │чувствительными│ │ данные, │

│ полученные в │ │ индукторами │ │ субстратами │ │ полученные в │

│ исследованиях │ │ │ │ │ │ исследованиях │

│ in vitro │ │ │ │ │ │ in vitro │

└────────────────┘ └─────────┬────────┘ └───────┬───────┘ └───────────────┘

┌─────────┴──────┐ ┌──────┴─────────┐

│Имеется значимое│ │Имеется значимое│

│взаимодействие? │ │взаимодействие? │

└────────────────┘ └────────────────┘

┌─────┐ ┌─────┐ ┌─────┐ ┌─────┐

│ Да │ │ Нет │ │ Да │ │ Нет │

└┬────┘ └─┬───┘ └─┬───┘ └────┬┘

\/ \/ \/ \/

┌───────────────┐ ┌────────────────┐ ┌──────────────┐ ┌───────────────────┐

│ Провести │ │ Дальнейшие │ │ Провести │ │ Дальнейшие │

│ клинические │ │ исследования │ │ клинические │ │ исследования не │

│исследования с │ │ не требуются │ │исследования с│ │ требуются │

│ другими │ └────────────────┘ │ другими │ └───────────────────┘

│ингибиторами/ │ ┌────────────────┐ │ субстратами │ ┌───────────────────┐

│ индукторами, │ │ В инструкции к │ │отобранными на│ │ В инструкции к │

│отобранными на │ │ применению ЛС │ │ основании │ │ применению ЛС │

│ основании │ │ указываются │ │ вероятности │ │указываются данные,│

│ вероятности │ │ данные, │ │ совместного │ │ полученные в │

│ совместного │ │ полученные в │ │ применения │ │ исследованиях │

│ применения │ │ исследованиях │ │ │ │in vitro и in vivo │

└───────┬───────┘ │ in vitro и │ └──────┬───────┘ └───────────────────┘

│ │ in vivo │ │ /\

┌──────┴───────┐ └────────────────┘ ┌──────┴───────┐ │

│ Требуется ли │ /\ │ Требуется ли │ │

│ Изменение │ │ │ Изменение │ │

│ дозировки? │ │ │ дозировки? │ │

└──────────────┘ │ └──────────────┘ │

┌─────┐ ┌─────┐ │ ┌─────┐ ┌─────┐ │

│ Да │ │ Нет ├────┘ │ Да │ │ Нет ├──────┘

└──┬──┘ └─────┘ └──┬──┘ └─────┘

│ │

\/ \/

┌───────────────┐ ┌───────────────┐

│ В инструкции к│ │В инструкции к │

│ применению ЛС │ │ применению ЛС │

│указывается как│ │указывается как│

│ должна быть │ │ должна быть │

│ изменена │ │ изменена │

│ дозировка ЛС │ │ дозировка ЛС │

└───────────────┘ └───────────────┘

До настоящего времени не было обнаружено индукторов фермента CYP2D6. Последние данные показали, что индукторы изоферментов подсемейства CYP3A, чаще всего являются и индукторами изоферментов подсемейств CYP2C, CYP2B и P-gp. Таким образом, для исследования вопроса, индуцирует ли изучаемое ЛС CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 и CYP3A, начальное исследование индукции in vitro может включать только CYP1A2 и CYP3A. Если исследования in vitro показывают, что исследуемый препарат не индуцирует изоферменты подсемейства CYP3A, не требуется проведения исследований взаимодействия in vivo на предмет изучения индуцирующих свойств изучаемого ЛС по отношению к изоферментам подсемейств CYP2C и CYP2B.

Большое значение имеют межлекарственные взаимодействия на уровне изофермента CYP2B6. При наличии показаний (возможность применения изучаемого ЛС с ЛС, метаболизирущимися CYP2B6 или его ингибиторами/индукторами), возможно проведение исследований in vitro по изучению роли CYP2B6 в биотрансформации изучаемого ЛС, а также возможных ингибирующих/индуцирующих свойств изучаемого ЛС по отношению к CYP2B6. Другие изоферменты цитохрома Р-450, включая CYP2A6 и CYP2E1, с меньшей вероятностью вовлекаются в клинически значимые взаимодействия, однако, при соответствующих показаниях (по аналогии с CYP2B6), также могут быть изучены.

В Приложении 1 описаны общие принципы проведения исследований биотрансформации in vitro. В частности, представлены принципы разработки эксперимента, анализа данных и интерпретации полученных результатов при определении роли изоферментов цитохрома Р-450 в биотрансформации изучаемого ЛС (изучаемое ЛС в качестве субстрата), ингибирования (изучаемое ЛС в качестве ингибитора), и индукции (изучаемое ЛС в качестве индуктора) изоферментов цитохрома Р-450.

B. Исследования in vivo

Кроме исследований биотрансформации и транспортеров ЛС in vitro, для подтверждения роли того или иного изофермента цитохрома Р-450/транспортера в биотрансформации изучаемого ЛС и/или ингибирующих/индуцирующих свойств изучаемого ЛС по отношению к тому или иному изоферменту цитохрома Р-450/транспортеру, необходимо проведения исследований in vivo. Эти исследования представляют собой фармакокинетические исследования соответствующего дизайна. Совместно с информацией, полученной в ходе исследований in vitro, исследования in vivo могут быть основным фундаментом разработки инструкции (или коррекции уже имеющейся) по применению ЛС, что может помочь избежать возникновения потребности в дальнейших клинических исследованиях. Дальнейшие рекомендации по исследованиям in vivo представлены в разделе IV данных рекомендаций.

IV. ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЙ БИОТРАНСФОРМАЦИИ И

ТРАНСПОРТЕРОВ IN VIVO

Исследование биотрансформации in vivo необходимо проводить после исследований in vitro в соответствии с алгоритмом, представленным на рисунке 1. В ходе следующего обсуждения термин субстрат используется для обозначения ЛС, в отношении которого проводится анализ для определения того, изменяется ли его фармакокинетика под влиянием другого ЛС (ингибитора/индуктора), называемого взаимодействующем ЛС. В зависимости от целей исследования, субстрат и взаимодействующее ЛС могут быть изучаемыми ЛС или одобренными ЛС ("маркерными" субстратами или "маркерными" ингибиторами/индукторами).

А. Дизайн исследования

Исследования межлекарственных взаимодействий на уровне биотрансформации in vivo обычно разработаны для проведения сравнения фармакокинетики ЛС-субстрата при наличии или отсутствии взаимодействующего ЛС. Рекомендуется выбрать один из двух вариантов дизайна исследования.

- I вариант дизайна: перекрестное исследование. Используется одна группа участников исследования. Участникам исследования однократно назначается ЛС-субстрат и проводится изучение его фармакокинетики, затем этой же группе в течение 8 дней назначается взаимодействующее ЛС (ингибитор/индуктор), после чего на 7-й день применения взаимодействующего ЛС (ингибитора/индуктора) повторно назначается ЛС-субстрат и повторно проводится изучение его фармакокинетики.

- II вариант: параллельный дизайн. Используются 2 группы участников исследования (основная и контрольная), сформированных путем рандомизации. Первой группе (основанная группа) в течение 8 дней назначается взаимодействующее ЛС (ингибитор/индуктор), после чего на 7-й день применения взаимодействующего ЛС (ингибитора/индуктора) однократно назначается ЛС-субстрат и проводится изучение его фармакокинетики. Второй группе (контрольная группа), которым не назначалось взаимодействующее ЛС (ингибитор/индуктор) однократно назначается ЛС-субстрат и проводится изучение его фармакокинетики.

При планировании исследований in vivo, должны также учитываться следующие положения:

- Следует отметить, что ЛС-субстратов с узким терапевтическим диапазоном, следует изучить влияние взаимодействующего ЛС (ингибитора/индуктора) не только на его фармакокинетику при однократном назначении, но и на его равновесную концентрацию при длительном применении. В этом случае можно также выбрать один из выше изложенных вариантов дизайна исследования in vivo. С тем отличием, что ЛС-субсбтрат будет применяться курсами до достижения равновесного состояния, после чего должна определяться равновесная концентрация ЛС-субстрата в плазме крови (максимальная и минимальная).

