Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

24 июня 2011 года

 

Дата введения:

с момента утверждения

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER

В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

 

ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ 1 К МУК 4.2.2321-08

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2878-11

 

1. Разработаны Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания, ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" при участии фирмы "BioMerieux".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24.06.2011.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

 

Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2321-08:

1. Раздел 1 "Общие положения и область применения" дополнить абзацем 1.3 следующего содержания:

"1.3. Настоящие Методические указания устанавливают методы определения бактерий рода Campylobacter в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения на основе бактериологического анализа (качественного и количественного с идентификацией до вида), а также фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов C. jejuni, C. coli, C. lari, обусловливающих основную часть ОКИ кампилобактериозной природы у человека)".

2. Раздел 2 "Сущность метода" изложить в новой редакции:

 

"2. Сущность методов

 

2.1. Бактериологический метод определения бактерий рода Campylobacter основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к видам бактерий рода Campylobacter.

2.2. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, меченных щелочной фосфатазой, и флюоресцентно-меченого субстрата и измерении флюоресценции продукта гидролиза флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата), который катализируется щелочной фосфатазой. Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм.

2.2.1. Для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферона при 450 нм, и тест-наборы, в состав которых входят сенсибилизированные антителами наконечники, используемые в качестве пипетирующего устройства, и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа, зарегистрированные в РФ в установленном порядке. Предел обнаружения бактерий рода Campylobacter при использовании данного метода соответствует 1 клетке на 25 г (при наличии предобогащения).

2.2.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют анализаторы иммуноферментные и тест-наборы, зарегистрированные в РФ в установленном порядке и обеспечивающие проведение измерений с характеристиками специфичности и чувствительности, указанными в п. п. 1.3 и 2.2.1".

3. В разделе 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" пункт 3.1 "Аппаратура и инструментарий" дополнить строкой:

 

Автоматический ИФА-анализатор для

фермент-связанного флюоресцентного

иммуноанализа типа VIDAS(R) или

miniVIDAS(R), или с аналогичными

характеристиками, подобный BioMerieux,

Франция, или аналог.

 

4. В разделе 3 пункт 3.2 "Лабораторная посуда и материалы" дополнить строками:

 

Пакет для гомогенизации с фильтром, подобный

BioMerieux, Франция, или аналог

Набор реагентов для определения бактерий рода

Campylobacter типа VIDAS(R) Campylobacter (CAM)

или с аналогичными характеристиками, подобный

BioMerieux, Франция, или аналог.

 

5. Раздел 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" дополнить пунктом 3.5 в следующей редакции:

 

"3.5. Состав тест-набора для фермент-связанного

флюоресцентного иммуноанализа

 

В состав тест-набора входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов, состоящий из следующих компонентов:

 

30 стрипов для определения    бактерий рода  Campylobacter	STR	Готовы к использованию
30 наконечников	SPR	Готовы к использованию. На внутреннюю       поверхность наконечников нанесены антитела  к поверхностным антигенам Campylobacter
Стандарт       (1 фл. по 6 мл)	S1	Готов к использованию. Очищенный и инактиви- рованный антиген Campylobacter + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный     интервал указан на калибровочной карте
Положительный  контроль       определения    (1 фл. по 6 мл)	C1	Готов к использованию. Очищенный и инактиви- рованный антиген Campylobacter + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный     интервал указан на калибровочной карте
Отрицательный  контроль       определения    (1 фл. по 6 мл)	C2	Готов к использованию. Забуференный         физиологический раствор - твин + консервант. Максимальное приемлемое значение указано на калибровочной карте
1 калибровочная    карта		Лист спецификаций с фабричными установками  для калибровки тестов
1 инструкция

 

3.5.1. Состав стрипа для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Каждый стрип в тест-наборе состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа. Распределение лунок в стрипе:

 

Лунка	Реактивы
1	Лунка для внесения образца: внесите 0,5 куб. см     бульона обогащения (обогащенной культуры), стандарта или контроля
2	Предпромывочный буфер (400 куб. мм): забуференный   физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л) pH 7,6 + консервант
3 - 4 - 5 - 7 - 8 - 9	Промывочный буфер (600 куб. мм): забуференный       физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л) pH 7,6 + консервант
6	Конъюгат (400 куб. мм): антитела (IgG) к            Campylobacter, меченные щелочной фосфатазой +       консервант
10	Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм):          4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 М/л) + диэтаноламин (0,62 М/л или 6,6%, pH 9,2) + консервант

 

3.5.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа допускается использование другого оборудования и тест-наборов аналогичного назначения, зарегистрированных в РФ в установленном порядке, с аналогичными характеристиками чувствительности и специфичности".