- Взаимодействующие ЛС (ингибиторы индукторы), должны дозироваться так, чтобы экспозиция этих препаратов соответствовала их клиническому применению, включая максимальные дозировки, которые должны быть использованы в исследовании in vivo.

- Если ЛС-субстрат является пролекарством или имеет активные метаболиты, то в исследовании in vivo необходимо изучать не только фармакокинетику самого ЛС, но и его активного метаболита.

- Исследования in vivo обычно могут быть открытыми, кроме случаев, когда "фармакодинамические" конечные точки (включая НЛР) являются важными для оценки межлекарственного взаимодействия.

- В случае если на всасывание взаимодействующего ЛС (ингибитора/индуктора) могут влиять различные факторы (например, pH желудка), может быть целесообразным определение равновесной концентрации (минимальной и максимальной) в плазме крови (обычно, не раньше чем через 5 периодов полувыведения ЛС).

- Во избежание расхождения результатов исследования вследствие бесконтрольного использования биологически активных добавок к пище (БАД), соков или других пищевых продуктов, которые могут повлиять на активность ферментов биотрансформации и транспортеров в ходе проведения исследования in vivo, важно исключить их использование в соответствующих случаях. Для этого в протоколе исследования in vivo необходимо указать предупреждения, например: "Участники будут исключаться из исследования по следующим причинам: использование ЛС, отпускаемых по рецепту или без рецепта, включая препараты растительного происхождения, или алкоголь в течение двух недель до включения в исследование" или "В течение, по крайней мере, двух недель до начала исследования и до момента окончания добровольцам не разрешается есть пищу или пить напитки, содержащие алкоголь, грейпфрут или грейпфрутовый сок, яблочный или апельсиновый сок, овощи из семейства крестоцветных (белокочанная капуста, брокколи, кресс-салат, кольраби, брюссельскую капусту, горчицу) и мясо-гриль".

В. Исследуемая популяция

Исследования биотрансформации in vivo, в большинстве случаев могут проводиться с участием здоровых добровольцев. Данные, полученные в этой популяции, могут позволить предсказать эффекты, которые могут быть получены в популяции пациентов, для применения у которых предназначено изучаемое ЛС. По соображениям безопасности в некоторых случаях здоровые добровольцы не могут принимать участие в исследовании in vivo, как при изучении противоопухолевых, психотропных ЛС и ЛС, применяемых при ВИЧ-инфекции. В этих случаях в исследованиях биотрансформации in vivo могут быть включены пациенты с соответствующими заболеваниями. При этом дополнительно появляется возможность изучать фармакодинамические конечные точки, отсутствующие при включении здоровых добровольцев. Минимальное количество участников исследования составляет 18 человек в случае перекрестного исследования и также как минимум по 18 человек в каждой из групп в случае параллельного дизайна исследования.

Определение у участников исследования in vivo генетических полиморфизмов ферментов, участвующих в биотрансформации, желательно при исследовании изоизоферментов цитохрома Р-4502D6, CYP2C19 и CYP2C9 т.к. степень лекарственного взаимодействия может быть различной в зависимости от генотипа по исследуемому изоферменту цитохрома Р-450. Эта информация может оказаться полезной для интерпретации полученных в ходе исследования in vivo результатов.

С. Выбор "маркерных" ЛС-субстрата и взаимодействующего ЛС

1. Изучаемое ЛС как ингибитор или индуктор

изоферментов цитохрома Р-450

При исследовании in vivo изучаемого ЛС в качестве взаимодействующего ЛС, выбор субстратов для исследований in vivo зависит от изоферментов Р450, на которые оказывало влияние изучаемое ЛС в исследовании in vitro. При исследовании ингибирующих свойств изучаемого ЛС, выбранное ЛС-субстрат должно быть тем ЛС, фармакокинетика которого значительно изменяется при совместном его применении с известными специфическими ингибиторами того или иного изофермента цитохрома Р-450 т.е. ЛС должно быть чувствительным субстратом, для которого было показано, AUC увеличиваются в 5 раз или более при одновременном введении с известным ингибитором того или иного изофермента цитохрома Р-450. Чувствительные субстраты, представленные в таблице 1 рекомендуется применять в исследованиях in vivo как "маркеры" т.е. по их фармакокинетике (при их приеме внутрь) оценивается активность того или иного изофермента цитохрома Р-450.

Таблица 1

Чувствительные субстраты, являющиеся "маркерами"

активности изоферментов цитохрома Р-450,

рекомендованные применять в исследованиях in vivo

Изофермент цитохрома Р-450	"Маркеры"
CYP1A2	Кофеин
CYP2C8	Репаглинид
CYP2C9	Толбутамид, диклофенак
CYP2C19	Омепразол
CYP2D6	Метопролол
CYP3A4 и другие изоферменты подсемейства CYP3A	Мидазолам, аторвастатин

В исследованиях in vivo для оценки ингибирующих/индуцирующих свойств изучаемого ЛС, для оценки активности изоферментов цитохрома Р-450 CYP2C9 и CYP3A4, может применяться не только изучение фармакокинетике, указанных в таблице 1, чувствительных субстратов, но и альтернативными методами. Для оценки активности CYP3A4 рекомендуется также использовать MEGX тест (см. Приложение 2А), тест с определением соотношения 6-бета-гидроксикортизола/кортизол в моче (см. Приложение 2В). Для оценки активности CYP2C9, также может использоваться тест с лозартаном (см. Приложение 2С).

Исследование in vivo определяет, что изучаемое ЛС либо ингибирует, либо индуцирует тот или иной изофермент цитохрома Р-450, рекомендуется проведение дополнительных исследований с использованием набора других ЛС-субстратов, которые наиболее вероятно будут применяться в клинической практике вместе с изучаемым ЛС. В случае же если Исследование in vivo дает отрицательный результат с чувствительными субстратами (таблица 1), можно предположить, что также не будет обнаружено влияния на менее чувствительные ЛС-субстраты, а значит, дополнительные исследования не требуются.

Если исследования in vivo, показали, что изучаемое ЛС является ингибитором того или иного изофермента цитохрома Р-450, то его следует отнести к одной из трех групп ингибиторов, что важно при внесении информации о возможном межлекарственном взаимодействии в инструкцию по применению ЛС (или ИКФС). Ингибиторы того или иного изофермента цитохрома Р-450 можно классифицировать на основании степени изменения AUC чувствительного субстрата ("маркера") при его применении внутрь:

- если изучаемое ЛС увеличивает AUC чувствительного субстрата при его применении внутрь в 5 раз или более, то оно может расцениваться как сильный ингибитор;

- если изучаемое ЛС увеличивает AUC чувствительного субстрата при его применении внутрь в более чем 2 раза, но менее чем в 5 раза, то оно может расцениваться, как умеренный ингибитор;

- если изучаемое ЛС увеличивает AUC чувствительного субстрата при его применении внутрь в более чем 1,25 раза, но менее чем в 2 раза, то оно может расцениваться как слабый ингибитор.

Отнесение изучаемого ЛС по данным исследования in vivo, к одной из трех групп ингибиторов, позволяет определить вероятность его взаимодействия с чувствительными субстратами и ЛС-субстратами с узким терапевтическим диапазоном (таблица 2), что должно найти отражение в инструкции по применению ЛС и ТКФС.

В исследованиях in vivo может применяться т.н. "коктейльный подход", при котором одновременно применяется несколько чувствительных субстратов ("маркеров") нескольких изоферментов цитохрома Р-450 в ходе одного исследования. Необходимым условием правильного дизайна подобного рода исследований является наличие следующих факторов:

1. Чувствительные субстраты ("маркеры") должны быть специфичны для изоферментов цитохрома Р-450;

2. между чувствительными субстратами не должно быть взаимодействий.

Отрицательные результаты "коктейльного" исследования in vivo могут исключить потребность в дальнейшем исследовании отдельных изоферментов цитохрома Р-450. Данные, полученные в ходе коктейльных исследований, могут дополнять данные, полученные в ходе других исследований in vitro и in vivo, оценивающих способность изучаемого ЛС ингибировать или индуцировать тот или иной изофермет цитохрома Р-450.

2. Изучаемое ЛС в качестве субстрата изоферментов

цитохрома Р-450

При исследовании in vivo изучаемого ЛС в качестве субстратам, выбор ингибиторов для исследований in vivo зависит от изоферментов Р450, которые по данным исследования in vitro метаболизирует изучаемое ЛС. При этом, для исследования in vivo, необходимо выбрать сильный ингибитор того или иного изофермента цитохрома Р-450, который будет являться "маркерным" ингибитором. В качестве "маркерных" ингибиторов может быть выбрано любое ЛС из таблицы 3. Например, если в исследовании in vitro было показано, что изучаемое ЛС подвергается биотрансформации при участии изоферментов подсемейства CYP3A, и их вклад в элиминацию ЛС либо значителен (> 25% от общего клиренса), либо неизвестен, в качестве ингибитора следует выбрать кетоконазол, так как он является сильным ингибитором CYP3A. Если результаты исследования in vivo отрицательны, тогда можно говорить о том, что было продемонстрировано отсутствие клинически значимого межлекарственного взаимодействия на уровни биотрансформации. Если исследование in vivo при использовании сильного ингибитора дало положительный результат, и спонсор желает определить, имеется ли взаимодействие между изучаемым ЛС и другими менее мощными ингибиторами, или дать рекомендацию по изменению дозирования, в большинстве случаев требуется проведение дальнейших клинических исследований (таблица 3). В случае если препарат подвергается биотрансформации при помощи того или иного изофермента цитохрома Р-450, и его AUC увеличивается в 5 раз и более под влиянием сильного ингибитора, то изучаемое ЛС считается, чувствительным субстратом для данного изофермента цитохрома Р-450. При этом, в инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо отметить, что ЛС является "чувствительным" субстратом для данного изофермента цитохрома Р-450 и его применение с сильными или умеренными ингибиторами приводит к повышению его концентрации в плазме крови и развитию НЛР. В случае если ЛС подвергается биотрансформации при помощи CYP3A, но не является чувствительным субстратом, однако его соотношение доза-ответ показывает, что даже незначительное увеличение концентрации ЛС в плазме крови при совместном применении с ингибиторами может привести к развитию серьезных НЛР (например, аритмия "torsade de pointes"), ЛС рассматривается как "субстрат того или иного изофермента цитохрома Р-450 с узким терапевтическим диапазоном" (таблица 2).

Если в исследовании in vivo с сильным ингибитором, изучаемое ЛС показало себя в качестве субстрата того или иного изофермента цитохрома Р-450, то его исследование с индуктором не требуется.

Таблица 2

Чувствительные субстраты и субстраты с узким

терапевтическим диапазоном изоферментов цитохрома Р-450

Изофермент цитохрома Р-450	Чувствительный субстрат	Субстрат с узким терапевтическим диапазоном
CYP1A2	Дулоксетин	Теофиллин, Тизанидин
CYP2C8	Репаглинид	Паклитаксел
CYP2C9	-	Варфарин, Фенитоин
CYP2C19	Омепразол	-
CYP2D6	-	Тиоридазин
CYP3A4	Будесонид, Буспирон, Эплренон, Элетриптан, Фелодипин, Флутиказон, Ловастатин, Мидозалам, Саквинавир, Силденафил, Симвастатин, Триазолам, Варденафил	Циклоспорин, Эрготамин, Фентанил, Пимозид, Хинидин, Сиролимус, Такролимус

В случае если применяемое внутрь ЛС является субстратом CYP3A и обладает низкой биодоступностью из-за значительной пресистемной элминиации, связанной с находящимся в ЖКТ CYP3A, грейпфрутовый сок, являясь ингибитором CYP3A, может оказать значительное влияние на концентрацию данного ЛС в плазме крови и повышать риск развития НЛР, что должно быть указано в инструкции по применению и ТКФС данного ЛС.

Если ЛС является одновременно субстратом CYP3A или P-gp, то совместное применение с ним препаратов зверобоя, приведет к снижению концентрации данного ЛС в плазме крови и снижению эффективности, что также должно быть отмечено в инструкции по применению и ТКФС данного ЛС.

Таблица 3

Сильные, умеренные и слабые ингибиторы

изоферментов цитохрома Р-450

Изофермент цитохрома Р-450	Сильные ингибиторы	Умеренные ингибиторы	Слабые ингибиторы
CYP1A2	Флувоксамин	Мекселитин, Пропафенон, Ципрофлоксацин	Ацикловир, Верапамил, Норфлоксацин, Фамотидин, Циметидин
CYP2C8	Гемфиброзил	-	Триметоприм
CYP2C9	-	Амиодарон, Флуконазол	Сульфинпиразон
CYP2C19	Омепразол	-	-
CYP2D6	Пароксетин, Флуоксетин, Хинидин	Дулоксетин, Тербинафин	Амиодарон, Сертралин
CYP3A	Атазанавир, Индинавир, Итраконазол, Кетоконазол, Кларитромицин, Нелфинавир, Ритонавир, Саквинавир, Телитромицин	Ампренавир, Верапамил Дилтиазем, Сок грейпфрута, Флуконазол, Фосампренавир, Эритромицин	Циметидин

3. Изучаемое ЛС в качестве ингибитора или

индуктора переносчика P-gp

При тестировании изучаемого ЛС в отношении способности ингибировать/индуцировать P-gp, может быть оправданным выбор фексофенадин в качестве субстрата P-gp.

4. Изучаемое ЛС в качестве субстрата переносчика P-gp

При тестировании изучаемого ЛС в качестве субстрата P-gp, рекомендуется использовать такой сильный ингибитор P-gp, как верапамил.

D. Путь введения

Для изучаемого ЛС путь введения обычно должен соответствовать планируемому для использования в клинике. Если разрабатываются как пероральный, так и парентеральный путь введения ЛС, то потребность в исследовании межлекарственного взаимодействия для нескольких путей введения, чаще всего перорального и парентерального, зависит от наличия у изучаемого ЛС эффекта первого прохождения, который может быть связан с активностью изоферментов цитохрома Р-450 стенки и транспортеров кишечника. Если для изучаемого ЛС в качестве субстрата, характерен эффект первого прохождения через печень, то необходимо изучение межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров как при его пероральном, так и парентеральном введении. Для ЛС-субстратов и взаимодействующих ЛС (ингибиторов/индукторов), использующихся в качестве "маркеров", путь введения будет зависеть от доступных на рынке форм выпуска данных ЛС, хотя и предпочтительным является пероральный путь.

E. Выбор дозировки

Исследование in vivo должно способствовать максимальной вероятности обнаружения межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров, как для субстрата (изучаемого ЛС или "маркера"), так и для взаимодействующего ЛС (ингибитора/индуктора) (изучаемого ЛС или "маркерного" ингибитора). По этой причине мы рекомендуем использовать максимальную планируемую или одобренную дозировку и наиболее короткий интервал между введением последующих дозировок ЛС (в качестве ингибиторов или индукторов). Например, при использовании кетоконазола в качестве ингибитора CYP3A дозировка 400 мг в день является более предпочтительной по сравнению с более низкими дозировками. В некоторых случаях, из соображений безопасности для ЛС-субстратов могут быть рекомендованы более низкие дозы, чем те, которые используются в клинике. В таких случаях, любые ограничения чувствительности исследования in vivo для обнаружения межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров вследствие использования более низких дозировок должны обсуждаться спонсором в протоколе и отчете об исследовании.

F. Конечные точки

Изменения фармакокинетических параметров могут быть использованы для оценки клинической значимости межлекарственных взаимодействий на уровне биотрансформации и транспортеров. Интерпретация результатов, полученных в ходе этих исследований, будет облегчаться, если они будут дополнены изучением изменения фармакодинамики ЛС, если это возможно. Примером могут служить измерение МНО (при исследовании взаимодействия варфарина с другими ЛС на уровне биотрансформации).