6. Раздел 4 "Подготовка к анализу" дополнить пунктом 4.3 в следующей редакции:

 

"4.3. Требования к выполнению фермент-связанного

флюоресцентного иммуноанализа

 

4.3.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:

- не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;

- не использовать поврежденные стрипы;

- не использовать набор по истечении срока годности;

- не смешивать реактивы из различных партий;

- пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;

- анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

Тест-набор содержит едкий реактив диэтаноламин, а также натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления.

4.3.2. Требования к квалификации специалистов

Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

4.3.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:

- температура окружающего воздуха (20 +/- 5) °С;

- атмосферное давление (97 +/- 10) кПа;

- относительная влажность (65 +/- 15)%".

7. Раздел 7 дополнить пунктом 7.3 в следующей редакции:

 

"7.3. Проведение фермент-связанного

флюоресцентного иммуноанализа

 

7.3.1. Подготовка анализатора к работе:

- Перед использованием реактивов новой партии в анализатор вводят (автоматически или вручную) спецификации реактивов, используя калибровочную карту, входящую в каждый набор. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов.

- Для каждой новой партии реактивов проводят калибровку прибора, используя стандарт, входящий в состав набора. Калибровку проводят после ввода данных партии, но не реже одного раза в 14 дней. Для этого в отдельные стрипы вносят по 0,5 куб. см реактива C1, C2 и в два стрипа реактив S1 из тест-набора. Необходимо ввести информацию об образце и контролях в анализатор для создания рабочего листа. Установить стрипы и наконечники в анализатор и запустить программу.

Эта операция необходима для построения точной калибровочной кривой и компенсации вариаций, которые могут возникнуть при хранении набора. Стандарт S1 необходимо тестировать в двукратной повторности согласно руководству по эксплуатации прибора. Результаты должны находиться в пределах установленного диапазона, указанного на калибровочной карте. Если результат не соответствует диапазону, следует повторить калибровку.

7.3.2. Подготовка образцов к фермент-связанному флюоресцентному иммуноанализу

Отобрать в пробирку 1 - 2 куб. см бульона обогащения, инкубированного по п. 7.1 МУК 4.2.2321-08, закрыть и нагревать на водяной бане (15 +/- 1) мин. при 95 - 100 °С. Охладить 10 мин., перемешать и внести 0,5 куб. см в стрип из тест-набора.

Оставшуюся часть бульона хранят в холодильнике при 2 - 4 °С для подтверждения положительных образцов.

7.3.3. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин.

Для каждого анализа используется 1 стрип и 1 наконечник из тест-набора. В открытую лунку стрипа вносят 0,5 куб. см термостатированного образца по п. 7.3.2. Далее стрипы и наконечники устанавливают в анализатор, вводят название соответствующих образцов и запускают анализ. Время анализа приблизительно 70 мин.

7.3.4. Интерпретация результатов

Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:

 

[Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта]

 

Результат теста	Интерпретация
< 0,1	Отрицательный
>= 0,1	Положительный

 

Результат теста со значением меньше порогового указывает на то, что образец не содержит антигена Campylobacter либо содержит его в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением, равным или больше порогового, свидетельствует о том, что образец загрязнен бактериями рода Campylobacter. В этом случае следует провести подтверждение положительного результата по п. 7.3.5.

Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту.

На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация.

7.3.5. Подтверждение положительного результата

Подтверждение положительного результата проводят путем высева 0,1 мл хранившегося в холодильнике бульона обогащения, полученного по п. 7.3.2, на поверхность одной из селективных сред (по п. 4.2.2). Инкубацию образцов проводят при температуре (42 +/- 1) °С в течение 20 - 24 ч, при отсутствии роста инкубировать еще 24 ч.

При наличии характерных колоний необходимо провести идентификацию до 5 подозрительных колоний на принадлежность к бактериям рода Campylobacter по п. 8.1.

При получении противоречивых результатов (положительных альтернативным методом, не подтвержденных стандартным методом) для проверки следует использовать дополнительные методы".