1. Фармакокинетические конечные точки

В ходе каждого исследования in vivo должны быть получены следующие фармакокинетические параметры ЛС-субстрата (изучаемого ЛС или "маркера"): площадь под фармакокинетической кривой, AUC, максимальная концентрация (Cmax), время достижения Cmax (Tmax), общий клиренс, объем распределения и периоды полувыведения (T1/2). В некоторых случаях эти параметры также могут быть интересны и для взаимодействующего ЛС (ингибитора/индуктора), особенно в случаях, если в исследовании оцениваются возможные влияния на оба исследуемых ЛС. Дополнительные измерения могут помочь в исследованиях равновесного состояния (например, минимальная и максимальная равновесная концентрация) для демонстрации того, что стратегии дозирования были адекватно подобраны для достижения состояния, близкого к равновесному, до и во время взаимодействия (см. раздел IV А "Дизайн исследования"). Частота забора образцов должна быть адекватной для обеспечения точного определения соответствующих фармакокинетических показателей самого ЛС и его активных метаболитов (при их наличии). Для ЛС-субстрата, вне зависимости от того, является ли он изучаемым ЛС или "маркером", важным является определение активных метаболитов (при их наличии).

2. Фармакодинамические конечные точки

Фармакокинетические показатели обычно являются достаточными для исследований межлекарственного взаимодействия на уровне биотрансформации и транспортеров, хотя фармакодинамические показатели могут иногда дать полезную дополнительную информацию. Определение фармакодинамических показателей показано, если взаимосвязь фармакокинетики и фармакодинамики для интересующих конечных точек ЛС-субстрата не выяснена, или если фармакодинамические изменения происходят не только вследствие фармакокинетических, но и фармакодинамических взаимодействий (например, аддитивное влияние хинидина и трициклических антидепрессантов на интервал QT).

G. Размеры образца и статистические расчеты

Статистическая значимость различий фармакокинетических и фармакодинамических параметров ЛС-субстрата (изучаемого ЛС или "маркера") до и после взаимодействия должная быть оценена с помощью непараметрических статистических методов т.к. в большинстве случаев полученные данные не соответствуют нормальному распределению. В случае, сели исследование in vivo было перекрестным, рекомендуется использовать парный критерий Вилкоксона, а при параллельном дизайне - метод Манна-Уитни. Различия необходимо расценивать как статически значимые при p < 0,05.

V. ВНЕСЕНИЕ ИНФОРМАЦИИ О РЕЗУЛЬТАТАХ ИССЛЕДОВАНИЙ

IN VIVO И IN VITRO В ИНСТРУКЦИЮ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЛС И ТКФС

Очень важно, чтобы вся информация, полученная в результате исследований биотрансформации и транспортеров in vitro и in vivo была отражена в инструкции по применению ЛС и ТКФС.

Информация, о результатах исследований in vitro и in vivo, в которых изучаемое ЛС выступало в качестве субстрата должна быть размещена в разделе "Фармакокинетика" (таблица 4).

Таблица 4

Формулировка информации о результатах исследований

in vitro и in vivo, в которых изучаемое ЛС выступало

в качестве субстрата, для раздела "Фармакокинетика"

инструкции по применению ЛС или ТКФС

Результат исследования in vitro	Результат исследования in vivo	Формулировка
ЛС не является субстратом	Не проводилось	"В исследовании in vitro показано, что ЛС не является субстратом изоферментов цитохрома Р-450 (рекомендуется перечислить каких)"
Является субстратом определенного изофермента цитохрома Р-450	Не является субстратом изофермента цитохрома Р-450 для которого в исследовании in vivo был получен положительный результат	"В исследовании in vitro показано, что ЛС является субстратом данного изофермента цитохрома Р-450 (указывается какого), однако в исследовании in vivo, обнаружено что данный изофермент цитохрома Р-450 не вносит значительного вклада в биотрансформацию ЛС"
Является субстратом определенного изофермента цитохрома Р-450	Является субстратом определенного изофермента цитохрома Р-450	"В исследовании in vitro показано, что ЛС является субстратом данного цитохрома Р-450 (указывается какого) и в исследовании in vivo подтверждено, что ЛС в значительной степени метаболизируется данным изоферментом цитохрома Р-450"

Если в результате исследований in vitro и in vivo обнаружено, что изучаемое ЛС является "чувствительным" субстратом или ЛС-субстратом с узким терапевтическим диапазоном того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в разделе "Взаимодействие" инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо указать, что его применение с сильными или умеренными ингибиторами приводит к повышению его концентрации в плазме крови и развитию НЛР. При этом необходимо перечислить ЛС, относящиеся к сильным и умеренным ингибиторам данного изофермента цитохрома Р-450 (таблица 3), список которых эксперты Росздравнадзора должны обновлять ежегодно, внося изменения в инструкции по применению ЛС и ТКФС при очередной регистрации ЛС. В этом разделе также необходимо указать, что применение ЛС, являющегося "чувствительным" субстратом, или ЛС-субстратом с узким терапевтическим диапазоном того или иного изофермента цитохрома Р-450, с индукторами данного изофермента, может приводить к снижению его концентрации и ослаблению фармакологических эффектов.

Если в результате исследований in vitro и in vivo обнаружено, что изучаемое ЛС является сильным или умеренным ингибитором того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в разделе "Взаимодействие" инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо указать, что его применение с ЛС, являющимися "чувствительными" субстратами или ЛС-субстратом с узким терапевтическим диапазоном (таблица 2), приводит к повышению концентрации этих ЛС в плазме крови и развитию НЛР. При этом необходимо перечислить ЛС, относящиеся к "чувствительным" субстратам и ЛС-субстратам с узким терапевтическим диапазоном данного изофермента цитохрома Р-450 (таблица 2). Так же необходимо указать потенциальную возможность повышать концентрацию других ЛС-субстратов данного изофермента при их совместном применении, без перечисления конкретных ЛС. Если изучаемое ЛС по результатам исследований in vitro и in vivo показало себя как слабый ингибитор того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в инструкции по применению ЛС и ТКФС в разделе "Взаимодействие" необходимо указать этот факт, а также потенциальную возможность повышать концентрацию ЛС-субстратов данного изофермента при их совместном применении без перечисления конкретных ЛС.

Если в результате исследований in vitro и in vivo обнаружено, что изучаемое ЛС является индуктором того или иного изофермента цитохрома Р-450, то в разделе "Взаимодействие" инструкции по применению ЛС и ТКФС необходимо указать, что его применение с ЛС, являющимися "чувствительными" субстратами и ЛС-субстратами с узким терапевтическим диапазоном (таблица 2), приводит к снижению концентрации этих ЛС в плазме крови и ослаблению фармакологических эффектов.

Список сильных и умеренных ингибиторов, а также "чувствительных" субстратов и ЛС-субстратов с узким терапевтическим диапазоном изоферментов цитохрома Р-450 (таблицы 2, 3) эксперты Росздравнадзора должны обновлять ежегодно, в соответствие с чем, при очередной перерегистрации ЛС должны вноситься изменения в инструкции по применению ЛС и ТКФС.

Информация, относящаяся к клиническим последствиям (развитие НЛР или ослабление фармакологических эффектов), не должна помещаться с детальным описанием более чем в один раздел инструкции по применению ЛС и ТКФС. В случае если в результате исследований in vivo разработаны рекомендации по изменению дозирования изучаемого ЛС, противопоказания или предупреждения (например, избегать совместного введения), эта информация должна быть размещена в соответствующих разделах инструкции по применению ЛС и ТКФС: "Режим дозирования", "Противопоказания" и "Особые указания". Аналогичным образом вносится информация в инструкции по применению ЛС и ТКФС и по результатам исследований in vivo и in vitro транспортеров, и, в частности P-gp.

Приложение N 1

МЕТОДОЛОГИЯ

ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОТРАНСФОРМАЦИИ И

ТРАНСПОРТЕРОВ ЛС IN VITRO

А. Идентификация фермента, участвующего в биотрансформации ЛС in vitro

Исследования для идентификации фермента, участвующего в метаболической трансформации препарата, часто называемые исследованиями фенотипирования реакции, представляют собой набор экспериментов, которые определяют специфические ферменты, ответственные за биотрансформацию ЛС. В окислительных и гидролитических реакциях принимают участие ферменты семейства цитохрома P-450 (CYP) и ферменты, не относящиеся к CYP. Эффективным подходом является определение метаболического профиля (определение образовавшихся метаболитов и их количественной значимости) ЛС, и оценка относительного вклада изоферментов цитохрома Р-450 в клиренс перед началом исследований для определения специфических изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС. Идентификация изоферментов цитохрома Р-450 обоснована, если изоферменты цитохрома Р-450 вносят вклад в более чем 25% общего клиренса ЛС. Идентификация in vitro изоферментов цитохрома Р-450, подвергающих ЛС биотрансформации и, помогает предсказать потенциал для межлекарственных взаимодействий in vivo, влияние активности полиморфных ферментов на распределение препарата и формирование токсических или активных метаболитов. Существует небольшое количество документально зарегистрированных случаев клинически значимых межлекарственных взаимодействий, связанных с ферментами, не относящимися к CYP, но идентификация ферментов этого типа, подвергающих препарат биотрансформации (т.е. глюкозуронилтрансфераз, сульфотрансфераз и N-ацетилтрансфераз) приветствуется. Несмотря на то, что классические исследования биотрансформации не являются общим требованием при исследовании терапевтических биопрепаратов, определенные белковые препараты модифицируют биотрансформацию ЛС, в которой участвуют изоферменты цитохрома Р-450.

1. Эксперименты по идентификации пути биотрансформации (определение метаболического профиля)

(a) Обоснование и цели

Данные, полученные в ходе исследований по идентификации пути биотрансформации ЛС in vitro, помогают определить, обосновано ли проведение экспериментов для определения ферментов, участвующих в биотрансформации ЛС, и позволяют разработать соответствующий дизайн любых таких экспериментов. Эксперименты по идентификации пути биотрансформации должны оценивать количество и классы метаболитов, образующихся из ЛС, а также параллельность или последовательность путей биотрансформации.

(b) Выбор ткани для экспериментов по идентификации пути биотрансформации

Человеческие ткани, включая свежеизолированные гепатоциты, замороженные гепатоциты и свежеизолированные срезы печени, обеспечивают клеточную целостность в отношении ферментной архитектуры и содержат полный набор ферментов, участвующих в метаболической трансформации лекарственных препаратов. Субклеточные фракции ткани печени, фракции, которые включают микросомы, S9, цитозоль (добавление соответствующих ко-факторов при необходимости) или рекомбинантные ферменты могут использоваться в комбинации с упомянутыми выше тканями для идентификации образующихся из конкретного препарата метаболитов и классов вовлеченных в процесс ферментов.

Одна из методик идентификации пути биотрансформации - инкубация препарата с гепатоцитами или срезами печени с последующим хроматографическим анализом инкубационной среды и внутриклеточного содержимого при помощи тандемной масс-спектрометрии (ТМСМ). Этот тип экспериментов приводит к прямой идентификации метаболитов, образовавшихся в ходе окислительных, гидролитических и реакций II фазы биотрансформации, и обеспечивает получение информации, касающейся параллельности или последовательности путей метаболической трансформации. Другая методика - анализ инкубационной среды при помощи ТМСМ с использованием УФ, флуоресцентного или радиохимического обнаружения.

В свете известной множественности и перекрывающейся специфичности ферментов, участвующих в биотрансформации ЛС, в отношении субстратов, а также возможности наличия либо параллельных, либо последовательных путей метаболической трансформации, эксперименты должны включать несколько концентраций препарата с различным временем инкубации. Ожидаемые равновесные концентрации препарата в плазме in vivo могут быть полезными для определения диапазона концентраций препарата, использующихся для этих экспериментов.

(d) Системы и условия исследования in vitro

Методы, перечисленные в Таблице 5, могут использоваться для идентификации окислительных путей, связанных и не связанных с CYP, ответственных за образование наблюдающихся метаболитов.

Таблица 5

Методы идентификации путей биотрансформации ЛС

Система in vitro	Условие	Тесты
микросомы	+/- NADPH	CYP, FMO против других оксидаз
микросомы, гепатоциты	+/- 1 - аминобензотриазол	инактиватор CYP широкой специфичности
Микросомы	предшествующая обработка температурой 45 град. C	инактивирует FMO
S-9	+/- паргилин	инактиватор MAO широкого спектра
S-9, цитозоль	+/- менадион, аллопуринол	ингибиторы Mo-CO (оксидаза)

2. Исследования, разработанные для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Если данные исследований in vivo у человека показывают, что изоферменты цитохрома Р-450 вносят вклад более чем в 25% клиренса препарата, необходимо проведение исследований in vitro для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации препарата. Эта рекомендация включает случаи, при которых за окислительной биотрансформацией следуют реакции конъюгации, так как межлекарственное взаимодействие, которое ингибирует окисление исходного ЛС, может привести к повышенным уровням исходного ЛС.

(а) Общие экспериментальные методы для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Существует три хорошо охарактеризованных метода для идентификации отдельных изоферментов цитохрома Р-450, ответственных за биотрансформацию ЛС. Соответственно, эти методы используют:

- специфические химические вещества или антитела в качестве ингибиторов фермента;

- индивидуальные человеческие рекомбинантные изоферменты цитохрома Р-450;

- банк человеческих микросом печени, охарактеризованных по активности CYP, приготовленных из отдельных печеней доноров.

Мы рекомендуем проводить, по крайней мере, два из трех методов для идентификации специфических ферментов, ответственных за биотрансформацию ЛС. Для первой группы методов могут использоваться либо объединенные микросомы печени человека, либо микросомы, приготовленные из печени отдельных доноров. Для корреляционного анализа третьей группы методов, должен использоваться банк охарактеризованных микросом из отдельных донорских печеней.

Там, где это возможно, эксперименты для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, ответственных за биотрансформацию ЛС, должны проводиться с концентрациями ЛС, предполагающимися подходящими по результатам фармакокинетических экспериментов. Эксперименты по идентификации ферментов должны проводиться при начальных условиях скорости (линейность скорости продукции метаболитов по отношению к времени и концентрации ферментов). В некоторых случаях эксперименты проводятся при нелинейных условиях вследствие аналитической чувствительности; результаты таких экспериментов должны интерпретироваться с осторожностью. Таким образом, для количественного определения каждого метаболита, образующегося под воздействием отдельных изоферментов цитохрома Р-450, выбранных для идентификации, должны быть разработаны надежные аналитические методы, основанные на надежной научной базе. Для рацемических препаратов изомеры должны исследоваться раздельно.

(b) Использование специфических химических ингибиторов для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Большинство химических ингибиторов не абсолютно специфичны для конкретных изоферментов цитохрома Р-450, однако ценной характеристикой химических ингибиторов является их коммерческая доступность. Несмотря на отсутствие комплексности, химические ингибиторы, перечисленные в Таблице 6, могут быть использованы для идентификации отдельных изоферментов цитохрома Р-450, ответственных за биотрансформацию препарата, а также для определения относительного вклада отдельных изоферментов цитохрома Р-450.

Таблица 6

Химические ингибиторы изоферментов цитохрома Р-450

для исследований in vitro

┌─────────────┬───────────────────┬──────────┬──────────────────┬─────────┐

│ Изофермент │ Предпочтительный │ Ki │ Приемлемый │ Ki │

│ цитохрома │ ингибитор │ (мюM) │ ингибитор │ (мюM) │

│ Р-450 │ │ │ │ │

├─────────────┼───────────────────┼──────────┼──────────────────┼─────────┤

│ CYP1A2 │фурафиллин │ 0,6-0,73 │альфа-нафтовлавон │ 0,01 │

│ CYP2А6 │транилципромин │ 0,02-0,2 │пилокарпин │ 4 │

│ │метоксален │ 0,01-0,2 │триптамин │ 1,7 │

│ CYP2B6 │ - │ - │сертралин │ 3,2 │

│ │ │ │фенциклидин │ 10 │

│ │ │ │тиотепа │ 4,8 │

│ │ │ │клопидогрел │ 0,5 │

│ │ │ │тиклопидин │ 0,2 │

│ CYP2C8 │монтелукаст │ 1,1 │триметоприм │ 32 │

│ │кверцетин │ 1,1 │гемфиброзил │ 69-75 │

│ │ │ │росиглитазон │ 5,6 │

│ │ │ │пиоглитазон │ 1,7 │

│ CYP2C9 │сульфафеназол │ 0,3 │флуконазол │ 7 │

│ │ │ │флувоксамин │ 6,4-19 │

│ │ │ │флуоксетин │ 18-41 │

│ CYP2C19 │ - │ - │тиклопидин │ 1,2 │

│ │ │ │ноткатон │ 0,5 │

│ CYP2D6 │хинидин │0,027-0,4 │- │ - │

│ CYP2E1 │ - │ - │клометиазол │ 12 │

│ │ │ │диаллилдисульфид │ 150 │

│ CYP3A4 │кетоконазол │ 0,0037- │тролеандомицин │ 17 │

│ │итраконазол │ 0,18 │верапамил │ 10-24 │

│ │ │ 0,27-2,3 │ │ │

└─────────────┴───────────────────┴──────────┴──────────────────┴─────────┘

(c) Использование рекомбинантных ферментов для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

В случае если препарат подвергается биотрансформации под воздействием только одного рекомбинантного человеческого фермента CYP, интерпретация результатов проводится относительно прямолинейно. Однако, в случае если в процесс вовлечено более одного рекомбинантного фермента CYP, измерение активности фермента по отдельности обеспечит получение информации о вкладе отдельных путей в биотрансформацию ЛС.

Рекомбинантные изоферменты цитохрома Р-450 не присутствуют в исходном окружении и часто гиперэкспрессируются. Дополнительные белки (NADPH-CYP редуктаза и цитохром b5) или состав липидов мембраны могут отличаться от нативных микросом. Имеются данные о нескольких методах количественного масштабирования полученной метаболической активности при использовании рекомбинантных изоферментов цитохрома Р-450 для определения активности, ожидаемой для микросом печени человека. Эти техники могут помочь в определении относительного вклада каждого из ферментов в общем образовании метаболитов, но могут не отражать абсолютные скорости их формирования в микросомах печени человека in vitro.

(d) Использование специфических антител для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Ингибирующий эффект антитела должен тестироваться при достаточно низких и высоких концентрациях для получения титрационной кривой. Если в биотрансформации препарата вовлечен только один изофермент цитохрома Р-450, ингибирование более 80% ожидается в наборе объединенных (pooled) или индивидуальных микросом. Если степень ингибирования мала, сложно определить, является ли частичное ингибирование результатом вовлечения других изоферментов цитохрома Р-450 в метаболическую трансформацию препарата, или антитело обладает слабым действием.

(e) Использование корреляционных анализов для идентификации изоферментов цитохрома Р-450, участвующих в биотрансформации ЛС

Эта методика опирается на статистический анализ для определения корреляции между скоростью продукции отдельного метаболита и активностями, определенными для каждого изофермента цитохрома Р-450 в наборе микросом, приготовленных из печени отдельных доноров.

Набор охарактеризованных микросом должен включать микросомы, приготовленные, по крайней мере, из 10 отдельных печеней доноров. Вариация метаболической активности для каждого изофермента цитохрома Р-450 должна быть достаточной между отдельными донорскими печенями, для того, чтобы обеспечить адекватную статистическую силу. Активность ферментов в наборе микросом, использованных для корреляционных исследований, должна определяться с использованием подходящих субстратов-образцов и экспериментальных условий.

Результаты сомнительны, если одна удаленная точка определяет коэффициент корреляции. В случае если линия регрессии не проходит через исходную точку или около исходной точки, это может говорить о вовлечении нескольких изоферментов цитохрома Р-450 или отражать наследственную нечувствительность набора микросом.

В. Оценка ингибирования изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

Препарат, который ингибирует специфический фермент, участвующий в биотрансформации ЛС, может снизить метаболический клиренс совместно вводимого препарата, который является субстратом ингибированного пути метаболической трансформации. Следствием снижения метаболического клиренса является повышение концентрации в крови совместно вводимого препарата, что может привести к развитию НЛР или усилению терапевтических эффектов. С другой стороны, ингибированный путь биотрансформации может также приводить к снижению образования активного метаболита совместно вводимого препарата, приводя к снижению эффективности этого препарата.

1. Маркерные субстраты

Эксперименты in vitro, проводимые для определения, способности препарата ингибировать конкретный изофермент цитохрома Р-450, включают инкубацию препарата с маркерными субстратами для изоферментов цитохрома Р-450.

Существует два научных критерия для выбора маркерного субстрата:

- субстрат должен быть селективным (преимущественно подвергаться биотрансформации под воздействием одного фермента объединенных микросом человеческой печени или рекомбинантными ферментами Р-450;

- субстрат должен обладать простой метаболической схемой (в идеальном случае с отсутствием последовательной биотрансформации).

Существуют также некоторые практические критерии - коммерческая доступность субстрата и метаболита(ов); количественные анализы, которые являются чувствительными, быстрыми и простыми; и приемлемое время инкубации.

Предпочтительные субстраты, перечисленные в Таблице 7, соответствуют большинству критериев, перечисленных выше, и считаются научным сообществом приемлемыми.

Таблица 7

Предпочтительные и приемлемые химические субстраты

для экспериментов in vitro

┌──────────┬─────────────────────┬────────┬──────────────────────┬────────┐

│Изофермент│ Предпочтительный │ Ki │ Приемлемый субстрат │ Ki │

│цитохрома │ субстрат │ (мюM) │ │ (мюM) │

│ Р-450 │ │ │ │ │

├──────────┼─────────────────────┼────────┼──────────────────────┼────────┤

│CYP1A2 │О-деэтилированный │1,7-152 │N-деметилированный │280-1230│

│ │метаболит фенацетина;│ │метаболит теофиллина; │ │

│ │ │ │3-N-деметилированный │220-1565│

│ │ │ │метаболит коефина │ │

│CYP2A6 │7-гидроксилированный │0,3-2,3 │ - │ - │

│ │метаболит кумарина │ │ │ │

│CYP2B6 │Гидроксилированный │ 17-23 │Гидроксилированный │ 3,7-94 │

│ │метаболит эфаиренца; │ │метаболит пропофола; │ │

│ │Гидроксилированный │ 67-168 │N-деметилированный │ 1910 │

│ │метаболит бупропиона │ │метаболит │ │

│ │ │ │S-мефенетоина │ │

│CYP2C8 │6-гидроксилированный │ 5,4-19 │Пара- │4,3-7,7 │

│ │метаболит таксола │ │гидроксилированный │ │

│ │ │ │метаболит │ │

│ │ │ │розиглитазона │ │

│CYP2C9 │Метил- │ 67-838 │4'-гидроксилированный │ 6-42 │

│ │гидроксилированный │ │метаболит │ │

│ │метаболит │ │флубипрофена; │11,5-117│

│ │толбутамида; │ │4-гидроксилированный │ │

│ │7-гидроксилированный │1,5-4,5 │метаболит фенитоина │ │

│ │метаболит │ │ │ │

│ │S-варфарина; │ │ │ │

│ │4'-гидроксилированный│ 3,4-52 │ │ │

│ │метаболит диклофенак │ │ │ │

│CYP2C19 │4'-гидроксилированный│ 13-35 │5-гидроксилированный │ 17-26 │

│ │метаболит │ │метаболит омепразола; │ │

│ │S-мефенитоина │ │О-делкилированный │3,7-104 │

│ │ │ │метаболит флуоксетина │ │

│CYP2D6 │О-деметилированный │0,44-8,5│4-гидроксилированный │ 5,6 │

│ │метаболит │ │метаболит дебризохина │ │

│ │декстраметорфана │ │ │ │

│CYP2E1 │6-гидроксилированный │ 39-157 │4-гидроксилированный │ 6,3-24 │

│ │метаболит │ │метаболит анилина │ │

│ │хлороксазона │ │ │ │

│CYP3A4, │1-гидроксилированный │ 1-14 │N-деметилированный │ 33-88 │

│CYP3A5 │метаболит мидазолама;│ │метаболит │ │

│ │6-бета │ 52-94 │эритромицина; │ │

│ │гидроксилированный │ │4-гидроксилированный │ 234 │

│ │метаболит │ │метаболит триазолама │ │

│ │тестостерона │ │ │ │

└──────────┴─────────────────────┴────────┴──────────────────────┴────────┘

2. Соображения относительно дизайна исследований ингибирования изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

(a) Типичные эксперименты для определения значений IC50 включают инкубацию субстрата, если скорость метаболизма является достаточной, в концентрациях ниже его Km для того, чтобы более тесно связать IC50 ингибитора с Ki. Для определения Ki, как концентрация субстрата, так и концентрация ингибитора, должны варьировать для того, чтобы покрыть диапазоны выше и ниже Km препарата и Ki ингибитора.

(b) Обычно используются концентрации микросомальных белков ниже 1 мг/мл.

(c) Так как сила буфера, его тип и pH могут значительно повлиять на Vmax и Km, рекомендуется использование стандартизированных условий для количественного анализа.

(d) В ходе исследования не должно возникать истощения субстрата или ингибитора более чем на 10-30%. Однако, для субстратов с низкой Km, может оказаться сложным избежать более чем 10% истощения субстрата при низких концентрациях субстрата.

(e) Мы предлагаем использовать линейную зависимость между временем и количеством образовавшегося продукта.

(f) Мы рекомендуем использовать линейную зависимость между количеством фермента и количеством образовавшегося продукта.

(g) Любые растворители могут использоваться в низких концентрациях (< 1% (об./об.) и предпочтительно < 0.1%). Некоторые растворители ингибируют или индуцируют ферменты. Эксперимент может включать контроль с отсутствием растворителя и с растворителем.

(h) Возможно использование активного контроля (известный ингибитор).

3. Определение того, является ли новая молекулярная субстанция обратимым ингибитором

Теоретически, значительное ингибирование фермента возникает тогда, когда концентрация имеющегося ингибитора в активном центре сопоставима с Ki или превышает Ki. Теоретически, степень взаимодействия (R, выраженная в виде кратности изменения AUC) может быть получена из следующего уравнения: R = 1 + [I]/Ki, где [I] - это концентрация ингибитора, воздействующего на активный центр фермента, а Ki - константа ингибирования.

Хотя соотношение [I]/Ki используется для предсказания вероятности ингибирующих лекарственных взаимодействий, существуют факторы, которые влияют на выбор подходящих [I] и Ki. Факторы, которые влияют на [I], включают неопределенность в отношении концентрации, которая наилучшим образом представляет концентрацию в области связывания фермента (ферменты, расположенные в желудочно-кишечном тракте против печеночных ферментов) и неопределенность в отношении влияния пресистемного воздействия. Факторы, которые влияют на Ki, включают специфичность субстрата, связывание с компонентами инкубационной системы и истощение субстрата и ингибитора.

Текущий рекомендуемый подход

Вероятность взаимодействия in vitro прогнозируется на основании соотношения [I]/Ki, где [I] представляет собой среднее равновесное значение Cmax для общего количества препарата (связанного и несвязанного) после введения наиболее высокой предполагаемой клинической дозировки. С увеличением соотношения возрастает вероятность взаимодействия. В нижеследующей таблице предложены вероятности взаимодействия in vivo на основании оценочных соотношений [I]/Ki. Предполагаемое соотношение [I]/Ki более 0,1 считается положительным, и рекомендуется последующее исследование in vivo.

Таблица 8

Предсказание клинической значимости конкурентного

ингибирования CYP

[I]/Ki	предсказание
[I]/Ki > 1	вероятно
1 > [I]/Ki > 0,1	возможно
0,1 > [I]/Ki	маловероятно

Несмотря на то, что количественные предсказания межлекарственных взаимодействий in vivo при проведении исследований in vitro не возможны, ранжирование активности различных изоферментов цитохрома Р-450 для одного препарата может помочь расставить приоритеты для оценки межлекарственных взаимодействий in vivo. При получении различных соотношений [I]/Ki для основных изоферментов цитохрома Р-450 (CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP3A), уместно начать проведение исследований in vivo, начиная с CYP, характеризующегося наибольшим соотношением [I]/Ki (или наименьшей Ki).

В случае если CYP с наибольшим соотношением [I]/Ki (или наибольшей Ki) не обнаруживает взаимодействия in vivo, не потребуется проведения исследований in vivo с другими CYP с более низким соотношением [I]/Ki (или большей Ki). Для ингибирования CYP3A необходимо оценивать два структурно не связанных субстрата. В случае если одно из двух исследований позволяет предположить наличие потенциального взаимодействия (т.е. [I]/Ki более 0,1), необходимо проведение исследования in vivo.

4. Определение того, является ли новая молекулярная субстанция ингибитором, основанным на определенном механизме

Зависимое от времени ингибирование должно исследоваться в ходе стандартных скрининговых протоколов in vitro, так как этот феномен не может быть предсказан с полной достоверностью на основании химической структуры. Рекомендуется проведение 30-минутной преинкубации потенциального ингибитора перед добавлением субстрата. Любая зависимая от времени или концентрации, а также потеря скорости формирования продукта указывает на ингибирование, основанное на определенном механизме. Для соединений, содержащих амины, формирование промежуточного метаболического комплекса может быть прослежено спектроскопически. Обнаружение зависимой от времени кинетики ингибирования in vitro указывает на необходимость проведения последующих исследований у людей in vivo.

С. Оценка индукции изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

Препарат, который индуцирует фермент, подвергающий биотрансформации другой препарат, может увеличить скорость метаболического клиренса совместно вводимого препарата, если он является субстратом индуцируемого пути биотрансформации. Потенциальным последствием такого типа межлекарственного взаимодействия становится снижение концентрации препарата в крови до субтерапевтической. С другой стороны, индуцированный путь биотрансформации может привести к усилению образования активного вещества, приводя к возникновению побочных эффектов.

1. Химические индукторы в качестве положительного контроля

При исследовании способности препарата индуцировать определенный изофермент цитохрома Р-450, эксперимент должен включать приемлемый индуктор фермента в качестве контроля. Примеры таких индукторов перечислены в Таблице 9. Использование положительного контроля объясняется вариабельностью каталитической ферментной активности в препаратах гепатоцитов различных доноров. Вещества, используемые в качестве положительного контроля, должны быть мощными индукторами (более чем 2-кратное увеличение активности фермента в отношении маркерного субстрата при концентрации индуктора менее 500 мюM).

Таблица 9

Химические индукторы для экспериментов in vitro

┌──────────┬────────────────┬────────────┬─────────┬────────────┬─────────┬───────┐

│Изофермент│Предпочтительный│Концентрации│Кратность│ Приемлемый │Концен- │Крат- │

│цитохрома │ индуктор │ индуктора │индукции │ индуктор │трации │ность │

│ Р-450 │ │ (мюM) │ │ │индуктора│индук- │

│ │ │ │ │ │(мюM) │ции │

├──────────┼────────────────┼────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┤

│CYP1A2 │Омепразол │ 25-100 │ 14-24 │Лансопразол │ 10 │ 10 │

│ │Бета- │ │ │ │ │ │

│ │нафтофлавон; │ 33-50 │ 4-23 │ │ │ │

│ │3-метилхолантрен│ 1,2 │ 6-26 │ │ │ │

│CYP2A6 │дексаметазон │ 50 │ 9,4 │Пиразол │ 1000 │ 7,7 │

│CYP2B6 │фенобарбитал │ 500-1000 │ 5-10 │Фенитоин │ 50 │ 5-10 │

│CYP2C8 │рифампин │ 10 │ 2-4 │Фенобарбитал│ 500 │ 2-3 │

│CYP2C9 │рифампин │ 10 │ 3,7 │Фенобарбитал│ 100 │ 2,6 │

│YP2C19 C│рифампин │ 10 │ 20 │- │ - │ - │

│CYP2D6 │Не │ - │ - │- │ - │ - │

│ │идентифицировано│ │ │ │ │ │

│CYP2E1 │Не │ - │ - │- │ - │ - │

│ │идентифицировано│ │ │ │ │ │

│CYP3A4 │рифампин │ 10-50 │ 4-31 │Фенобарбитал│1000-2000│ 3-31 │

│ │ │ │ │Фенитоин │ 50 │ 12,5 │

│ │ │ │ │Таксол │ 4 │ 5,2 │

│ │ │ │ │Дексаметазон│ 33-250 │2,9-6,9│

└──────────┴────────────────┴────────────┴─────────┴────────────┴─────────┴───────┘

2. Дизайн исследований лекарственной индукции in vitro

В настоящее время наиболее надежным методом исследования способности препарата индуцировать ферменты является количественная оценка ферментативной активности в первичных культурах гепатоцитов после терапии, включающей потенциальный препарат-индуктор, препарат-индуктор в качестве положительного контроля (таблица 9) и гепатоциты, обработанные средой (отрицательный контроль), соответственно. Свежевыделенные человеческие гепатоциты или замороженные гепатоциты, которые можно размораживать и выращивать в культуре, являются предпочтительной тканью печени для этих исследований; иммортализованные клетки печени приемлемы, если при помощи положительного контроля можно показать, что в этой линии могут быть индуцированы CYP3A4 и CYP1A2.

(a) Концентрации тестового препарата должны основываться на концентрациях препарата в плазме человека, ожидаемых при использовании в клинике. Должны исследоваться как минимум три концентрации, попадающие в терапевтический диапазон, включая, по крайней мере, одну концентрацию, которая на порядок превышает среднюю ожидаемую концентрацию препарата в плазме. В случае если эта информация недоступна, должны быть исследованы концентрации в диапазоне двух порядков.

(b) После воздействия на гепатоциты в течение от 2 до 3 дней результирующие активности ферментов могут быть определены при помощи соответствующих маркерных препаратов, специфичных для изоферментов цитохрома Р-450 (таблица 7). Для мониторинга вызванных препаратом изменений ферментов могут использоваться либо монослои из цельных клеток, либо изолированные микросомы; однако, использование первой ткани является наиболее простым и наиболее прямым методом.

(c) При использовании свежевыделенных человеческих или замороженных гепатоцитов для исследования индукции, эксперименты должны проводиться с гепатоцитами, выделенными, по крайней мере, из трех разных донорских печеней вследствие различий индукционного потенциала внутри одного организма.

(d) При использовании иммортализованных клеток печени человека эксперименты по исследованию индукции должны проводиться троекратно.

3. Конечные точки для последующего предсказания индукции ферментов

При анализе результатов экспериментов для определения способности препарата индуцировать ферментативную активность, уместны следующие соображения.

(a) Препарат, который вызывает изменение, которое равно или превышает 40% положительного контроля, может рассматриваться в качестве положительного индуктора фермента in vitro, обосновано проведение исследования in vivo.

% положительного контроля = ((активность клеток, обработанных тестовым препаратом - активность отрицательного контроля) x 100)/(активность положительного контроля - активность отрицательного контроля)

(b) Альтернативная конечная точка - использование значения EC50 (эффективная концентрация, при которой наблюдается 50% индукция), которое представляет собой индекс активности, который может быть использован для сравнения активности различных веществ.

(c) Основываясь на современных знаниях о клеточных механизмах, ведущих к индукции фермента CYP, если исследования индукции с тестовым препаратом подтверждают, что вещество не является индуктором CYP3A4, можно сделать заключение, что тестовый препарат также не является индуктором CYP2C8, CYP2C9 или CYP2C19.

4. Другие методы, предложенные для идентификации индукции изоферментов цитохрома Р-450 in vitro

Несмотря на то, что наиболее надежным методом количественного определения индукционного потенциала препарата является измерение ферментативной активности после инкубации препарата в первичных культурах человеческих гепатоцитов, исследуются также другие методы. Некоторые из этих методов кратко описаны ниже.

(а) Western immunoblot или иммунопреципитация со специфическими поликлональными антителами.

Относительный количественный анализ определенного изофермента Р-450 требует, чтобы электрофоретическая система четко расщепляла отдельные ферменты и/или чтобы первичные антитела были специфичны для исследуемого количественно фермента. Препараты антител к ферментам отличаются высокой степенью вариабельности.

(b) Измерение уровней мРНК при помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). RT-PCR может количественно определить экспрессию мРНК для специфического изофермента цитохрома Р-450, но не обязательно является информативной в отношении ферментативной активности. Измерение уровней мРНК является полезным, в случае если наблюдается как ингибирование фермента, так и его индукция.

Были идентифицированы клеточные рецепторы, регулирующие индукцию изоферментов цитохрома Р-4501A, CYP2B и CYP3A. Разработаны наборы для количественного анализа связывания высокопроизводительного ароматического углеводородного рецептора и прегнан X рецептора и наборы для клеточного анализа репортерного гена, которые используются для скрининга соединений, которые обладают индукционным потенциалом в отношении CYP1A и CYP3A. Хотя результаты этих анализов обеспечивают данные, подтверждающие индукционный потенциал соединения, они не всегда отражают активность фермента.

Приложение N 2

МЕТОДОЛОГИЯ

ПРОВЕДЕНИЯ ПРОБ ДЛЯ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ИЗОФЕРМЕНТОВ

ЦИТОХРОМА Р-450 IN VIVO

A. Методика проведения пробы для оценки активности

CYP3A4- MEGX-тест

Суть теста заключается в определении в плазме крови концентрации моноэтилглицинксилидида (МЕGX), который является метаболитом лидокаина, образующийся под действием CYP3A4, после внутривенного введения данного препарата. MEGX-тест проводится следующим образом. Перед введением лидокаина производится забор крови из периферической или центральной вены - 0 минута. Введение лидокаина осуществляется в течение 1-2 минут внутривенно в дозе 1 мг/кг, разведенном в 5-10 мл физиологического раствора. Через 15 и 30 минут после введения лидокаина осуществляют забор крови из вен отличных от места введения данного ЛС. Пробы отбирают в стеклянные или пластмассовые центрифужные пробирки, центрифугируют 10 минут при 3000 об./мин., плазму переносят в пластиковые пробирки и если определение MEGX не планируется сразу же после проведения процедуры отбора, то пробы замораживают и хранят при температуре не выше -20 град. C. Перед измерением замороженному материалу дают максимально оттаять при комнатной температуре и тщательно перемешивают. Повторное размораживание проб не желательно, так как это может повлиять на результат измерения. Определение концентрации MEGX проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на флюориметрическом детекторе или иммуноферментным методом на приборе Tdx с помощью специальных коммерческих наборов.

B. Методика проведения пробы для оценки активности

CYP3A4 по соотношению 6-бета-гидроксикортизол/кортизол

в моче

Оценка активности CYP3A4 может определяться по отношению концентрации 6-бета-гидроксикортизола к концентрации кортизола (6-бета-гидроксикортизол/кортизол) в утренней моче т.к. 6-бета-гидроксикортизол образуется из кортизола исключительно под действием CYP3A4. Вся моча во время утреннего туалета собирается в отдельную емкость, затем из нее перемещается в пластмассовую пробирку, допускается замораживание мочи. Также преимуществом теста является возможность сбора материала (мочи) в домашних условиях. Концентрации 6-бета-гидроксикортизола и кортизола в моче определяется методом хромато-масс-спектрометрического анализа на высокоэффективном жидкостном хроматографе, что является главным недостатком теста т.к. делает его дорогим. Низкие значения отношения 6-бета-гидроксикортизол/кортизол соответствует низкой активности CYP3A4, а высокие значения отношения 6-бета-гидроксикортизол/кортизол - высокой активности CYP3A4.

С. Методика проведения пробы для оценки активности

CYP2C9 - лозартановый тест

Тест основан на том, что лозартан метаболизруется преимущественно под влиянием CYP2C9 до активного метаболита Е-3174. Тест проводят следующим образом. Утром натощак назначают 50 мг лозартана, с этого времени в течение 8 часов собирают мочу, моча собирается в отдельную емкость, затем из нее перемещается в пластмассовую пробирку, допускается замораживание мочи. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии определяются концентрации лозаратана и Е-3174 в моче, рассчитывается отношение Е-3174/лозартан. Низкие значения отношения Е-3174/лозартан соответствует низкой активности CYP2С9, а высокие значения отношения Е-3174/лозартан - высокой активности CYP2С9.